CN114196728A - 一种石油烃降解菌丰度的测定方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种石油烃降解菌丰度的测定方法，该方法包括：S1、使用缓冲溶液对油污土壤进行预处理，获得含有石油烃降解菌的待测菌悬液；S2、用DNA染色工作液对所述待测菌悬液中的活菌和死菌进行恒温避光染色，获得染色后的待测菌悬液；S3、借助流式细胞仪对染色后的待测菌悬液中的石油烃降解菌进行计数，获得石油烃降解菌的丰度值。本发明通过借助DNA荧光染色技术，将流式细胞仪用于石油烃降解菌丰度的测定，有效提升了石油烃降解菌丰度测定的精确度，减小误差。
Description
技术领域
本发明涉及石油污染环境监测技术领域，特别涉及一种石油烃降解菌丰度的测定方法。
背景技术
石油烃降解菌在生物修复石油污染水体和土壤中发挥着关键的作用。通过烃降解菌生长发育过程中的新陈代谢活动对有毒有害的烃类物质进行降解，达到降低污染物浓度及毒性的目的。利用石油烃降解菌修复污染场地具有投资和运行成本低、操作简便、无二次污染、对污染场地土壤扰动小、工程量小等优点。而对石油烃降解菌的丰度进行准确测定，是评估石油烃降解菌修复石油污染水体或土壤效果的重要指标。
但现有技术中，目前多采用平板菌落计数，显微镜直接计数，分光光度法或者最大可能计数方法来测定石油烃降解菌的丰度，这四种方法都需要人工统计，耗时长，估算精度低，误差大，费时费力。
发明内容
为解决上述问题，本发明提供一种石油烃降解菌丰度的测定方法。针对土壤组成的复杂性，以解决现有技术中，对石油烃降解菌丰度确定存在精确度低，误差大的问题。
具体内容如下：
本发明提供了一种石油烃降解菌丰度的测定方法，其特征在于，所述方法包括：
S1、对油污土壤进行预处理，获得含有石油烃降解菌的待测菌悬液；
S2、用DNA染色工作液对待测菌悬液中的活菌和死菌进行恒温避光染色；获得染色后的待测菌悬液；
S3、借助流式细胞仪对染色后的待测菌悬液中的石油烃降解菌进行计数，获得石油烃降解菌的丰度值。
可选地，在所述步骤1中，所述预处理包括：
S11、将0.1g～1g油污土壤与1mL～10mL缓冲溶液的混合物进行3h振荡、离心、第一次过滤，获得土壤菌悬液；
S12、向土壤菌悬液中加入0.01g～0.1g石油，振荡培养7d，离心，获得待测菌，并用15mL缓冲溶液对待测菌进行1-3次离心清洗，最后向待测菌中加入20mL缓冲溶液，进行第二次过滤后，获得含有石油烃降解菌的待测菌悬液。
可选地，所述第一次过滤为定性滤纸过滤。
可选地，所述第二次过滤为5μm滤膜过滤。
可选地，所述缓冲溶液为：PBS缓冲溶液或pH＝7.4的Tris-HCl缓冲溶液。
可选地，在所述步骤2中，所述DNA染色工作液由0.22μm尼龙膜过滤后的二甲基亚砜、SYBR Green I染料和PI染料组成；
其中，所述二甲基亚砜、所述SYBR Green I染料和所述PI染料的体积比为79：1：20。
可选地，在所述步骤2中，所述DNA染色工作液与所述染色后的待测菌悬液的体积比为1：40。
可选地，在所述步骤2中，所述恒温避光染色的工作温度为35℃，工作时间为15min。
可选地，在所述步骤2中，所述恒温避光染色在恒温金属浴中进行。
可选地，在所述步骤3中，所述流式细胞仪的工作流速为1000-1500events/μl。
相较于现有技术，本发明提供的一种石油烃降解菌丰度的测定方法存在如下优点：
本发明提供了一种测定石油烃降解菌丰度的方法，通过借助DNA荧光染色技术，将流式细胞仪用于石油烃降解菌丰度的测定，有效提升了石油烃降解菌丰度测定的精确度，减小误差。同时，本发明的方法操作简单，耗时短，节省人力物力。
此外，本发明改进了油污土壤的预处理方式，通过用缓冲溶液(PBS或Tris-HCl)替代无菌水来提取和培养油污土壤中的石油烃降解菌，能够提取到更多的石油烃降解菌，为准确测定土壤中的石油烃降解菌丰度奠定了基础。
附图说明
为了更清楚地说明本申请实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1示出了本发明实施例提供的一种石油烃降解菌丰度的测定方法的流程图；
图2示出了本发明实施例提供的预处理流程图；
图3示出了本发明实施例PBS处理的土壤样品阴性对照组中石油烃降解菌的PE-A和FITC-A的散点图；
图4示出了本发明实施例PBS处理的土壤样品测试组中的石油烃降解菌的PE-A和FITC-A的散点图；
图5示出了本发明实施例Tris-HCl处理的土壤样品阴性对照组中石油烃降解菌的PE-A和FITC-A的散点图；
图6示出了本发明实施例Tris-HCl处理的土壤样品测试组中的石油烃降解菌的PE-A和FITC-A的散点图；
图7示出了本发明实施例人工配制油污土壤样品阴性对照组中石油烃降解菌的PE-A和FITC-A的散点图；
图8示出了本发明实施例人工配制油污土壤样品测试组中的石油烃降解菌的PE-A和FITC-A的散点图；
图9示出了经分光光度法和流式细胞术测定不同污染程度的土壤中的石油烃降解菌的丰度线性相关图。
具体实施方式
提供下述实施例是为了更好地进一步理解本发明，并不局限于所述最佳实施方式，不对本发明的内容和保护范围构成限制，任何人在本发明的启示下或是将本发明与其他现有技术的特征进行组合而得出的任何与本发明相同或相近似的产品，均落在本发明的保护范围之内。
实施例中未注明具体实验步骤或者条件，按照本领域内的现有技术所描述的常规实验步骤的操作或条件即可进行。所用试剂以及其他仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规试剂产品。
为了准确获得石油污染水体或土壤中石油烃降解菌的丰度值，实现精准评估石油烃降解菌对石油污染水体或土壤的修复效果，本发明提出的技术构思为：通过借助DNA荧光染色技术，将流式细胞仪用于石油烃降解菌丰度的测定。具体地，由DNA染色工作液对待测菌悬液中的活菌和死菌进行恒温避光染色，根据染色后的石油烃降解菌在流式细胞仪中显示出的荧光信号来确定油污土壤样品中石油烃降解菌的丰度。该方法操作简便，方法灵敏度、准确度高。
基于上述技术构思，本发明提供了一种石油烃降解菌丰度的测定方法，图1示出了本发明实施例提供的一种测定石油烃降解菌丰度的方法的流程图，如图1所示，该方法包括：
S1、使用缓冲溶液对油污土壤进行预处理，获得含有石油烃降解菌的待测菌悬液；
S2、用DNA染色工作液对待测菌悬液中的活菌和死菌进行恒温避光染色，获得染色后的待测菌悬液；
S3、借助流式细胞仪对染色后的待测菌悬液中的石油烃降解菌进行计数，获得石油烃降解菌的丰度值。
在一些实施方式中，本实施例首先通过用缓冲溶液(PBS或Tris-HCl)替代无菌水来提取和培养油污土壤中的石油烃降解菌，使得油污土壤中的石油烃降解菌在提取过程中，能够最大程度保持细胞活性，最终获得含有更多石油烃降解菌的待测菌悬液，为准确测定土壤中的石油烃降解菌丰度奠定了基础。
进一步地，向提取到的待测土壤样品微生物中，加入原油进行驯化获得石油烃降解菌，制备待测菌悬液。利用DNA染色工作液对待测菌悬液中的活菌和死菌进行恒温避光染色，以使石油烃降解菌能在后续流式细胞术测定石油烃降解菌丰度过程中显示出不同的荧光信号，以未染色的菌悬液为阴性对照，根据不同的荧光信号圈定流式细胞仪检测到的活菌和死菌区域，进而准确获得石油烃降解菌丰度。其中，流式细胞术测定石油烃降解菌丰度的技术为：以未染色的菌悬液为阴性对照，分别以PI/SG作为死细胞/活细胞的染色剂，在流式散点图中圈定凋亡细胞和活性降解菌的区域，根据染色样品的PE-A和FITC-A散点图计算出油污土壤样品中石油烃降解菌的丰度。
在一些实施方式中，借助流式细胞仪对染色后的待测菌悬液中的石油烃降解菌进行计数的方式可以如下所示：
将待测菌悬液用超纯水稀释，以确保测定过程中样品流速大约为1000events/μL。在CFlow Plus分析软件中建立PE-A/FITC-A散点图，以未染色的测菌悬液为阴性对照，通过“门(Gate)”的设定将样品中活菌和死菌进行分开，根据染色样品的流式散点图即可以计算出油污土壤样品中石油烃降解菌的丰度。
图2示出了本发明实施例提供的预处理流程图，该预处理过程包括：
S11、将0.1g～1g油污土壤与1mL～10mL缓冲溶液的混合物进行3h振荡、离心、第一次过滤，获得土壤菌悬液；
S12、向土壤菌悬液中加入0.01g～0.1g石油，振荡培养7d，离心，获得待测菌，并用15mL缓冲溶液对待测菌进行1-3次离心清洗，最后向待测菌中加入20mL缓冲溶液，进行第二次过滤后，获得含有石油烃降解菌的待测菌悬液。
在一些实施方式中，预处理过程以如下所示：
称取0.1～1g待测油污土壤，置于50mL锥形瓶中，向瓶内加入1～10mL 0.1M pH＝7.4的Tris-HCl缓冲溶液；在30℃、180r/min的条件下振荡3h,1000～2000g离心1～2min后，经定性滤纸过滤获得土壤菌悬液；向菌悬液中加入0.01～0.1g石油，在30℃、140r/min的条件下振荡培养7d后，4000～5000g离心3～6min，倒掉上清液，加入15mL灭菌的PBS缓冲溶液，4000～5000g离心3～6min，倒掉上清液，重复三次；最后加入20mL灭菌的PBS缓冲溶液，并用5μm滤膜过滤后，作为待测菌悬液。
在一些实施方式中，第一次过滤为定性滤纸过滤。
在一些实施方式中，第二次过滤为5μm滤膜过滤。
在一些实施方式中，缓冲溶液为：PBS缓冲溶液或pH＝7.4的Tris-HCl缓冲溶液。
具体实施时，pH＝7.4的0.1M Tris-HCl溶液配制可以如下所示：
24.22g Tris溶解于1L纯水中，在103.4kPa和121.3℃高温高压蒸汽灭菌条件灭菌30min并冷却至室温，取其中的50mL与42mL 0.1M盐酸混匀后，加无菌水稀释至100mL。
在一些实施方式中，DNA染色工作液由0.22μm尼龙膜过滤后的二甲基亚砜、SYBRGreen I染料和PI染料组成；
其中，二甲基亚砜、SYBR Green I染料和PI染料的体积比为79：1：20。
在一些实施方式中，DNA染色工作液与染色后的待测菌悬液的体积比为1：40。
具体实施时，由SYBR Green I和PI染料组成的DNA染色工作液来区分石油烃降解菌的活性，并且计数。其中，SYBR Green I染料可进入活菌细胞与DNA结合，发出绿色荧光，用于测定活菌数；而PI染料只能穿过不完整的细胞对DNA进行染色，与DNA的碱基对结合能力更强，发出红色荧光，用于测定死菌数。因此，石油烃降解菌的DNA被染色后，在流式细胞仪中显示出荧光信号，并借助流式细胞散点图即可以计算出油污土壤样品中石油烃降解菌的丰度。操作简便，方法灵敏度、准确度高。
在一些实施方式中，恒温避光染色的工作温度为35℃，工作时间为15min。
在一些实施方式中，恒温避光染色在恒温金属浴中进行。
在一些实施方式中，流式细胞仪的工作流速为1000-1500events/μL。
为使本领域技术人员更加清楚地理解本申请，现通过以下实施例对本申请所述的一种测定石油烃降解菌丰度的方法进行详细说明。
实施例1
(1)流式细胞仪测定经PBS缓冲溶液处理土壤样品的阴性对照：
油污土壤样品取自陕西富县，称取1g油污土壤，置于50mL三角瓶中，向瓶内加入10mL PBS缓冲溶液；在30℃，180r/min的条件下振荡3h,1000g离心1min后，向菌悬液中加入0.1g石油，在30℃,140r/min的条件下振荡培养7d后，1000g离心1min，倒掉上清液，加入15mL灭菌的PBS缓冲溶液,5000g离心5min，倒掉上清液，重复三次；最后加入20mL灭菌的PBS缓冲溶液，并过5μm滤膜过滤作为待测菌悬液；
取200μL菌液，500μL无菌水，漩涡振荡30s后,进行实验测定，测定过程中样品流速为1000events/μL。在CFlow Plus分析软件中建立PE-A/FITC-A散点图，通过“门(Gate)”的设定，划定活细胞区域和死细胞区域。
(2)流式细胞仪测定经PBS缓冲溶液处理土壤样品的石油烃降解菌的丰度：
油污土壤样品取自陕西富县，称取1g油污土壤，置于50mL三角瓶中，向瓶内加入10mL PBS缓冲溶液；在30℃，180r/min的条件下振荡3h,1000g离心1min后，经定性滤纸过滤获得土壤菌悬液；向菌悬液中加入0.1g石油，在30℃,140r/min的条件下振荡培养7d后，1000g离心1min，倒掉上清液，加入15mL灭菌的PBS缓冲溶液，5000g离心5min，倒掉上清液，重复三次；最后加入20mL灭菌的PBS缓冲溶液，并过5μm滤膜过滤作为待测菌悬液。
用0.22μm尼龙膜(PALL,美国)过滤后的二甲基亚砜将SYBR Green I和PI标准母液(Solarbio,Beijing,China)稀释100倍作为DNA染色工作液。取200μL菌液，500μL无菌水,并加入5μL DNA染色工作液漩涡振荡30s后,在35℃恒温金属浴中，避光染色15min。
实验测定过程中样品流速为1000events/μL。在CFlow Plus分析软件中建立PE-A/FITC-A散点图，根据未染色的样品的“门(Gate)”的设定，划定活细胞区域和死细胞区域。图3示出了本发明实施例PBS处理的土壤样品阴性对照组中石油烃降解菌的PE-A和FITC-A的散点图，图4示出了本发明实施例PBS处理的土壤样品测试组中的石油烃降解菌的PE-A和FITC-A的散点图；其中，SSC-A中，SSC表示侧向散射角信号，A表示用面积表示信号大小；FSC-A中，FSC表示前散射光信号，A表示用面积表示信号大小；FITC-A中，FITC表示接收488nm激光激发的，波长在510-550nm的荧光信号的通道，A表示用面积表示信号大小；PE-A中，PE表示488nm激光激发的，波长在565-595nm的荧光信号的通道，A表示用面积表示信号大小；
表示选定目标菌群；
表示对目标菌群划分门(Gate)，根据图3以及图4中PE-A和FITC-A散点图计算出油污土壤样品中石油烃降解菌的丰度。本实施例中石油烃降解菌的丰度为3.36×104个/mL。
实施例2：
(1)流式细胞仪测定经pH＝7.4的Tris-HCl处理土壤样品的阴性对照：
油污土壤样品取自陕西富县，称取1g油污土壤，置于50mL三角瓶中，向瓶内加入10mL Tris-HCl缓冲溶液；在30℃，180r/min的条件下振荡3h,1000g离心1min后，向过滤后的菌悬液中加入0.1g石油，在30℃,140r/min的条件下振荡培养7d后，1000g离心1min，倒掉上清液，加入15mL灭菌的PBS缓冲溶液，5000g离心5min，倒掉上清液，重复三次；最后加入20mL灭菌的PBS缓冲溶液，并过5μm滤膜过滤作为待测菌悬液。
取200μL菌液，500μL无菌水，漩涡振荡30s后,进行实验测定，测定过程中样品流速为1000events/μL。在CFlow Plus分析软件中建立PE-A/FITC-A散点图，通过“门(Gate)”的设定，划定活细胞区域和死细胞区域。
(2)流式细胞仪测定经pH＝7.4的Tris-HCl处理土壤样品的石油烃降解菌：
油污土壤样品取自陕西富县，称取1g油污土壤，置于50mL三角瓶中，向瓶内加入10mL Tris-HCl缓冲溶液；在30℃，180r/min的条件下振荡3h,1000g离心1min后，经定性滤纸过滤获得土壤菌悬液；向菌悬液中加入0.1g石油，在30℃,140r/min的条件下振荡培养7d后，1000g离心1min，倒掉上清液，加入15mL灭菌的PBS缓冲溶液，5000g离心5min，倒掉上清液，重复三次；最后加入20mL灭菌的PBS缓冲溶液，并过5μm滤膜过滤作为待测菌悬液。
用0.22μm尼龙膜(PALL,美国)过滤后的二甲基亚砜将SYBR Green I和PI标准母液(Solarbio,Beijing,China)稀释100倍作为DNA染色工作液。取200μL菌液，500μL无菌水,并加入5μL DNA染色工作液漩涡振荡30s后,在35℃恒温金属浴中，避光染色15min。
实验测定过程中样品流速为1000events/μL。在CFlow Plus分析软件中建立PE-A/FITC-A散点图，根据未染色的样品的“门(Gate)”的设定，划定活细胞区域和死细胞区域。图5示出了本发明实施例Tris-HCl处理的土壤样品阴性对照组中石油烃降解菌的PE-A和FITC-A的散点图，图6示出了本发明实施例Tris-HCl处理的土壤样品测试组中的石油烃降解菌的PE-A和FITC-A的散点图；其中，图像内各字符所代表的含义同图3、图4中各字符所代表的含义，根据图5以及图6中PE-A和FITC-A散点图计算出油污土壤样品中石油烃降解菌的丰度。本实施例中石油烃降解菌的丰度为1.98×105个/mL。
实施例3
(1)流式细胞仪测定经pH＝7.4的Tris-HCl处理人工配制油污土壤样品的阴性对照：
在10g花园土里加入3mL石油，混合均匀放置一段时间后，称取1g油污土壤，置于50mL三角瓶中，向瓶内加入10mL pH＝7.4的Tris-HCl缓冲溶液；在30℃，180r/min的条件下振荡3h,1000g离心1min后，向过滤后的菌悬液中加入0.1g石油，在30℃,140r/min的条件下振荡培养7d后，1000g离心1min，倒掉上清液，加入15mL灭菌的PBS缓冲溶液，5000g离心5min，倒掉上清液，重复三次；最后加入20mL灭菌的PBS缓冲溶液，并过5μm滤膜过滤作为待测菌悬液。
取200μL菌液，500μL无菌水，漩涡振荡30s后,进行实验测定，测定过程中样品流速为1000events/μL。测定过程中样品流速大约为1000events/μL。在CFlow Plus分析软件中建立PE-A/FITC-A散点图，通过“门(Gate)”的设定，划定活细胞区域和死细胞区域。
(2)流式细胞仪测定经pH＝7.4的Tris-HCl处理人工配制油污土壤样品的石油烃降解菌丰度：
在10g花园土里加入3mL石油，混合均匀放置一段时间后，称取1g油污土壤，置于50mL三角瓶中，向瓶内加入10mL pH＝7.4的Tris-HCl缓冲溶液；在30℃，180r/min的条件下振荡3h,1000g离心1min后，经定性滤纸过滤获得土壤菌悬液；向菌悬液中加入0.1g石油，在30℃,140r/min的条件下振荡培养7d后，1000g离心1min，倒掉上清液，加入15mL灭菌的PBS缓冲溶液，5000g离心5min，倒掉上清液，重复三次；最后加入20mL灭菌的PBS缓冲溶液，并过5μm滤膜过滤作为待测菌悬液。
用0.22μm尼龙膜(PALL,美国)过滤后的二甲基亚砜将SYBR Green I和PI标准母液(Solarbio,Beijing,China)稀释100倍作为DNA染色工作液。取200μL菌液，500μL无菌水,并加入5μL DNA染色工作液漩涡振荡30s后,在35℃恒温金属浴中，避光染色15min。
实验测定过程中样品流速为1000events/μL。在CFlow Plus分析软件中建立PE-A/FITC-A散点图，根据未染色的样品的“门(Gate)”的设定，划定活细胞区域和死细胞区域。图7示出了本发明实施例人工配制油污土壤样品阴性对照组中石油烃降解菌的PE-A和FITC-A的散点图，图8示出了本发明实施例人工配制油污土壤样品测试组中的石油烃降解菌的PE-A和FITC-A的散点图；其中，图像内各字符所代表的含义同图3、图4中各字符所代表的含义，根据图7以及图8中PE-A和FITC-A散点图计算出人工配制油污土壤样品中石油烃降解菌的丰度。本实施例中的丰度为7.0×104个/m。
石油烃降解菌
实施例4：方法比较
分别利用分光光度法和流式细胞术，对经Tris-HCl处理的石油污染程度不同的土壤中的石油烃降解菌丰度进行测定，并对测得的烃降解菌的个数进行相关性分析。图9示出了经分光光度法和流式细胞术测定不同污染程度的土壤中的石油烃降解菌的丰度线性相关图。所得结果如图9所示，结果表明，分光光度法和流式细胞术所测得的烃降解菌个数有良好的线性相关关系，说明该方法可以用于测定油污土壤中石油烃降解菌的丰度。
以上对本发明所提供的一种石油烃降解菌丰度的测定方法进行了详细介绍，本文中应用了具体个例对本发明的原理及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想；同时，对于本领域的一般技术人员，依据本发明的思想，在具体实施方式及应用范围上均会有改变之处，综上所述，本说明书内容不应理解为对本发明的限制。
Claims (10)
1.一种石油烃降解菌丰度的测定方法，其特征在于，所述方法包括：
S1、使用缓冲溶液对油污土壤进行预处理，获得含有石油烃降解菌的待测菌悬液；
S2、用DNA染色工作液对所述待测菌悬液中的活菌和死菌进行恒温避光染色，获得染色后的待测菌悬液；
S3、借助流式细胞仪对染色后的待测菌悬液中的石油烃降解菌进行计数，获得石油烃降解菌的丰度值。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在所述步骤1中，所述预处理包括：
S11、将0.1g～1g油污土壤与1mL～10mL缓冲溶液的混合物进行3h振荡、离心、第一次过滤，获得土壤菌悬液；
S12、向土壤菌悬液中加入0.01g～0.1g石油，振荡培养7d，离心，获得待测菌，并用15mL缓冲溶液对待测菌进行1～3次离心清洗，最后向待测菌中加入20mL缓冲溶液，进行第二次过滤，获得含有石油烃降解菌的待测菌悬液。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述第一次过滤为定性滤纸过滤。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述第二次过滤为5μm滤膜过滤。
5.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述缓冲溶液为：PBS缓冲溶液或pH＝7.4的Tris-HCl缓冲溶液。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在所述步骤2中，所述DNA染色工作液由0.22μm尼龙膜过滤后的二甲基亚砜、SYBR Green I染料和PI染料组成；
其中，所述二甲基亚砜、所述SYBR GreenI染料和所述PI染料的体积比为79：1：20。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在所述步骤2中，所述DNA染色工作液与所述染色后的待测菌悬液的体积比为1：40。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在所述步骤2中，所述恒温避光染色的工作温度为35℃，工作时间为15min。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在所述步骤2中，所述恒温避光染色在恒温金属浴中进行。
10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在所述步骤3中，所述流式细胞仪的工作流速为1000–1500events/μL。
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| CN104483290A (zh) * | 2014-10-30 | 2015-04-01 | 昆明理工大学 | 一种利用流式细胞仪测定土壤中噬菌体丰度的方法 |
| CN105891091A (zh) * | 2016-06-07 | 2016-08-24 | 天津大学 | 基于流式细胞检测技术的破囊壶菌快速测定方法 |
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