CN102947464A - 一种鉴定样品中细菌的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明描述了一种用于鉴定细菌的方法。特别是，本发明涉及使用流式细胞仪从受试者痰液样本中鉴定分枝杆菌并进行定量的方法。进一步描述了使用流式细胞仪从痰液派生的样本中鉴定和定量结核分枝杆菌。一旦确定存在结核分枝杆菌并定量，样本将被点样于过滤卡片上，用来验证现有的诊断方法，校准现有的诊断方法，以及/或建立与这些诊断方法结合使用的外部质量控制体系。在一种实施方式中，该方法被用于诊断结核病(TB)。
Description
本发明的背景
本发明描述了一种用于鉴定细菌的方法。特别是，本发明涉及使用流式细胞仪从痰液样本中鉴定分枝杆菌并进行定量计数的方法。进一步描述了使用流式细胞仪从痰液派生的样本中来鉴定和定量结核分枝杆菌，并以此来验证，校准和/或建立用于诊断结核病(TB)的过程中的质量控制体系。
尽管一个多世纪以来，检验出的结核分枝杆菌被认为是引起结核病的原因，在资源贫乏的国家，特别是在艾滋病毒感染人群中，诊断结核病仍然是一个挑战。结核病是由结核分枝杆菌感染引起的疾病，结核分枝杆菌感染是引起发病率和死亡率的一个重要原因，每年有超过900万的新发病例和约180万的死亡人数。由于疾病的传染性，快速鉴定病原对于减少疾病在社区和卫生保健中心的个体之间的传播至关重要。
在大多数国家诊断结核病的最常用方法是涂片镜检，该方法成本较低，相对容易执行，但是检测灵敏度适中(35～80％)。在撒哈拉以南的许多非洲国家中，其感染艾滋病病毒的成人和儿童占全国人口的大多数，此种情况下涂片镜检的灵敏度特别低。被认可的结核病诊断的黄金标准是体外培养结核分枝杆菌，这是高灵敏度的方法，而且能够鉴定结核分枝杆菌，并且分离其药物敏感株和药物耐受株，但是这种方法仍然有很多的局限性。最大的局限性是体外培养结核分枝杆菌需要2-6周的周期，从而降低了它在临床决策中的应用。另一个局限性是，要进行结核分枝杆菌的体外培养，必须在生物安全水平(BSL2～3)，并在特定的实验室运行要求下进行，这个条件在边远的条件缺乏的地方是不容易达到的。即使是使用如BACTECTMMGIT960和MGIT DST(BD诊断系统)的液体培养方法仍然存在不足之处，从方法学上来说，仍然是“人力资源”密集的，昂贵的，并且容易出现污染。因此，特别是在艾滋病流行之后，为预防结核病感染，研发新的结核病诊断方法的进度在近期得到了加快。
根据StopTB Partnership(http://www.stoptb.org/)，现有的和新型的技术被用于诊断发病期和潜伏期的结核病，这些技术被应用于参考实验室，临床外周实验室(POC)，而且这些实验室含有不同类型的技术。这些技术包括：
(i)诊断和分类分析多重耐药性结核菌株(MDR-TB)的核酸扩增试验(NAAT)，比如GenoType
MTBDR和MTBDRplus(HainLifeSciences)，INNO-LiPARif.TB(Capilia TB-Neo)，GeneXpert MTB/RIF(Cepheid)，环介导等温扩增技术(TB-LAMP，Eiken Chemical Co)，COBAS TaqMan MTB(Roche Molecular Systems)，Gen-Probe扩增结核分枝杆菌直接试验(AMTD)和增强型AMTF(E-AMTF，Gen-Probe)，LightCyclerTM结核分枝杆菌检测试剂盒(LCTB，Roche Applied Science)，SeeplexTB检测试剂盒(Seegene，Korea)，BD-ProbeTecTM直接和半自动化ProbeTecTMET系统(Becton Dickinson)和Abbott LCx(Abbott Molecular)。
(ii)用于诊断潜伏性的结核分枝杆菌感染的γ-干扰素释放试验(QuantiFERON
-TB Gold In Tube，T-SPOT.TB
)，TB斑贴试验同样用于诊断潜伏期感染。
(iii)抗原检测，如脂阿拉伯甘露聚糖(LAM)和呼吸分析筛查试验来检测结核病。
(iv)噬菌体试验用来快速诊断多重抗药性-结核病(MDR-TB)。
(v)其他用来检测药物耐受结核分枝杆菌的方法包括：量热氧化还原指示剂法，显微镜观察药物敏感性(MODS)，硝酸还原酶试验，薄层琼脂培养、漂白显微镜、痰液过滤、痰液染色的重要荧光剂染色用于改进后的涂片镜检，发光二极管(LED)荧光显微镜用于改进后的直接涂片镜检。
对撒哈拉以南非洲艾滋病流行地区的患者的研究表明，感染艾滋病病毒人群的结核病的发病率比未感染人群高出8.3倍。艾滋病病毒阳性的人的涂片镜检结核分枝杆菌的结果多为阴性，难以诊断。世界卫生组织已经针对艾滋病病毒阳性的人的阴性结核分枝杆菌涂片镜检结果建立了算法，用以诊断结核病。对痰液样品进行PCR分析，相对涂片镜检来说，提高了灵敏度，虽然其数值有所变动，灵敏度为0.85(范围为0.36-1.00)，特异性为0.97(范围为0.54-1.00)。一种从Cepheid发展而来的新的PCR方法，叫做GeneXpert MTB/RIF，其第一例报道的灵敏度和特异性，涂片镜检阳性、结核分枝杆菌培养阳性的患者为98.2％，涂片镜检阴性、结核分枝杆菌培养阳性的患者为72.5％，该方法对检验给出了极大的保证。此外，Witwatersrand生殖健康中心和艾滋病研究中心针对成人肺结核病门诊病人进行的一项研究表明，其中70％的结核病病人同时感染艾滋病病毒，显示单个GeneXpert MTB/RIF试验相对于单个BACTEC MGIT培养法的灵敏度为86％。此方法是一种以实时PCR为基础的体系，只需要2分钟的动手时间，就可以在2小时内得出检测结果，结果中还包括对利福平的敏感性或抗药性。该系统可以随时随地由“非技术熟练”人员操作完成，并且不需要生物安全级别的基础设施。然而，这种方法的局限性是成本较高，并且依赖于当前的模块格式，即仪器目前设置只有1-16，32和48的模块，该模块目前只限于低通量随时检测和小型实验室检测；在高通量实验室，尤其是较高艾滋病/结核病发病率的中心，这仍然是迫切需要解决的问题。尽管存在这些局限性，世界卫生组织已经批准在结核病流行的国家使用GeneXpert MTB/RIF试验来检测结核病，并认定该方法是全球结核病诊断的一个重要里程碑。
为了响应全球健康的原则，流行病国家卫生系统实施GeneXpert MTB/RIF试验，而功能性实施该试验有很多方面需要注意。这包括：确定与GeneXpert MTB/RIF实施相关的主要物流和操作有关问题(例如，药筒的供应，GeneXpert装置的停机时间)；建立样品数据库用来校准和验证安装的每个GeneXpert仪器得到的结果(在仪器被认可具备出具病人检验结果的资质之前)；生成合适的外部质量评估(EQA)程序以确保实验室和非实验室环境的持续性质量检测。
在特定的GeneXpert MTB/RIF检测特性的基础上，可以预测，验证和EQA程序需要满足如下标准：1)测试材料必须包含完整的结核杆菌，以便于在GeneXpertMTB/RIF药筒中捕捉信号；2)运输EQA材料的过程必须是安全的；3)测试过程必须是安全的，而且与GeneXpert MTB/RIF当前测试方法相符合，非实验室技术熟练的卫生工作者必须能够在非实验室环境中进行测试，作为国家级的方案测试程序需要具有成本效益和可持续发展性。
除了上面描述的技术及其相关的不足之处，在艾滋病流行地区通过鉴定和定量结核分枝杆菌来诊断结核病有一些附加的并发症和影响：HIV感染往往导致痰液量的减少和痰液质量的降低。这将导致结核分枝杆菌培养阳性而其痰液涂片镜检阴性结果的增加。这反过来又导致结核病确诊的延误，进而导致疾病传播风险的增加。此外，对艾滋病毒携带者进行结核病筛查以有助于合适的评估预防性治疗以及对诊断为结核病的人群适于抗逆转录治疗都需要诊断试验。
因此，结核病诊断的解决方案可能会成为多因素有关的，临床算法，以及在不同场合不同类型的测试都可能需要。特别是，需要一个快速检测方法来鉴定取自病人体内的样品中含有结核分枝杆菌(即，该方法可以在24小时内提供结果)，而此方法应该相对容易进行，并且比较容易负担得起。更进一步，有必要建立一种可靠的方法，与GeneXpert MTB/RIF检测方法一起使用，用于建立样本数据库来校准和验证通过该方法得到的结果，并进一步产生一个持续的外部质量控制评估。
发明概述
根据本发明的第一实施方案，本发明提供了一种鉴定细菌存在与否的方法，该方法包括如下步骤：
从受试者采取的痰液样本通过流式细胞仪进行检测；
在样品中鉴别是否存在这样的区域，相对于背景碎片区域，此区域内存在角荧光强度增加以及侧散射(SS)增加或者前向散射(FS)增加。
相对于背景碎片的存在角荧光增加以及角侧散射增加或者前向散射增加的区域出现在荧光强度对角侧(或者前向)散射图上的约40-50°的角度区域，优选在约45°的角度区域。
相对于背景碎片，存在角荧光增加以及角侧散射增加或者前向散射增加的区域，说明样品中含有细菌，最可能是分枝杆菌，比如结核分枝杆菌，耻垢分枝杆菌，牛分枝杆菌，鸟分枝杆菌和偶发分枝杆菌等，最有可能的分枝杆菌是结核分枝杆菌。
相对于背景碎片的区域，不存在角荧光增加以及角侧散射增加或者前向散射增加的区域，说明受试者可能不患有结核病。
相对于背景碎片的区域，存在角荧光增加以及角侧散射增加或者前向散射增加的区域，说明受试者可能患有结核病。
所述受试者可以是人或者其他动物。
背景碎片包括裂解的细胞，粘液，唾液或者类似物，这些是典型的同时存在于来源于结核病阳性和阴性受试者的痰液中的。
在使用流式细胞仪进行检测之前，对痰液样本进行液化和/或净化和/或灭活处理。
优选地，痰液样品被灭活。灭活剂可能选自包括如下的组中：肌苷二磷酸(IDP)、Xpert SR缓冲液、加热和加入溶菌酶。
痰液样品可以用核酸结合染料进行处理，比如金胺O、SYTO染料和碘化丙啶。
流式细胞仪可以使用磁珠。
细菌预先用包含荧光标记的磁珠、配体和/或者特异性抗体进行标记，并且用流式细胞仪进行检测，来检测角区域出现的情况。
本方法可以还包括在流式细胞仪检测之前对痰液样品进行液化和/或净化和/或灭活处理。在进行液化和/或净化和/或灭活处理之前亦可对痰液样本进行体外培养。
本方法还可以包括对鉴定到的细菌进行定量的步骤。
优选地，将定量液化的和/或净化的和/或灭活处理的痰液样本点样到吸附性材料上。所用的吸附性材料可以选自以下的组中：过滤卡片、滤纸、拭子、磁珠、样品池和棉花。理想地，附性材料含有细菌野生株，参考菌株或者阴性对照。所述的吸附性材料可以与任何结核病诊断方法配合使用。特别地，所述的吸附性材料可以用作验证结核病诊断方法，校准结核病诊断方法和/或作为外部质量控制评估(EQA)的工具。
诊断方法选自由如下方法组成的组中，GenoType
MTBDR和MTBDRplusTM，INNO-LiPATMRif.TB，GeneXpertTM MTB/RIF，和环介导等温扩增技术，COBASTaqManTM MTB，Gen-Probe扩增结核分枝杆菌直接试验(Gen-Probe AmplifiedMycobacterium Tuberculosis Direct Test)(AMTD)和增强型AMTF(E-AMTF)，LightCyclerTM结核分枝杆菌检测试剂盒(LightCyclerTM Mycobacterium TuberculosisDirect Test)(LCTB)，Seeplex TB检测试剂盒(Seeplex TB Detection Kit)，BD-ProbeTec直接和半自动化ProbeTec ET系统和Abbott LCx(BD-ProbeTec Direct and thesemi-automated ProbeTec ETsystem and the bbott LCx)。
特别是，该诊断方法是GeneXpert MTB/RIF试验。
根据本发明的第二实施方式，本发明提供了一种制备含有细菌的吸附性材料的方法，该方法包括如下步骤：
i)根据上述方法鉴定并定量细菌；
ii)将鉴定并且定量的细菌点样至吸附性材料。
细菌优选包括野生株、参考菌株或者阴性对照。
根据本发明的第三实施方式，提供了一种吸附型材料，其中包含用上述方法制备的细菌。
根据本发明的第四实施方式，提供了一种鉴定是否存在细菌的方法，并且在存在细菌的情况下，进行细菌定量。该方法包括如下步骤：
i)将从受试者采取的痰液样本通过流式细胞仪进行检测；
ii)在样品中鉴别是否存在这样的区域，相对于背景碎片区域，此区域内存在角荧光强度增加以及角侧散射增加或者前向散射增加；
iii)如果样本中存在相对于背景碎片区域，角荧光强度增加以及角侧散射增加或者前向散射增加的区域，对细菌进行定量；
iv)将定量的细菌点样于用于疾病诊断的任何方法的吸附性材料上。
相对于背景碎片区域存在角荧光增加以及角侧散射增加或者前向散射增加的区域出现在荧光强度对侧(或者前向)散射图上的约40-50°的角度区域被，优选是大约45°处。
相对于背景碎片存在角荧光增加以及角侧散射增加或者前向散射增加的区域，说明样品中可能含有细菌，更可能是分枝杆菌，比如结核分枝杆菌，耻垢分枝杆菌，牛分枝杆菌，鸟分枝杆菌和偶发分枝杆菌等，最有可能的分枝杆菌是结核分枝杆菌或葡萄球菌或梭菌。
相对于背景碎片的区域不存在角荧光增加以及角侧散射增加或者前向散射增加的区域，说明受试者不患有结核病
相对于背景碎片的区域存在角荧光增加以及角侧散射增加或者前向散射增加的区域，说明受试者患有结核病
受试者可能是人或者其他动物。
背景碎片包括裂解的细胞，粘液，唾液或者类似物，这些是典型的同时存在于来源于结核病阳性和阴性受试者的痰液中的。
在使用流式细胞仪进行检测之前，对痰液样本进行液化和/或净化和/或灭活处理。
优选地，痰液样品被灭活。灭活剂可能选自：IDP，Xpert SR缓冲液，加热和加入溶菌酶。
痰液样品可以用核酸结合染料进行处理，比如金胺O，SYTO染料和碘化丙啶。
流式细胞仪可以使用磁珠。
细菌预先用包含荧光标记的磁珠、配体和或者特异性抗体进行标记，并且用流式细胞仪进行检测，来检测角区域可能出现的情况。
本方法可以还包括在流式细胞仪检测之前对痰液样品进行液化和/或净化和/或灭活处理。痰液样本在进行液化和/或净化和/或灭活处理之前可以进行培养。
所用的吸附性材料可以选自：过滤卡片、滤纸、拭子、磁珠、样品池和棉花。理想地，吸附性材料含有细菌野生株，参考菌株或者阴性对照。特别地，上述的吸附性材料可以用来验证结核病诊断方法，校准结核病诊断方法和/或作为外部质量控制评估(EQA)的工具。
诊断方法可以选自，GenoType
MTBDR和MTBDRplusTM，INNO-LiPATMRif.TB，GeneXpertTM MTB/RIF，GeneXpertTM MRSA，GeneXpertTM艰难梭菌(GeneXpertTM C.difficule)和环介导等温扩增技术，COBAS TaqManTM MTB，Gen-Probe扩增结核分枝杆菌直接试验(AMTD)和增强型AMTF(E-AMTF)，LightCyclerTM结核分枝杆菌检测试剂盒(LCTB)，Seeplex TB检测试剂盒，BD-ProbeTecTM直接和半自动化ProbeTecTMET系统和Abbott LCx。
图的简单描述
图1：流式细胞仪的散点图，显示了耻垢分枝杆菌的荧光强度1(FL1)对侧散射(SS)的图，耻垢分枝杆菌为结核分枝杆菌近支。图中显示了细菌群的典型的角形状，即存在荧光强度1(FL1)和侧散射(SS)的增加特性。
图2：流式细胞仪散点图用来鉴定涂片镜检阳性、培养阳性的痰液样品，根据与背景碎片对比，采用基于增加的荧光强度1(FL1)和增加的侧散射(SS)特性的角区域确定分枝杆菌的存在。
图3：流式细胞仪散点图，用同样的方法来鉴定涂片镜检阴性、培养阴性的样品。一个图显示角区域没有增加，另一个样品显示不存在角区域，说明没有细菌存在，只有碎片。
图4：显示了在过滤卡片上和在含有干燥剂袋的塑料转移袋中的干燥培养点(DCS)样品。通过蓝色染料染色，可见四个过滤卡片上的干燥培养点(DCS)含有灭活的结核分枝杆菌培养物。
图5：显示了采用了侧向散射阈值的流式细胞仪的散布图，并根据金胺角荧光增加和入射激光角侧散射增加来计算B区域中鉴定的细菌。除了B区域之外的其他区域显示为最低的背景碎片。
图6：显示了H37Rv结核分枝杆菌单细胞培养物的Xpert MTB/RIF扩增循环阈值(纵轴)相对于流式细胞仪计算的培养物浓度(横轴)的图。
图7：显示了三批干燥培养点(DCS)的探针A的Ct值的频率分布图与其标准曲线相重叠。Ct值的标准差和平均值见图示。
本发明的详细描述
申请人已经开发出一种细菌的快速鉴定方法。本领域的技术人员将会意识到这种鉴定方法可以延伸用于所有的革兰氏阳性细菌，包括放线菌，厚壁菌(Firrmicutes)和无壁菌(tenericutes)。特别是，申请人发明了一种鉴定放线菌，更具体地说是分枝杆菌，以用于诊断结核病(TB)的方法，该方法包括通过流式细胞仪检测来自受试者的痰液样品并分析其侧散射或前向散射区域及其荧光特性。分枝杆菌(如结核分枝杆菌，耻垢分枝杆菌，牛分枝杆菌，鸟分枝杆菌和偶发分枝杆菌等等)能够通过这个高通量检测平台直接从痰液中被检测，并且可以在当天或者24小时内得到鉴定结果。受试者可以是人或者动物(动物举例如牛类、家畜、鸟类、猪、牛、犬和野生动物，比如水牛、鹿和狮子)。
流式细胞仪是一种用来鉴别颗粒的技术，比如血红细胞、白细胞、细菌和完全悬浮的染色体。通过利用聚焦的激光光源，根据每个物体或颗粒干扰激光束时散射的入射光的量可以检测这些颗粒。这个方法的优点是分析鉴定的速度以及可以对不可见的灭活微生物进行检测。每秒可以检测分析几千个颗粒。流式细胞仪目前被用在病理学检测上，比如CD4计数，人体的CD4细胞数可以用来表征个体的免疫状态，测定艾滋病病毒感染者的发病到艾滋病的程度。这项技术被广泛应用在南非的约60个三级和二级(地区医院)医疗机构的国家实验室内。因此，使用新的结核病诊断方法不需要任何额外的设备或高级技术人员，从而医疗机构能够承担得起这项技术并且比较容易配备此技术。
流式细胞仪只能够对自由悬浮颗粒进行检测分析，而且对于使用流式细胞仪对细菌进行检测这方面的信息已经有了几次的描述(2，8)，最新的是在鉴定结核分枝杆菌中的应用(1，3-7)。然而，这些研究大多数描述的是鉴定体外培养的分离的细菌，而没有直接从痰液样品中鉴定细菌并用以快速诊断的相关研究。
本发明是直接从痰液样品中鉴定分枝杆菌，而痰液样品中含有其他的细胞和颗粒。鉴定从培养物中分离的分枝杆菌的流式细胞仪检测图谱为典型的角形状，该角形状具有增强的荧光强度1(FL1)和侧散射(SS)(或者前侧散射(FS))特征；此外，申请人可以用同样的方法在低至10个细菌/毫升的细菌浓度条件下能够鉴定耻垢分枝杆菌和结核分枝杆菌(图1)。
申请人已经发现，使用角区域，含有细菌的样品相对于背景细胞而言具有变化的增强的荧光强度，以及变化和增加的侧散射或前向散射，以及这两者相结合再加上角区域的特征可以用来鉴定痰液样品中存在细菌。总体而言，痰液中的细菌的荧光强度，侧散射或前向散射的参数(特别是FL1)大于背景碎片(比如溶解的细胞和粘液)的荧光强度和侧散射模式。更特别的是，在荧光强度对侧向散射的散点图中，在约40-50°角区域，优选为大约在45°处，画出的角状图谱，可以用作鉴定痰液样品中存在的细菌。
痰液样品中可以加入磁珠。磁珠的直径范围是约0.8μm-12μm，优选是约1μm。
痰液样品可以用染料进行处理，比如金胺O、SYTO染料、碘化丙啶或者其他合适的核酸结合染料，和/或标记的配体，和/或标记的抗体。
其他的参数可以用来提高痰液样品中细菌的检测效率，包括：
使用贝克曼库尔特公司(Beckman Coulter)的Gallios流式细胞仪，该仪器能够增加检测特征，比如广角前向散射荧光用来提高小颗粒的检出率；
使用Gallios流式细胞仪，该流式细胞仪可以检测颗粒的飞行时间(TOF)用来从双峰颗粒中区分单颗粒；
使用直径为1μm的磁珠来设定颗粒大小的阈值；以及
包括一个阴性活栅极-同时设定一个角度，来消除由碎片区域产生的信号。
在不限制本申请在其他仪器平台中的应用的基础上，后者可以改善本发明的检测灵敏度。除了这些仪器参数，对于该方法，还有一些其他的能够增加针对背景碎片的检测细菌的灵敏度的特征。例如，流式细胞仪样品管中的背景碎片可以通过下面方法来减少，防止核酸结合染料和磷酸盐缓冲液之间的沉淀，防止过氧乙酸和染料或者缓冲液之间的沉淀。
本发明的方法从痰液样品中鉴定细菌用图2来说明，其中5张图都是结核病痰液样品实例，其涂片镜检和培养均为阳性。X-轴是侧散射(SS)，Y-轴是荧光强度1(FL1)。相对于背景痰液碎片，图中画出的角状区域说明了细菌的存在。细菌(此处为结核分枝杆菌)很容易被鉴定，只要此区域存在增加的角荧光强度和增加的角侧散射。在上述角状区域之外的区域是痰液样品的背景碎片。图3进一步证明，对涂片镜检和培养均为阴性的样品进行检测，流式细胞仪检测图谱中没有上述的特征，证实了样品中没有细菌的存在。
尽管本发明目前是非特异性的，并且不能够识别细菌尤其是结核分枝杆菌，或者检测药物敏感性，但此方法可以用作高通量筛选方法。一旦准备好样品，32个样品可以同时被加入到流式细胞仪进行检测，并且可以在40分钟内完成对所有32个样品的分析。对于HIV临床医师来说这个方法特别有用，在对艾滋病病人开始抗逆转录治疗(ART)之前需要确保病人为非结核病患者。此外，此方法不依赖于扩增进行检测，其费用与PLG(NHLS标准测试)的CD4细胞计数方法的花费相同或者比之更少。
本发明的方法可以用来作为一种筛选试验，以鉴定在痰液样品中是否存在细菌。那些“标记”的或者阳性的结果可以进一步用GeneXpert进行分析从而得到结核分枝杆菌阳性的结论及其对利福平的抗药性/敏感性的结论。总体而言，这样可以减少基于PCR技术的GeneXpert药筒的消耗，并且仅仅用在证实阳性结果包括利福平的抗药性/敏感性。因此，无需涂片镜检和细胞培养试验，目前可以进行CD4流式细胞仪检测的实验中心均可以使用本方法来诊断分散的结核病病例。尽管无法鉴定特定类型的细菌，本发明使用流式细胞仪的方法能够鉴定任何存在的细菌，然后可以由细菌类型特定的方法作进一步分析。比如，葡萄球菌和梭菌也可以用这种方法进行鉴定，尽管已经发明了了GeneXpert MRSA和GeneXpert C.difficule这两种方法。
很明显，相对传统的鉴定方法，按照本发明通过流式细胞仪来鉴定细菌，具有如下的优点：
i）流式细胞仪能够快速(＞1000个/秒)鉴定整个的灭活的单个完整的细菌样品，从而规避了传统的耗时的菌落形成及计数方法；同时
ii)低浓度(＜10个/μl)的细菌样品可以被精确计数(使用校准微球)，即流式细胞仪单个细菌计数可以低于最低麦克法兰浓度(1x107细菌/ml)下进行。
本发明进一步描述了由分子医学系和血液研究所诊断科(约翰内斯堡的威特沃特斯兰德大学)正在进行的一项研究，主要用以解决GeneXpert MTB/RIF试验的实际应用的相关问题。特别是如下的方法，建立一个样品数据库用来校准和验证安装在不同地区的GeneXpert仪器所获得的结果，同时生成EQA程序以确保稳定持续的检测质量。特别地，本发明描述了在样品中鉴定分枝杆菌的用途，尤其是依据本发明使用流式细胞仪对结核分枝杆菌的鉴定和计数。此处被检测的结核分枝杆菌可以直接来自于痰液样品或者来自于收获的细胞培养物。结核分枝杆菌在点样于过滤卡片上之前，根据标准方法进行灭活，再使用流式细胞仪进行定量。
使用这些干燥培养点(DCS)具有明显优势，容易操作，降低了生物危害性的风险，可以被运送到任何的GeneXpert MTB/RIF检测点，可以将每个病人的样本分离开来进行测试。
干燥培养点(DCS)可以被收集开并分配给具备诊断结核病的GeneXpertMTB/RI试验条件的每个中心。尤其是，获得的干燥培养点(DCS)可以用于校准和/或维持和/或验证进行检测的GeneXpert设备及其获得的实验结果。各种临床(和美国菌种保藏中心(ATCC))菌株，非结核分枝杆菌(NTM)和阴性对照所得到的干燥培养点(DCS)可以用在每月/每年的EQA监测中。这个方案具有满足全国范围以及周边国家的诊断需求的潜力。
在全国范围内实施Xpert MTB/RIF试验面临的一个挑战是安装仪器的地点及其后续的结果验证和持续性能监测检验。作为南非国家卫生实验室服务(NHLS)国家优先项目推出GeneXpert MTB/RIF计划的一部分，全国各地所有的9个省份在2011年的3-4月期间安装了31台GeneXpert(Gx)仪器。这个总额为286的Gx模块在被认可具备“适合目的(fit for purpose)”的资质之前，还需要进行验证。
申请人设想，实现这一目标的唯一途径是通过EQA计划。这个计划的难处在于结核病感染性的测试材料。这是一个巨大的挑战，申请人通过使用灭活的结核分枝杆菌和干燥培养点(DCS)这种运输简便的材料，克服了这个挑战。然而，使用灭活结核分枝杆菌培养材料的难处在于无法对细菌浓度进行定量(cfu/ml)，因为灭活的细菌是没有办法再次培养的。申请人通过使用流式细胞仪对细菌进行计数从而再次克服了这个困难。
因此，申请人通过如下途径获得了成功：(1)开发了干燥培养点(DCS)(包括其稳定性)材料来建立结核分枝杆菌的EQA程序；(2)增加新的Xpert MTB/RIF检测点(通过验证)；(3)扩大规模以满足持续的EQA活动；(4)一旦开发，NHLS可以提供常规服务。
现在，将参照下面描述的实施例对本发明进行更加详细的描述。无论如何，这些实施例都不会以任何方式限制本发明的范围。比如，除了使用侧向散射和荧光强度1(FL1)，也可以使用前向散射(FS)，例如在使用另一种染料的情况下使用另一个荧光通道进行检测。此外，可以理解的是术语“过滤卡片”包括任何材料，分枝杆菌可以点样于其上并干燥，并且具有吸附性的能够保留点样细菌的任何表面。典型地，术语过滤卡片可能包括拭子、纸、棉花、样品池、棉纸或者类似物。
实施例
1.使用流式细胞仪对结核分枝杆菌进行定量的概述
a)从受试者采集痰液样品。
b)标准方法，使用氢氧化钠(NaOH)-N-乙酰基-L-半胱氨酸(NALC)-柠檬酸钠溶液来液化和净化痰液样品。
c)随后用过氧乙酸灭活细菌：1倍体积的处理过的痰液样品加入1倍体积4％过氧乙酸使得过氧乙酸终浓度为2％。
d)在层流柜(Bioflow)中室温保温30分钟后，将试管从层流柜下移出并放在实验台上进行下一步工作。
e)通过水洗的方法除去过氧乙酸，即离心后用水再次悬浮。
f)50μl的这种溶液加入到1ml金胺O染料(核酸结合染料)中，并且保温5-10分钟。
g)根据下面的试验设计使用流式细胞仪检测样品：
i.使用直径为1μm的流式细胞仪磁珠，这个阈值的大小被设定在仅略低于1μm的水平，因此磁珠在前向散射和侧散射双重图谱上均可见。
ii.在第二张图上，FL1(Y轴的荧光1)相对于侧散射(X轴)的图谱上，45°处的区域被认为是存在细菌的证明。
这个区域被用来证明细菌的存在，这个区域具有变化的(增加的)侧散射和变化是(增加的)荧光强度，因此是一个45°的角状区域。
这个角状区可以清晰地将细菌从背景碎片分离出来。
背景碎片由痰液样品中溶解的细胞、粘液等组成。
2.结核分枝杆菌在液体培养基中的生长
用来进行培养的结核分枝杆菌有三个来源：(1)合同实验室服务(CLS，约翰内斯堡，南非)分离得到的RIF临床敏感株的微生物生长培养管(MGIT)中的汇集样品，并且通过MTBDRplus(海恩生命科学(Hain Life Sciences))线性探针分析检测；(2)来自ATCC(美国菌种保藏中心)的S-MYCTU-02-P2和MYCTU 15菌株的汇集的微生物生长培养管；(3)实验室菌株H37Rv(美国菌种保藏中心/ATCC)用作单细胞生物悬浮液的培养物。
MGIT方法使用改良的米德尔布鲁克(Middlebrook)7H9肉汤培养基为基础，加入MGIT生长补充剂和PANTA(Becton Dickinson公司)，并在一个BACTEC安全柜中，37℃培养42天。阳性培养物进行ZeihlNeelsen染色以确定其存在抗酸杆菌(AFB)。对于单细胞悬浮液，实验室冻存的H37Rv菌株培养在8ml米德尔布鲁克(Middlebrook)7H9肉汤培养基(Difco实验室，底特律，密歇根)中，培养基中加入0.2％甘油，米德尔布鲁克(Middlebrook)油酸-白蛋白葡萄糖-过氧化氢酶(OADC，Merck)富集物，和0.05％吐温80以防止细胞结块，在25ml的细胞培养瓶(Greiner Bio-one)中培养5天。然后，该预培养物接种到含有200ml上述培养基的550ml组织培养瓶中，并且在37℃静止生长10天。
3.培养的结核分枝杆菌的灭活
细菌使用一定量的化学和酶活化剂进行处理，包括IDP，Xpert SR缓冲液，加热，低浓度溶菌酶，或者这些方法的组合，以确保完全破坏维持细胞结构和组成的组织，并必须确保流式细胞仪对细菌的一致的精确计数。由于PCR需要整个细菌，此操作对于结合使用GeneXpert MTB/RIF试验至关重要。
例如，简单地说，实验室S-MYCTU-02-P2和MYCTU15以及临床分离的菌株的MGIT培养后，培养基被倒出(与细菌分开)，离心分离细胞，用40ml PBS缓冲液再次悬浮，然后加入80ml(缓冲液∶细菌培养物为2∶1)GeneXpert样品反应剂(SR)缓冲液(试剂盒中提供的)。对H37Rv株，200ml培养物通过在室温下以3500×g离心10分钟收获菌体，并重新悬浮于灭菌的PBS缓冲液至终体积为40ml，随后加入80ml SR缓冲液(缓冲液∶细菌为2∶1)。MGIT培养物或者H37Rv菌株培养物在SR缓冲液中在室温下保温2小时，并通过间歇性混合以确保所有菌的灭活状态及其安全性，在不影响细菌大小的情况下便于流式细胞仪的检测。灭活的菌用无菌的PBS缓冲液洗涤两次，再用PBS缓冲液悬浮至终体积为10ml(MGIT)和40ml(H37Rv)。如果使用金胺O染料，灭活的结核分枝杆菌用蒸馏水洗涤并悬浮，因为SR缓冲液会引起染料的沉淀和粹灭。
为了确认已经灭活，将洗涤过的培养物(0.5ml)重新接种到新的MGIT培养管中。将灭活的分散的培养物通过流式细胞仪计数前，将MGIT培养物在BACTEC安全柜中培养最多42天以确认样品是否已经灭活。
4.流式细胞仪对细菌进行定量
如果细菌存在任何可视的结块，10次通过26号针头并在一个桌面顶部探头超声清洗系统(Fisher Scientific)超声破碎处理2分钟，将其打散(32)。SR灭活的，清洗并浓缩的结核分枝杆菌(10～50μl)加入到含有1ml PBS的蓝色流式细胞仪试管(Beckman Coulter)。每个流式细胞仪试管中随后加入100μl金胺O染料(DiagnosticMedia Production，NHLS，South Africa)，50μl流式计数微球(10μm)(BeckmanCoulter)，然后根据制造商说明立刻在FC500流式细胞仪(Beckman Coulter)上进行分析。作为初步试验，1μm的微球(Beckman Coulter)用以设定大小阈值(鉴别器)和光散射参数的放大增益。在流式细胞仪计数之前，用PBS缓冲液对细菌培养物进行稀释(1∶4到1∶200倍稀释)。二维散点图设定为：前向散射(FS)(垂直轴)对侧散射(SS)(水平轴)用以鉴定接近1μm大小的细菌；第二张图：荧光1(FL1)(530nm)对侧散射(SS)在荧光增加的情况下用以确定样品中存在细菌；第三张图：FS线性对荧光2(FL2)(570nm)用以鉴定流式微球数，并利用CXP软件(Beckman Coulter)达到自动计数的目的。存在上述现象的区域被认定含有细菌。一旦流式细胞仪确定了灭活的结核分枝杆菌培养物的浓度，使用Xpert MTB/RIF试验分析不同浓度。
5.Xpert MTB/RIF试验
Xpert MTB/RIF半巢式实时PCR试验(Cepheid，Sunnyvale，CA)扩增507-533区域的rpo B基因的RIF抗性决定区域(RRDR)的81bp片段。由于实时PCR特性，Xpert MTB/RIF得到的结果是定性和半定量的。前者描述了是否存在结核分枝杆菌并测定了是否存在RIF抗性。后者描述了5个探针(A-E)的循环阈值(Ct)和内部对照。Ct值在6Ct的半定量类别报告中报道，其值为非常低、低、中和高。
灭活、清洗并计数的结核分枝杆菌培养物稀释后加入2.0ml SR缓冲液并直接放入Xpert MTB/RIF药筒样品端孔，药筒放入GeneXpert仪器进行处理。根据制造商说明和试验的特异性，半定量类别的Ct值的范围是：高＜16；中等16-22；低22-28，非常低＞28。Xpert MTB/RIF探针A的Ct值与流式细胞仪计数打分进行比较，产生中等Ct值(Ct值在16-22之间)定量Xpert MTB/RIF结果的稀释物随后用于准备干燥培养点(DCS)。
6.准备和评价干燥培养点(DCS)
DCS按照以下方法制备：25μl的灭活培养物点样到Whatman903过滤卡片，同时每个样品点加入2μl DNA加样染料(Sigma-Aldrich)用来显示样品(图4)，并在室温干燥至少1小时。在分配到监测点之前，每批制造的干燥培养点(DCS)的样品点用Xpert MTB/RIF进行检测。干燥培养点(DCS)的卡片被放置在密封的含有干燥剂袋的塑料袋(Sigma-Aldrich)中并快递(n＝16)，或者运输(n＝9)，或者邮寄(将干燥培养点送至4个站点)至每个Xpert MTB/RIF的检测点。在每个检测点，每个干燥培养点(DCS)使用无菌剪刀进行切割并放入一个50ml标准实验室Nunc离心管(AEC Amersham)，离心管中同时加入2.8ml SR缓冲液(确保在干燥培养点接种后有足量的2ml SR缓冲液可以转移至Xpert MTB/RIF药筒)。离心管用涡旋振荡器振荡(或者用力手摇振荡)进行混合，并在室温下保温15分钟，保温的同时根据样品处理所述进行间隙性混合。15分钟保温之后，2ml混合物转移至XpertMTB/RIF药筒中并根据制造商说明在GeneXpert测试进行检测。在测试点检测完每个GeneXpert模块之后，选择每个模块所得到的结果进行存档，并且生成GeneXpert存档文件(.gxx)通过邮件发送至中心协调员进行验证。一旦协调员收到这些结果，这些结果被输入到当地的GeneXpert数据库，随后输出逗号分隔值(.csv)文件并达到数据收集和报告的目的。一份详细的SOP被传播至检测点，为EQA程序描绘了存档和邮寄过程。
7.统计分析
XpertMTB/RIF试验得到的定性和定量的Ct值记录了每一批干燥培养点(DCS)的每个GeneXpert测试模块。每批使用的探针，在其首次达到扩增循环阈值时，计算得出平均值、标准偏差和变异系数。这些同样在频率分布图中得到体现。流式细胞仪检测计数的分值和XpertMTB/RIF试验的Ct值之间的关系可以通过线性回归法进行定量。
8.结核分枝杆菌分散培养物的制备、灭活以及流式细胞仪计数
用来制备干燥培养点(DCS)的所有培养物在与SR缓冲液保温2小时后，在MGIT中保温42天亦无生长，确认了培养物已经被灭活。由于其聚集(cording)特性，制备的MGIT培养物样品池出现了结核分枝杆菌的结块，需要在流式细胞仪检测之前用超声波处理；而当培养基中含有甘油和吐温80时，培养物不需要用超声波预处理即可得到单细胞悬浮液，更加容易通过流式细胞仪进行鉴定(图5)。流式细胞分析使用了侧散射(SS)阈值，相对于使用前向散射(FS)阈值，能够得到更好的计数的分值。如图6所示，对于H37Rv单细胞悬浮液分散培养物的检测，流式细胞仪计数和使用探针A的Xpert MTB/RIF扩增的Ct值具有很好的相关性(R2＝0.948)。
SR缓冲液确实引起沉淀(流式细胞仪检测到更多的背景碎片)和引起荧光染料金胺的粹灭，该染料在流式细胞仪检测时用来鉴定细菌。因此在加入金胺染料和流式细胞仪检测之前，必须用蒸馏水清洗并再悬浮细菌培养物。SR缓冲液保温2小时灭活细菌并不影响细菌的大小，而且1μm的磁珠可以用在流式细胞仪检测中以精确鉴定存在的结核分枝杆菌。
9.使用干燥培养点(DCS)对测试点的Gene Xpert仪器运行Xpert MTB/RIF进行验证
三批干燥培养点(DCS)被制备并用来验证31台Gene Xpert仪器{Gx-Infinity-48(n＝1)；Gx16(n＝9)；Gx4(n＝21)}。总共286份干燥培养点(DCS)被送至检测点，最终回收了274份干燥培养点(DCS)的检测结果。其中有6份检测错误的报告，其余268份干燥培养点(DCS)的检测结果与预期相一致，为100％的结核分枝杆菌阳性和Rif敏感性(表1给出了一个汇总的结果)。六个错误报告为GeneXpert错误代码5011(n＝5)和5007(n＝1)。这个总体错误概率为2.19％(6/274)来自于用户错误(加入试剂量不正确)和药筒错误(液体传输失败或者管压消失)的结合导致的错误编码，而且这些并不代表干燥培养点(DCS)方法的失败。两个检测点在错误模块上重复了干燥培养点(DCS)的测试，并且得到了阳性的结果(通过)，额外的干燥培养点(DCS)被发送至其他需要模块重复测试的检测点。
探针A是达到扩增循环阈值的第一探针，并具有一个平均的Ct值为22，在中/低边界的上限。6个Ct值的范围确定了探针A的类别(从低至中等)，而且三批干燥培养点的标准差为≤3.47Ct，说明干燥培养点(DCS)批次之间的高精度和低变异。图4的频率分布图说明三批干燥培养点(DCS)的Ct值分布在探针A的Ct值的平均值附近。单细胞培养物中，批次V005具有最大的变量(14.4％CV)。
除了干燥培养点(DCS)对GeneXpert模块验证的定量结果之外，干燥培养点(DCS)的方案还确定了其他问题，这些有助于协助实施的进行(详见表3)。在EQA报告中，不能提交正确文件格式(存档的.GXX格式)的检测点被认定为不符合要求。实施干燥培养点(DCS)的方案不需要破坏含有干燥培养点(DCS)的滤纸材料，但是尝试破坏含有干燥培养点(DCS)的滤纸材料的3个检测点在结果上没有任何差异，除了其探针A的平均Ct值较低。较低的Ct值可能是由于SR缓冲液对细菌的重悬浮引起更多的细菌用于扩增。没有返回结果的检测点表明这些检测点需要调查整体的Gx操作程序并与标准操作程序保持一致。
表1.在268Gx模块上三批干燥培养点(DCS)的检测结果
南非面临着巨大的医疗保健挑战，目前超过一百万的艾滋病感染者正在接受抗逆转录病毒治疗，2009年报道结核病的发病率是每10万人口941例，其中9070例为多重耐药性结核病(MDR TB)。2010年全国9个省份的244个NHLS实验室进行的痰液涂片镜检的测试总数为约四百七十万(平均每名患者2个涂片镜检)。基于这个全国范围的数据，GeneXpert试验实施的30台Gx仪器仅仅只有11.1％的覆盖率，达到完全的覆盖率则需要大于250台Gx仪器。通过资格预审核平台的建立和20个新的实验室监测点总计约50台HIV病毒载量的分子检测仪器，这个国家HIV病毒载量检测的成规模的快速(1年以内)发展路径，通过吸取这个经验，GeneXpert实施计划也可以得到快速发展。
结核病的EQA程序所遇到的主要挑战是用来测试的材料的传染性特征。申请人已经表明，通过使用灭活的结核分枝杆菌同时使用干燥培养点(DCS)这样易于运输的材料，在实验室和临床检测点可以提供安全的Xpert MTB/RIF方法的EQA程序。干燥培养点(DCS)材料在验证Gx仪器被证明是100％成功的。干燥培养点(DCS)还可以标识错误代码及其频率，根据Gx模块的性能，国家计划预期其最低的错误率(2.1％)已包括在计划成本中。其他需要监测的方面，比如从接受标本到报告结果的周期，也可以通过此干燥培养点(DCS)程序监测，并找出有问题的检测点。
申请人设想，未来对Xpert MTB/RIF试验的EQA程序组件的设计，可以类似地基于LPA程序，使用一种泛敏感(pansusceptible)菌株，一种携带常用的rpoB基因突变的RIF单抗性菌株，一种多重抗药性的菌株，一种NTM菌株和一个阴性对照。使用干燥培养点(DCS)，这些菌株可以被点样在同一张过滤卡片上，并在3个月或者6个月分发给每个检测点(根据正在进行的干燥培养点(DCS)稳定性测试结果)，每个点样点含有一种不同的菌株。此外，申请人将目前的技术作为形成平台来发展Xpert MTB/RIF试验的EQA程序的其他方面。这些方面包括对于每批试剂监测无效检测率，RIF变异率(或混合药物耐药/敏感性)和测试的标本目录(和技术员/健康护理人员操作该测试)。这些方法需要创新的信息技术方案，由于GeneXpert仪器需要接口连接实验室信息系统，因此这还可以是将没有被实验室信息系统接收的EQA结果返回的通道。
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Claims (44)
1.一种鉴定存在或者不存在细菌的方法，该方法包括如下步骤：
i)用流式细胞仪检测受试者痰液样本；
ii)在样品中鉴定是否存在这样的区域：相对于背景碎片区域，此区域内存在角荧光强度增加以及角侧散射增加或者前向散射增加。
2.根据权利要求1的所述方法，其中相对于所述的背景碎片区域存在所述角荧光增加以及角侧散射增加或者前向散射增加的区域，出现在荧光强度对侧(或者前向)散射图上的约40-50°的角度区域。
3.根据权利要求1的所述方法，其中相对于所述的背景碎片区域存在所述角荧光增加以及角侧散射增加或者前向散射增加的区域，出现在荧光强度对侧(或者前向)散射图上的45°的角度区域。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述的细菌为分枝杆菌。
5.根据权利要求4所述的方法，其中所述的分枝杆菌选自于如下种属：结核分枝杆菌，耻垢分枝杆菌，牛分枝杆菌，鸟分枝杆菌和偶发分枝杆菌。
6.根据权利要求5所述的方法，其中所述的分支杆菌为结核分枝杆菌。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中相对于所述背景碎片区域，不存在角荧光增加以及角侧散射增加或者前向散射增加的区域，说明受试者不患有结核病。
8.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中相对于所述背景碎片区域，存在角荧光增加以及角侧散射增加或者前向散射增加的区域，说明受试者患有结核病。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中所述的背景碎片包括裂解的细胞，粘液或者唾液。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其中所述的痰液用核酸结合染料进行处理，该染料选自：金胺O、SYTO染料和碘化丙啶。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的方法，其中所述的细菌用磁珠、配体或者抗体进行预先标记。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述的磁珠、配体或者抗体包含荧光标记。
13.根据权利要求1至12中任一项所述的方法，该方法还包括在使用流式细胞仪检测之前，对所述痰液样本进行液化和/或净化和/或灭活处理的步骤。
14.根据权利要求13所述的方法，其中在对所述痰液样本进行液化和/或净化和/或灭活处理之前，培养所述痰液样品。
15.根据权利要求1至14中任一项所述的方法，该方法还包括对所述鉴定的细菌进行定量的步骤。
16.根据权利要求13至15中任一项所述的方法，其中对所述的痰液样本进行液化和/或/净化和/或灭活处理的步骤是将所述痰液样本点样到吸附性材料上。
17.根据权利要求16所述的方法，其中所述的吸附性材料选自如下几种材料：过滤卡片、滤纸、拭子、磁珠、样品池和棉花。
18.根据权利要求16或者17所述的方法，其中所述的吸附性材料中含有细菌野生株、参考菌株或者阴性对照。
19.根据权利要求16至18中任一项所述的方法，其中所述的吸附性材料与任何结核病诊断方法配合使用。
20.根据权利要求16至19中任一项所述的方法，其中所述的吸附性材料与任何结核病诊断方法配合使用，用来验证此结核病诊断方法和/或校准此方法和/或作为外部质量控制评估(EQA)的工具。
21.根据权利要求19或者20所述的方法，其中所述的诊断方法选自：GenoTypeMTBDR和MTBDRplusTM、INNO-LiPATM Rif.TB、GeneXpertTM MTB/RIF、环介导等温扩增技术、COBAS TaqManTM MTB，Gen-Probe扩增结核分枝杆菌直接试验和增强型Gen-Probe扩增结核分枝杆菌直接试验、LightCyclerTM结核分枝杆菌检测试剂盒、Seeplex TB检测试剂盒、BD-ProbeTecTM直接和半自动化ProbeTecTM ET系统和Abbott LCx。
22.根据权利要求21所述的方法，其中所述的诊断方法是GeneXpert MTB/RIF试验。
23.制备含有细菌的吸附性材料的方法，该方法包括以下步骤：
i)根据权利要求1至22中任一项的方法鉴定和定量细菌；并且
ii)将鉴定和定量的细菌点样至所述吸附性材料上。
24.根据权利要求23所述的方法，其中所述的细菌包括野生株、参考菌株和阴性对照。
25.一种含有细菌的吸附性材料，该吸附性材料是根据权利要求23或者24所述的方法的。
26.鉴定是否存在细菌并且在存在细菌的情况下定量细菌的方法，该方法包括以下步骤：
i)通过流式细胞仪对受试者的痰液样本进行检测；
ii)在样品中鉴定是否存在这样的区域：相对于背景碎片区域，角荧光增加以及角侧散射增加或者前向散射增加；
iii)任选地，如果样本中存在相对于所述背景碎片角荧光强度增加以及角侧散射或者前向散射增加的区域，对细菌进行定量；
iv)将定量的细菌点样于用于进行任何疾病诊断的吸附性材料上。
27.根据权利要求26所述的方法，其中相对于所述背景碎片区域存在所述角荧光增加以及角侧散射增加或者前向散射增加的区域，出现在荧光强度对侧(或者前向)散射图上的约40-50°的角度区域。
28.根据权利要求26所述的方法，其中相对于所述背景碎片区域存在所述角荧光增加以及角侧散射增加或者前向散射增加的区域，出现在荧光强度对侧(或者前向)散射图上的约45°的角度区域。
29.根据权利要求26至28中任一项所述的方法，其中所述的细菌为分枝杆菌。
30.根据权利要求29所述的方法，其中所述的分枝杆菌来自于如下种属：结核分枝杆菌、耻垢分枝杆菌、牛分枝杆菌、鸟分枝杆菌和偶发分枝杆菌。
31.根据权利要求30所述的方法，其中所述的分支杆菌为结核分枝杆菌。
32.根据权利要求26至28中任一项所述的方法，其中所述的细菌为葡萄球菌或梭菌。
33.根据权利要求26至32中任一项所述的方法，其中相对于所述的背景碎片区域不存在所述角荧光增加以及角侧散射增加或者前向散射增加的区域，说明所述受试者不感染疾病。
34.根据权利要求26至32中任一项所述的方法，其中相对于所述的背景碎片区域存在角荧光增加以及角侧散射增加或者前向散射增加的区域，说明所述受试者感染疾病。
35.根据权利要求26至34中任一项所述的方法，其中所述的背景碎片包括裂解的细胞，粘液或者唾液。
36.根据权利要求26至35中任一项所述的方法，其中所述的痰液用核酸结合染料进行处理，该核酸结合染料选自如下几种：金胺O、SYTO染料和碘化丙啶。
37.根据权利要求26至36中任一项所述的方法，其中所述的细菌用磁珠、配体或者抗体进行预先标记。
38.根据权利要求37所述的方法，其中所述的磁珠、磁珠、配体或者抗体包含荧光标记。
39.根据权利要求26至38中任一项所述的方法，在使用流式细胞仪检测之前，对所述痰液样本进行液化和/或净化和/或灭活处理。
40.根据权利要求39所述的方法，其中在对所述痰液样本进行液化和/或净化和/或灭活处理之前，培养痰液样品。
41.根据权利要求26至40中任一项所述的方法，其中所述的吸附性材料选自如下几种材料：过滤卡片、滤纸、拭子、磁珠、样品池和棉花。
42.根据权利要求26至41中任一项所述的方法，其中所述的吸附性材料含有细菌野生株、参考菌株或者阴性对照。
43.根据权利要求26至42中任一项所述的方法，其中所述的诊断方法选自：GenoTypeMTBDR和MTBDRplusTM、INNO-LiPATM Rif.TB、GeneXpertTMMTB/RIF、GeneXpertTM MRSA、GeneXpertTM艰难梭菌和环介导等温扩增技术、COBAS TaqManTM MTB、Gen-Probe扩增结核分枝杆菌直接试验和增强型Gen-Probe扩增结核分枝杆菌直接试验、LightCyclerTM结核分枝杆菌检测试剂盒、Seeplex TB检测试剂盒、BD-ProbeTecTM直接和半自动化ProbeTecTM ET系统和Abbott LCx。
44.根据权利要求43所述的方法，其中所述的诊断方法是GeneXpert MTB/RIF试验。
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