CN103555587A

CN103555587A - 一种从自然水体中筛选高油脂藻类的方法

Info

Publication number: CN103555587A
Application number: CN201310546621.5A
Authority: CN
Inventors: 荆红梅; 刘红斌; 郑丽平; 叶承; 孙海燕
Original assignee: Institute of Deep Sea Science and Engineering of CAS
Current assignee: Institute of Deep Sea Science and Engineering of CAS
Priority date: 2013-11-07
Filing date: 2013-11-07
Publication date: 2014-02-05

Abstract

本发明涉及藻类筛选技术领域，具体公开一种能够快速有效从自然水体中筛选高油脂藻类的方法。所述方法为将采集的含藻类水样先用荧光染料进行染色；然后再透过带分选仪的流式细胞分析筛选技术，来快速筛选出自然水体环境中的高油脂优良藻类类群，并进一步在实验室条件下分离培养以得到高油脂含量的纯微藻藻种。本发明所述方法可以迅速、便捷地从种类丰富的自然样品中分离得到高含油量的藻类，为生物能源的开发提供种质资源库，具大规模生产藻类能源的前景和潜力。

Description

一种从自然水体中筛选高油脂藻类的方法

技术领域

本发明涉及藻类筛选技术领域，具体地，涉及一种能够快速有效从自然水体中筛选高油脂藻类的方法，所述方法主要是利用特异性荧光染料结合具有分选仪的流式细胞技术来快速分离筛选自然水体中含油脂量高的藻类，为生物能源的开发提供种质资源库。

背景技术

随着经济的飞速发展和世界人口的快速增长，能源问题已成为世界各国极为关注的焦点。目前，石油储量降低、化石能源价格上涨、环境污染、能源需求不断增加，因而寻求一种可再生、可持续发展的清洁能源刻不容缓。生物质能源是地球上最普遍的一种清洁、可再生的能源，目前各国纷纷开展生物燃料、生物燃油的研究和生产，以替代昂贵并已成为稀有资源的传统燃油的使用。日美等国科学界已开始利用海洋微型藻类来制取柴油、乙醇等探索。

藻类是自然界一种数量巨大的可再生资源，也是生产生物质能源的潜在资源。其作为新一代生物能源原料，具有很多优势，如：（1）微藻种类繁多，广泛分布于淡水和海洋中。全球已鉴定的微藻大约有40000种，而且数量还在不断增加。（2）相对于传统的油料作物，微藻生产量大、生长周期短。其生长速率远远高于陆生作物，一般微藻在24小时内其生物量可以加倍。（3）一般微藻的含油量可达20%-50%，部分微藻的含油量可以超过其干质量的80%。（4）微藻能在海水、淡水中培养，能耐受沙漠、干旱地、半干旱地等极端环境，不占用耕地（黄冠华& 陈峰，2009）。（5）微藻能吸收并利用工农业生产中排放出的大量CO₂和氮化物，或从废水中取得氮、磷等，有利于改善环境。（6）微藻的生物化学成分可以通过环境条件的改变加以调节，从而提高含油量。基于以上优点，藻类对缓解人类所面临的粮食、能源、环境三大危机有着巨大的潜力，并对减少化石能源的依赖、保证国家能源安全有深远意义。

微藻是潜力巨大的生物能源，但规模和成本是目前开发微藻的两大瓶颈问题。解决这些问题，一方面需要各环节技术的突破，另一方面也依赖于优良藻种的筛选和遗传改造。美国国家可再生能源实验室（NREL）已经从硅藻和绿藻中筛选了将近300种微藻，它们的含油量都超过了生物量的50%，而这只是从3000多种微藻中筛选出来的，因而可以说从丰富的自然环境库中筛选出多样的目的藻种大有希望。

藻类胞内油脂测定的常见方法主要包括重量法（Bligh & Dyer, 1959）、香草醛比色法（Gunnel & Leonardo, 1991）、尼罗红染色法（Cooksey et al, 1987）。重量法和比色法都费时费力，而且对设备要求较高；利用尼罗红染色法比较省时，但是不能很好地对厚细胞壁的藻类进行染色（Cooper et al, 2009），且染色后通常需进行显微镜镜检以观察油滴染色情况较费时。目前，BODIPY505/515染料已经被应用来观测藻类细胞含油脂量（Cooper et al. 2010），可于数分钟内染上细胞器内的脂质体并不断累积。此染料可以对细胞壁较厚藻类的胞内油脂有效染色，且不会长久停留在除了脂质体外的其它藻类器官，因而是较尼罗红更为优良的染料。以上所提及的几种常用油脂含量检测方法只能针对单一藻种进行检测，而环境水体中种类丰富的微藻是筛选高油脂含量微藻的物种库，所以目前急需一种从环境样品中能快速检测并筛选分离得高含油脂量藻类的方法。

流式细胞术（Flow Cytometry）是一种在功能水平上对单细胞或其它生物粒子进行定量分析和分选的检测手段，可以每秒钟分析上万个细胞，并能同时从一个细胞中测得多个参数。其应用范围非常广泛，其中细胞分选是它的重要应用之一。流式细胞仪也称为荧光激活细胞分选仪，可以根据每个细胞的光散射和荧光特征进行快速定量分析和分选，将特定细胞从细胞群体中分选出来，达到每次只筛选到一个细胞。近些年研制出的BD FACSCalibur Cytometer 是高精密分析和高速细胞分选的仪器，可以从细胞群中高速分选出被指定的细胞，以便作进一步鉴定、功能研究或细胞培养（Grogan & Collins，1990）。其原理为流式细胞仪流动室中细胞由下至上运动，流动室喷嘴上方有捕获管用于收集细胞。细胞通过激光时，电子系统依据分选门的限定判定该细胞是否为目的细胞，如确定即依照之前用户选定的分选模式分选。一旦决定捕获该目的细胞，电子系统在移动捕获管至样本液流中进行捕获前等待一段固定时间以便让细胞到达捕获部位。与其它方法相比，该仪器分选速度快，最高分选速度可达70000个细胞/秒以上，比传统的分选速度提高了很多倍，原来需要一天的工作现在只需要几个小时就能完成，可同时完成四路分选，分选纯度大于98%。利用带分选仪的流式细胞仪技术结合染料来快速有效检测并筛选环境样品中高油脂含量的藻类是一种可靠理想的办法，但目前国内外均还未有报导。

发明内容

本发明要解决的技术问题是为了克服现有技术中缺乏从自然水体中筛选高油脂藻类方法的技术缺陷，提供一种从自然水体中筛选高油脂藻类的方法。

本发明的目的通过以下技术方案予以实现：

一种从自然水体中筛选高油脂藻类的方法，包括如下步骤：

S1.采集含藻类水样，过滤去除大型生物和杂质；

S2.将含藻类水样用浓度为20～40µl/ml的荧光染料于常温避光染色15分钟，使用带分选功能的流式细胞仪测定染色前后藻类荧光强度及信号变化；

S3.利用带分选功能的流式细胞仪筛选出中间特异性信号较强的部分水样，得到高油脂藻类类群水样；

S4.将高油脂藻类类群水样分离培养，得到高油脂含量的纯微藻藻种。

自然水体中含有较多种类的藻类，要想从很多的藻类品种中针对性的分离出高油脂含量的藻类，首先需要考虑的是如何排除其他藻类的影响，其次是考虑如何将所有高油脂藻类品种一次性分离出来，而不是利用传统方法一个品种、一个品种的分离，利用传统方法太浪费时间。本发明正是利用高油脂藻类含油量高的特性，利用荧光染料染色后，再结合流式细胞仪筛选技术一次性将所有高油脂藻类品种一次性分离出来。

现有的微藻制油技术主要是利用光合作用将二氧化碳转化为微藻自身的生物质，再通过诱导反应使微藻自身的碳物质转化为油脂，然后利用物理化学方法使胞内油脂转化到细胞外，进行提炼加工从而生产出生物柴油。微藻制油技术的关注点在于高油脂藻种的筛选及其大规模培养，以获得足够的生物柴油原料。目前，微藻筛选纯化均需人工利用传统方法如微吸管分离法、水滴分离法、稀释分离法、平板分离法等来获得，并通过对单一藻种的研究、改造，以达到提炼油脂要求，因而需要长时间、多人力等投入。通过上述方法获得的含油量较高的藻种主要是水体中含量丰富的螺旋藻、小球藻、盐藻、角毛藻等。自然水体中还有许多高油脂藻类，由于数量限制等原因，通过传统方法很难将其一一挑选出来，且微藻制油目前的投入大都放在固有藻类大规模培养改造方面，过程较长。但随着技术进步，带有筛选功能的流式细胞仪的开发利用让我们获得了挑选高油脂藻类的更好方法。

优选地，所述荧光染料为BODIPY505/515或Nile Red，更优选地，当荧光染料为BODIPY505/515时，其浓度为20µl/ml；当荧光染料为Nile Red时，其浓度为40µl/ml。

作为优选实施方案，所述高油脂藻类类群水样分离培养之前，在10000rpm转速下离心3分钟，用磷酸盐缓冲液洗脱2次，悬浮于无菌培养液中。

优选地，使用带分选功能的流式细胞仪测定染色前后藻类荧光强度及信号变化时，使用激发波长450～490nm，发射波长530nm。

本发明的有益效果是：

本发明筛选过程简便、高效，利用带分选仪的流式细胞筛选技术可从自然环境水体中大规模、高效、快速鉴定并筛选出高油脂藻种类群，分离培养后得到有较高胞内油脂含量的纯藻种，对更好地利用自然环境中的微藻种质资源和开发微藻生物能源有重要意义。

附图说明

图1. 对数期的小球藻经不同浓度的两种染料（BODIPY505/515和Nile Red）染色后的双聚焦显微照片；a：BODIPY(2 µl/5ml)，b：BODIPY(20 µl/ml)，c：BODIPY(40µl/ml)，d：BODIPY(80 µl/ml)，e：Nile Red (100 µl/5ml)，f：Nile Red (200 µl/5ml)，g：Nile Red(500 µl/5ml)。

图2 单一藻种以及混合藻种经BODIPY505/515染色前后的流式细胞仪检测到的荧光信号及强度变化；a：三角褐指藻染色后流式细胞仪检测结果；b：小球藻染色后流式细胞仪检测结果；c：三角褐指藻及小球藻经BODIPY染色混合后FLI方向检测结果；d：三角褐指藻及小球藻经BODIPY染色混合后在FL3方向上检测结果。

图3 自然水体样品中的微藻经BODIPY505/515染色后的流式细胞仪检测到的荧光信号及强度变化；a为染色前；b为染色后。

图4 流式细胞分选仪筛选得到的纯微藻经BODIPY505/515染色后的双聚焦显微照片。

具体实施方式

下面结合说明书附图和具体实施例进一步详细说明本发明。除非特别说明，本发明采用的试剂、设备为本技术领域常规试剂和设备。

实施例1

针对两种常用的油脂特异性荧光染料，选用不同浓度染色并结合双聚焦显微镜以检测到最佳染色浓度

一、材料与试剂配制：

1、藻种：小球藻是属于油含量相对较高的微藻，选择实验室培养的处于对数期的小球藻进行染色以找到最佳染色浓度。

2、染料溶液配制：

BODIPY505/515：使用有机溶剂二甲亚砜（DMSO）溶解BODIPY505/515染料，并配制成5mM的母液，-20℃保存。

Nile Red：使用丙酮溶解Nile Red染料，并配制成25 µg/mL的母液，常温避光保存。

3、染色：分别用不同浓度BODIPY505/515和Nile Red染料在常温避光对小球藻染色15分钟。染料浓度分别为BODIPY 505/515：2 µl/5ml，20 µl/ml，40 µl/ml，80 µl/ml；Nile Red：100 µl/5ml，200 µl/5ml，500 µl/5ml。用双聚焦显微镜观察小球藻胞内油滴并拍照：BODIPY505/515染色的激发波长450～490nm； Nile Red染色的激发波长488～525nm；叶绿体自发荧光激发波长633nm。从低浓度开始染色并拍照，观察明场和激发波长下油滴图片，见附图1。根据图片中油滴的亮度确定到染料的最佳染色浓度分别为：BODIPY染料最佳染色浓度20～40µl/ml；Nile Red最佳染色浓度为200µl/5ml。

实施例2

流式细胞仪结合荧光染料来检测单一微藻胞内油脂

选择对数期培养的藻类：三角褐指藻Phaeodactylum和小球藻。

用浓度为20µl/ml 的BODIPY505/515染料对单一藻种以及二者混合藻类于常温避光染色15分钟，流式细胞仪测定染色前后藻类特异性荧光强度（激发长488nm，发射波长530nm）。吸取1ml样品到专用的流式分析试管中，设置滤光片：前向散射光、侧向散射光、红色荧光和荧光信号。然后将样品放入进样系统，调节进样速度在0.1～1ml/h。488nm激光激发产生侧向散射光，染料经过激光束也发出荧光信号，其散射光信号和荧光信号经光学系统收集，由检测系统转换成为电信号，再通过模/数转换器，转换为可被计算机识别的数字信号，各种信号经计算机采集后，用相应的应用软件进行分析处理，最后，以直方图或三维图的形式显示出来。采集数据，保存结果，并进行数据分析。

染色前后发现含油脂藻类488nm激光激发产生的散射光在FL1方向上的峰值都发生偏移，说明可以用来挑选含油脂藻类，见附图2；由附图2结果可知：三角褐指藻和小球藻染色后在流式细胞仪FL1方向上的荧光信号较未染色时的叶绿体自发荧光信号有明显右移。三角褐指藻及小球藻经BODIPY染色混合后在FLI方向上明显右移，且具单一的锋，而在FL3方向上检测到有明显不同的叶绿体自发荧光峰。

实施例3

通过实施例1和实施例2的摸索试验总结得到：一种从自然水体中筛选高油脂藻类的方法，应该包括如下步骤：

S1.采集含藻类水样，过滤去除大型生物和杂质；

S2.将含藻类水样用浓度为20～40µl/ml的荧光染料（荧光染料为BODIPY505/515或Nile Red）于常温避光染色15分钟，使用带分选功能的流式细胞仪测定染色前后藻类荧光强度及信号变化；

实施例4 实施例3所述筛选方法的应用

S1. 从美国马萨诸塞州Eel Pond (41˚52'58N, 70˚67'06W)采集水样，先用200 µm滤网除掉较大型生物和其它杂质。

S2. 用浓度为20 µl/ml的BODIPY505/515于常温避光染色15分钟，流式细胞仪测定染色前后藻类特异性荧光信号（使用激发波长488nm，发射波长530nm）。观察染色前后荧光信号的变化，见附图3，由图3结果可知：染色后相较于染色前在流式细胞仪的FL1方向上荧光信号明显右移，信号增强，且有两个不同强度的峰值出现，代表不同油脂含量的微藻类群。

S3. 筛选：利用带分选功能的流式细胞仪筛选出中间信号较强的部分，即是含油量高的藻类类群。为了在离心时保持细胞完整，提高收获率，分选前首先准备收集管：牛血清白蛋白（BSA）用0.4 µm滤膜过滤，4%BSA包被50ml锥型管中，冰浴或冰箱放置至少1小时。然后清洗分选管线；优化流式细胞仪的测定条件，建立分选门；分选条件设置，选择分选模式为回收模式；分选目的细胞；最后清洗分选管路。

S4. 清洗筛选得到的部分：10000rpm转速下离心3分钟，用磷酸盐缓冲液洗脱2次，悬浮在无菌培养基中。

S5. 稀释法分离培养：用无菌培养液将样品做梯度稀释直至成每一滴水含有一个左右藻类细胞，在稀释过程中配合显微镜检查以调节稀释度，然后加入含有1/4容量培养液的试管中摇匀进行培养。等到藻类生长繁殖到一定浓度时，再检查是否已经分离成功。如果未达到，再重复做，直到成功为止。

利用上述方法从自然水样中一次性得到四种高油脂藻类，分别为：小球藻(Chlorella sp.)；隐甲藻(Crypthecocinium sp.)；球藻(Nannochloropsis sp.)；三角褐指藻(Phaeodactylum sp.)。

S6. 针对成功分离得到的其中一种硅藻（三角褐指藻），用浓度为20µl/ml的BODIPY505/515于常温避光染色15分钟并于双聚焦显微镜下拍照、经流式细胞仪检测荧光强度。图片中可以观察到藻类油滴并检测到较强的荧光信号，说明去除染料后再培养的藻种可以继续生长，且分离筛选得到的藻类具有较高油脂含量，见附图4。

实施例5 实施例3所述筛选方法的应用

S1. 从美国马萨诸塞州Woods Hole (41˚31'36N, 70˚39'47W)采集水样，先用200 µm滤网除掉较大型生物和其它杂质。

利用上述方法从自然水样中一次性得到四种高油脂藻类，分别为：等鞭金藻(Isochrysis sp.)；巴夫藻(Pavlova sp.)；扁藻(Tetraselmis sp.)；角毛藻(Chaetoceros sp.)。

S6. 针对成功分离得到的藻类，用浓度为20µl/ml的BODIPY505/515于常温避光染色15分钟并于双聚焦显微镜下拍照、经流式细胞仪检测荧光强度。结果说明去除染料后再培养的藻种可以继续生长，且分离筛选得到的藻类具有较高油脂含量。

以上实验结果表明，带分选仪的流式细胞仪可结合油脂特异性染料来快速和有效地筛选自然水体环境中的含油量较高的藻类，作为种质资源库，可进一步分离得到高含油量的纯藻种，因而具大规模生产藻类能源的应用前景。

通过实施例4或5所述方法从自然水样中分离高油脂含量藻类的方法只需要一个月时间，比传统的方法更准确更快。

Claims

1.一种从自然水体中筛选高油脂藻类的方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1.采集含藻类水样，过滤去除大型生物和杂质；

2.根据权利要求1所述筛选高油脂藻类的方法，其特征在于，所述荧光染料为BODIPY505/515或Nile Red。

3.根据权利要求2所述筛选高油脂藻类的方法，其特征在于，当荧光染料为BODIPY505/515时，其浓度为20µl/ml；当荧光染料为Nile Red时，其浓度为40µl/ml。

4.根据权利要求1所述筛选高油脂藻类的方法，其特征在于，所述高油脂藻类类群水样分离培养之前，在10000rpm转速下离心3分钟，用磷酸盐缓冲液洗脱2次，悬浮于无菌培养液中。

5.根据权利要求1所述筛选高油脂藻类的方法，其特征在于，使用带分选功能的流式细胞仪测定染色前后藻类荧光强度及信号变化时，使用激发波长450～490nm，发射波长530nm。