CN113008852A - 一种弧菌噬菌体效价的检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种弧菌噬菌体效价的快速检测方法。本发明利用共振瑞利散射光谱法对弧菌噬菌体效价进行快速检测，通过测定待检弧菌噬菌体在484nm波长处的散射值，利用计算公式Y＝451.01X‑4140.4即可得出待检弧菌噬菌体的效价。式中，X为待检样品中噬菌体效价，单位为PFU/mL；Y为分光光度计检测的散射光强‑25.332。本发明具有容易操作、检测时间短等优势特点，通过共振瑞利散射光谱法检测噬菌体效价能有效改善传统噬菌体检测法步骤繁琐、耗时的问题。

Description

一种弧菌噬菌体效价的检测方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体地说涉及一种弧菌噬菌体效价的检测方法。
背景技术
噬菌体(Bacteriophage)，是一类能感染细菌、真菌、放线菌或者螺旋体等微生物的病毒的总称，所以又称作细菌病毒(bacterial virus)。噬菌体在自然界中无处不在，尤其是海洋中噬菌体丰度巨大。它能够对宿主细菌产生特异性的裂解作用，并在细菌培养板上形成空斑，因而将其命名为噬菌体。噬菌体本身具有特异性高，能自我复制，筛选周期短，绿色环保等抗生素无法比拟的优点，噬菌体作为良好的抗生素替代品是科学研究的热点之一。在噬菌体的研究过程中，其含量效价的检测是至关重要且必不可少的一个环节。
当前噬菌体检测计数方法主要包括空斑计数法、电子显微镜法、PCR检测方法、生物传感器技术联用检测方法以及流式细胞检测技术。其中空斑计数法是目前世界上检测噬菌体最广泛的方法。
空斑计数法是通过噬菌体裂解宿主所形成的噬菌斑，不仅能检测出噬菌体的类别，还能够准确计算其病毒的数量。但此方法操作繁琐且难度较大，其准确度也难以把控；所需耗时约12～24h，对于大批量检测工作而言，所耗物料数量较大，耗时长，不适于快速检测。同时，空斑计数法要求严格的实验条件，宿主菌必须具有良好活性，易于在固体培养基上生长。实际操作中难免会出现稀释误差，以及在噬菌斑形成时，极易出现两个噬菌斑相互重叠在一起，造成计数时的误差。因此，该方法有一定的局限性。
噬菌体病毒电镜诊断方法是通过负染色或利用免疫电子显微镜对噬菌体颗粒免疫的技术方法，以此进一步检测噬菌体病毒。电子显微镜检测方法主要是以电磁波作为显微镜的光源，将噬菌体病毒样品制作成检测样本，再利用短波电子流，在显微镜下进行观察，可以得到极高的分辨率。电子显微镜法对检测的病毒样品要求有较高的浓度,但是其检测的误差范围在20％～25％之间，无法确定鉴定的病毒是否具有活性也无法鉴定宿主类型，同时电子显微镜操作成本高，耗时长。
传统PCR和荧光定量PCR也具有较多缺点，如多种样本混合检测时，检测效果较差。而且病毒的核酸稳定性差，容易降解。实验所用到的核酸都很难长期保存。提取核酸的质量直接影响检测结果，故这种检测只能进行定性检测。
生物传感器技术虽检测精确度极高，但存在技术成本较高等问题，而流式细胞仪检测前期需进行染色等步骤较为繁琐。
因此，提供一种操作步骤简单、检测所需耗时短、符合噬菌体效价快速检测要求的法是本领域技术人员亟待解决的技术难题。
共振瑞利散射(Resonance Rayleigh Scattering,RRS)作为一种新分析技术始于二十世纪九十年代初，Pastemackm等首次用共振散射技术研究卟啉类化合物在核酸分子上的J型堆积，显示出该方法在研究生物大分子的识别、组装、超分子排列以及多个分析领域的应用前景。刘绍璞等率先研究小分子之间借静电引力、疏水作用和电荷转移作用而形成离子缔合物产生强烈的RRS信号.从另一角度丰富和拓展了研究内容。目前，共振瑞利散射光谱法在生物大分子的测定、药物分析、纳米微粒和痕量无机物离子的研究和分析中得到越来越多的应用。已发展成为一种高灵敏度、操作简便、仪器价廉和应用广泛的新方法。目前，共振瑞利散射法在抗生素、细菌等众多领域运用十分广泛，但该法在应用于噬菌体效价的测定上尚属空白。
发明内容
针对上述问题，本发明提供一种弧菌噬菌体效价的快速检测方法，其特征在于：通过共振瑞利散射光谱法检测噬菌体SM浸提液效价，所述弧菌噬菌体效价的计算公式如下：
Y＝451.01X-4140.4；
式中，X：待检样品中噬菌体效价，单位为PFU/mL；
Y：分光光度计检测的散射光强-25.332，
波长值设置为484nm，狭缝值设置为2.5nm
优选地，本发明所检测的弧菌噬菌体效价范围为109～1011PFU/mL。
本发明与现有技术相比，具有以下突出优点：
1.本发明主要针对目前常用的噬菌体效价检测方法普遍存在耗时、耗材、操作过程繁琐等问题，建立一种利用荧光分光光度计，采取共振瑞利散射光谱法实现噬菌体效价的快速检测。
2.本发明研究得到弧菌噬菌体的通用荧光强度效价关系公式Y＝451.01X-4140.4，且R2>0.8,显示出较好的线性关系。研究人员可通过该公式，通过测定噬菌体菌液的荧光值，扣除空白组荧光平均值代入公式，就可以预估出噬菌体的效价。
3.本发明操作步骤简单，检测所需耗时短，符合噬菌体效价快速检测的要求。
附图说明
下面结合附图表和具体实施例对本发明作进一步的说明。
图1为生理盐水、SM缓冲液、含3％NaCl的LB肉汤培养基波长值。
图2为裂解处理后六株宿主弧菌(TY21、VP11、GH32、VP505、VP506、TY18)波长值。
图1和图2是实验的空白组，从图1和图2所示波长可以看出噬菌体浸提液制作过程中的背景物质的荧光值极低。
图3为噬菌体梯度稀释液荧光波长值。
从图1、图2、图3中可以看出其在波长484处均为一个波峰，由此将最佳波长选取为484nm，进行后续读数操作。
图4为弧菌噬菌体φTY21荧光标准曲线。
图5为弧菌噬菌体φVP11荧光标准曲线。
图6为弧菌噬菌体φGH32荧光标准曲线。
图7为弧菌噬菌体φVP505荧光标准曲线。
图8为弧菌噬菌体φVP506荧光标准曲线。
图9为弧菌噬菌体φTY18荧光标准曲线。
图10为汇总弧菌噬菌体的通用荧光强度-效价关系标准曲线。
具体实施方式
下面结合实施方式对本发明进一步说明，应理解的是，这些实施例仅用于例证的目的，并不限制本发明的保护范围。
生理盐水配置：0.9％氯化钠溶液。
SM缓冲液配置：准确称量MgSO4·7H2O 2g，NaCl 5.8g，加入1mol/L Tris-HCl溶液(PH＝7.5)50ml，加蒸馏水定容至1000ml，摇匀后灭菌备用。
含3％NaCl的LB肉汤培养基配置：向LB肉汤培养基(含1％NaCl)中外加2％NaCl。
弧菌菌液(TY21、VP11、GH32、VP505、VP506、TY18)：均为副溶血弧菌，为本实验室保藏菌株。
噬菌体(φTY21、φVP11、φGH32、φVP505、φVP506、φTY18)：均为弧菌噬菌体，以上述六株副溶血弧菌作为宿主菌筛得，以上噬菌体均为本实验室筛的保藏菌株。
已知浓度且呈梯度分布的多组弧菌噬菌体标准液：由原始高浓度噬菌体浸提液用SM缓冲液作为稀释溶剂采取梯度稀释方式，倍半稀释和10倍稀释结合，噬菌体效价范围为1.056*109PFU/mL-8.625*1010PFU/mL。
6株弧菌噬菌体浸提液的配置：通过挖取双层平板法培养出的噬菌斑于SM缓冲液中，混匀静置于4℃环境12小时，静置过后，10000转离心2分钟，上清液用0.22μm滤膜过滤，得到的过滤液即为噬菌体浸提液。
实施例1弧菌噬菌体的通用荧光强度效价关系公式的推导
S1.常规法配制噬菌体浸提液(φTY21、φVP11、φGH32、φVP505、□VP506、φTY18)。通过挖取双层平板法培养出的噬菌斑于SM缓冲液中，混匀静置于4℃环境12小时，静置过后，10000转离心2分钟，上清液用0.22μm滤膜过滤，得到的过滤液即为噬菌体浸提液。
S2.传统空斑计数法检测噬菌体浸提液(φTY21、φVP11、φGH32、□VP505、φVP506、φTY18)效价。
S3.配制准备空白组溶液。空白组分别为生理盐水、SM缓冲液、含3％NaCl的LB肉汤培养基、经过裂解处理的弧菌菌液(取实验组噬菌体对应的宿主弧菌(TY21、VP11、GH32、VP505、VP506、TY18)，培养其浓度至1010CFU/ml，超低温反复冻融五次，后10000转离心两分钟，取上清液经0.22μm滤膜过滤，即得到宿主菌液裂解液)。
S4.确定散射荧光最佳波长值。将生理盐水、SM缓冲液、含3％NaCl的LB肉汤培养基、经过裂解处理的弧菌菌液(TY21、VP11、GH32、VP505、VP506、TY18)以及处理好的多组弧菌噬菌体标准浸提液分别转入比色皿中，荧光分光光度计上机操作，使用打开软件“scan”，选择“synchronous”，Ex.Start设置为300nm，Ex.Stop设置为800nm，Excitation Slit与Emission Slit狭缝值均设为2.5nm，Scan control选择Medium，其他为默认参数值。检测得到荧光数据结果，得出最佳波长值484nm。
S5.对实验组六株弧菌噬菌体(φTY21、φVP11、φGH32、φVP505、□VP506、φTY18)浸提液进行若干次倍半稀释和10倍梯度稀释，得到稀释梯度液。
S6.分别对空白组和实验组弧菌噬菌体稀释梯度液进行荧光值的读取。分别取生理盐水、SM缓冲液、含3％NaCl的LB肉汤培养基、六株宿主弧菌裂解液(TY21、VP11、GH32、VP505、VP506、TY18)、弧菌噬菌体浸提液(φTY21、φVP11、φGH32、φVP505、φVP506、φTY18)及其稀释梯度液进行484nm波长处的散射值的读取，打开“Simple Reads”软件进行荧光值的读取，打开Setup界面，将Ex.Wavelength与Em.Wavelength设置为484nm，Ex.Slit和Em.Slit设置为2.5nm，每组数据分别读数三次，取平均值，得到荧光数据结果。
S7.计算空白组(生理盐水、SM缓冲液、含3％NaCl的LB肉汤培养基、六株弧菌裂解液)荧光读数平均值。
S8.选取有效数值绘制实验组六株弧菌噬菌体(φTY21、φVP11、φGH32、φVP505、φVP506、φTY18)荧光强度-效价标准曲线。噬菌体荧光值三次平均值要分别扣除空白组平均值。剔除无效数据，根据有效数据绘制标准曲线。
S9.将上述六株噬菌体荧光强度数据与双层平板空斑计数法效价汇总制成标准曲线，得出了弧菌噬菌体的通用荧光强度-效价关系公式：
Y＝451.01X-4140.4，R2＝0.8291
公式中，X：待检样品中噬菌体效价，单位为PFU/mL；
Y：分光光度计检测的散射光强-25.332；
R：相关系数；
实施例2
取未知效价的弧菌噬菌体浸提液A，以最佳波长484nm扫描读取其荧光值，打开“Simple Reads”软件进行荧光值的读取，打开Setup界面，将Ex.Wavelength与Em.Wavelength设置为484nm，Ex.Slit和Em.Slit设置为2.5nm，每组数据分别读数三次，取平均值，扣除空白组荧光平均值，得到荧光数据结果Y＝108.689，代入弧菌噬菌体的通用荧光强度-效价关系公式：Y＝451.01X-4140.4，得出X＝9.421。再以常规双层板空斑计数法对样品A进行检测，检测结果样品A效价为9.408。
实施例3
取未知效价的弧菌噬菌体浸提液B，以最佳波长484nm扫描读取其荧光值，打开“Simple Reads”软件进行荧光值的读取，打开Setup界面，将Ex.Wavelength与Em.Wavelength设置为484nm，Ex.Slit和Em.Slit设置为2.5nm，每组数据分别读数三次，取平均值，扣除空白组荧光平均值，得到荧光数据结果Y＝460.386，代入弧菌噬菌体的通用荧光强度-效价关系公式：Y＝451.01X-4140.4，得出X＝10.201。再以常规双层板空斑计数法对样品B进行检测，检测结果样品B效价为10.346。
实施例4
取未知效价的弧菌噬菌体浸提液C，以最佳波长484nm扫描读取其荧光值，打开“Simple Reads”软件进行荧光值的读取，打开Setup界面，将Ex.Wavelength与Em.Wavelength设置为484nm，Ex.Slit和Em.Slit设置为2.5nm，每组数据分别读数三次，取平均值，扣除空白组荧光平均值，得到荧光数据结果Y＝912.655，代入弧菌噬菌体的通用荧光强度-效价关系公式：Y＝451.01X-4140.4，得出X＝11.204。再以常规双层板空斑计数法对样品C进行检测，检测结果样品C效价为11.236。
实施例5
取未知效价的弧菌噬菌体浸提液D，以最佳波长484nm扫描读取其荧光值，打开“Simple Reads”软件进行荧光值的读取，打开Setup界面，将Ex.Wavelength与Em.Wavelength设置为484nm，Ex.Slit和Em.Slit设置为2.5nm，每组数据分别读数三次，取平均值，扣除空白组荧光平均值，得到荧光数据结果Y＝55.883，代入弧菌噬菌体的通用荧光强度-效价关系公式：Y＝451.01X-4140.4，得出X＝9.304。再以常规双层板空斑计数法对样品D进行检测，检测结果样品D效价为9.319。
实施例6
取未知效价的弧菌噬菌体浸提液E，以最佳波长484nm扫描读取其荧光值，打开“Simple Reads”软件进行荧光值的读取，打开Setup界面，将Ex.Wavelength与Em.Wavelength设置为484nm，Ex.Slit和Em.Slit设置为2.5nm，每组数据分别读数三次，取平均值，扣除空白组荧光平均值，得到荧光数据结果Y＝371.015，代入弧菌噬菌体的通用荧光强度-效价关系公式：Y＝451.01X-4140.4，得出X＝10.003。再以常规双层板空斑计数法对样品E进行检测，检测结果样品E效价为9.91。
表1：实施例2～6中共振瑞利散射光谱法与双层板空斑计数法对比表
Figure BDA0002948544950000081
由上表可看出，采用本发明技术方案所测得的弧菌噬菌体效价值与传统双层板空斑计数法所测得的弧菌噬菌体效价值差异不显著，同时，采用本技术方案操作步骤简单，检测所需耗时短，符合噬菌体效价快速检测的要求。
虽然以上描述了本发明的具体实施方式，但是熟悉本技术领域的技术人员应当理解，我们所描述的具体的实施例只是说明性的，而不是用于对本发明的范围的限定，熟悉本领域的技术人员在依照本发明的精神所作的等效的修饰以及变化，都应当涵盖在本发明的权利要求所保护的范围内。

Claims (2)

1.一种弧菌噬菌体效价的快速检测方法，其特征在于：通过共振瑞利散射光谱法检测噬菌体SM浸提液效价，所述弧菌噬菌体效价的计算公式如下：
Y＝451.01X-4140.4；
式中，X：待检样品中噬菌体效价，单位为PFU/mL；
Y：分光光度计检测的散射光强-25.332，
波长值设置为484nm，狭缝值设置为2.5nm。
2.根据权利要求1所述的一种弧菌噬菌体效价的快速检测方法，其特征在于：所述弧菌噬菌体效价范围为109～1011PFU/mL。
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