CN103163113A

CN103163113A - 一种超声辅助荧光染色检测微藻油脂含量的方法

Info

Publication number: CN103163113A
Application number: CN2013100973213A
Authority: CN
Inventors: 刘冰峰; 任宏宇; 任南琪; 谢国俊; 赵磊; 马超
Original assignee: Harbin Institute of Technology
Current assignee: Harbin Institute of Technology
Priority date: 2013-03-25
Filing date: 2013-03-25
Publication date: 2013-06-19

Abstract

一种超声辅助荧光染色检测微藻油脂含量的方法，它涉及快速检测微藻油脂含量的方法。本发明针对微藻藻种细胞壁较厚，荧光染料难以穿透其细胞壁和细胞膜与胞内脂质有效结合的技术难点。本方法将微藻液利用超声波进行处理后采用脂溶性染料尼罗红进行染色。所用的激发波长为530～540nm，发射波长为565～575nm，建立了相对荧光强度-油脂含量标准曲线，用于定量检测微藻细胞的油脂含量。本方法所需样品量少、灵敏度高、易于操作，可用于富油微藻的高通量筛选及胞内油脂含量的动态监测等。

Description

一种超声辅助荧光染色检测微藻油脂含量的方法

技术领域

本发明涉及快速检测微藻油脂含量的方法。

背景技术

生物柴油是新型“绿色能源”，具有可再生和环境保护的双重功效，符合国家“十二五”规划节能减排和低碳经济发展的战略需求。目前，生物柴油主要以动植物油脂（猪油、牛油、玉米、大豆、油菜籽等农作物）以及餐饮废油为主要生产原料，是替代传统石化能源、减少温室气体排放的新型可再生能源。然而传统的以农作物为原料生物柴油生产技术，对农作物需求量大，从而形成了“与人争粮，与粮争地”的局面，导致粮食价格上涨。因此，积极寻找新的生物质能源材料，缓解面临的粮食和能源危机、促进经济可持续发展已成为世界各国决策者和研究者高度关注的问题。

在生物柴油制备的各种原材料中，微藻是重要的可再生资源，同时也是生物柴油巨大的资源库，具有分布广泛、光合效率高、生长周期短、产量高、富含油脂、环境适应能力强，最重要的是不占用耕地等优点。同时，微藻的生长能够捕获废气中的二氧化碳，既可以降低生物柴油生产成本又可以缓解温室气体效应。因此，微藻生物柴油被认为是唯一可能取代化石油的重要替代品，发展前景广阔。

目前制约微藻生物柴油规模化的瓶颈问题是昂贵的生产成本，其根本也取决于微藻藻种的含油量。因此，培育出生长迅速、环境适应力强、富油的微藻新品种是微藻生物柴油提高产率和降低成本的关键。然而用传统的有机溶剂提取法测定微藻油脂含量繁琐、费力、成本高、易造成环境污染，同时其检测费时（通常为3～4天），难以满足富油微藻筛选大规模、快速、高效的要求。

尼罗红是一种疏水性较强的荧光染料，可以根据极性的不同展现出从黄色到红色的荧光颜色，但在水环境中尼罗红所发的荧光会完全淬灭。此外，由于尼罗红具有良好的光化学稳定性和特殊的发光波长范围，故可排除多数生物分子在测定中的干扰。经尼罗红染色后微藻细胞所发的荧光强度与胞内的油脂含量显著相关，并且尼罗红染色法耗时较短、所需生物样品量少、操作步骤较为简单，可直接用于测定微藻细胞的油脂含量，使分析测定方法明显简化。

由于微藻的细胞壁厚且坚硬，尼罗红不易穿透细胞与油脂粒结合，导致染色效果不理想，因此，采用有效的破壁方法以提高尼罗红的染色效果是实现快速、高效油脂检测方法的关键。

超声波振动时能发出并传递强大的能量，可以对媒质产生强烈的机械振动、空化、搅拌等作用。且其具有高效、能耗低、保持胞内物质生物活性等特点。通过超声波能高效的破坏细胞壁，使其中的成分溶于溶剂中，更有助于荧光染料的染色。然而，尚缺乏超声波应用于微藻荧光染色方面的报道。

发明内容

本发明的目的是为了解决现有检测微藻油脂含量的方法繁琐、费时、费力、成本高、易造成环境污染以及尼罗红对微藻细胞染色效果不理想的问题，而提供了一种超声辅助荧光染色检测微藻油脂含量的方法。

本发明的一种超声辅助荧光染色检测微藻油脂含量的方法，是由下列步骤实现的：

一、取微藻藻液，经离心收集固相物，加入等体积的去离子水或超纯水，得重悬微藻细胞，将其分成两份待用；

二、将步骤一得到的一份重悬微藻细胞，在温度为0～4℃的条件下超声破碎1～30min；

三、向步骤二超声破碎后的重悬微藻细胞中加入尼罗红混匀，避光染色1～30min，将染色后的微藻细胞分为两份；

四、取步骤三中的一份染色后的微藻细胞，采用三维荧光光谱对步骤三染色后的微藻细胞测定荧光强度；

五、取步骤三中另一份的染色后的微藻细胞，采用二维荧光光谱测定荧光强度，将染色后的微藻细胞二维荧光光谱所测定的荧光强度数值减去尼罗红和未进行尼罗红染色微藻细胞在二维荧光光谱相同波长下测得的荧光强度数值之和，即得相对荧光强度，然后取步骤一中的另一份重悬微藻细胞采用有机溶剂提取法测定油脂含量，构建相对荧光强度-油脂含量标准曲线；

六、根据标准曲线公式计算待测微藻的油脂含量；

标准曲线公式为：y=0.0268x-1.5532；其中，R²=0.9957，y为油脂含量，单位为mgL^-1；x为相对荧光强度；

其中，步骤三中所述的尼罗红加入量为加入尼罗红至溶液中尼罗红的浓度为0.1～5.0mgL^-1；步骤四中所述的三维荧光光谱激发波长为220～750nm，发射波长为220～750nm；步骤五中所述的二维荧光光谱的激发波长为450～550nm，发射波长为500～700nm。

本发明包含以下有益效果：

本发明的方法首次采用三维荧光对微藻细胞进行油脂测定，将超声辅助与尼罗红荧光染色法耦合，用于定量检测微藻细胞的油脂含量，所需样品少、灵敏度高、易于操作，可用于富油微藻的高通量筛选及胞内油脂含量的动态监测等。

附图说明

图1为经超声处理后尼罗红染色微藻三维荧光光谱图；

图2为经尼罗红染色后的二维荧光光谱图；其中，a为超声前二维荧光光谱图，b为超声后二维荧光光谱图；

图3为相对荧光强度-油脂含量标准曲线。

具体实施方式

本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式，还包括各具体实施方式间的任意组合。

具体实施方式一：本实施方式的一种超声辅助荧光染色检测微藻油脂含量的方法，是由下列步骤实现的：

六、根据标准曲线公式计算待测微藻的油脂含量；

本实施方式步骤五中所述的“将染色后的微藻细胞二维荧光光谱所测定的荧光强度数值减去尼罗红和未进行尼罗红染色微藻细胞在二维荧光光谱相同波长下测得的荧光强度数值之和”是指先将尼罗红和未进行尼罗红染色微藻细胞的荧光强度数值相加，再与染色后的微藻细胞测得的荧光强度数值做差。

本实施方式的方法首次采用三维荧光对微藻细胞进行油脂测定，将超声辅助与尼罗红荧光染色法耦合，用于定量检测微藻细胞的油脂含量，所需样品少、灵敏度高、易于操作，可用于富油微藻的高通量筛选及胞内油脂含量的动态监测等。

具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一不同的是：所取藻液的体积为3～60mL。其它与具体实施方式一相同。

具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式一或二不同的是步骤一中所述的微藻藻液所用微藻为小球藻、栅藻、硅藻、隐甲藻、扁藻、杜氏藻、螺旋藻或金藻。其它与具体实施方式一或二相同。

具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式一至三之一不同的是：步骤二中所述的超声条件为：超声时间为3～30s，间隔时间为2～6s，超声功率为15～150W。其它与具体实施方式一至三之一相同。

具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式一至四之一不同的是：步骤三中所述的尼罗红加入量为加入尼罗红至溶液中尼罗红的浓度为1.0～3.0mgL^-1。其它与具体实施方式一至四之一相同。

具体实施方式六：本实施方式与具体实施方式一至五之一不同的是：步骤五中所述的二维荧光光谱的激发波长为530～540nm，发射波长为565～575nm。其它与具体实施方式一至五之一相同。

具体实施方式七：本实施方式与具体实施方式一至六之一不同的是：步骤五中所述的有机溶剂提取法为氯仿-甲醇法、索氏抽提法、正己烷-异丙醇法、正己烷-乙醇法或乙醚-石油醚法。其它与具体实施方式一至六之一相同。

通过以下试验验证本发明的有益效果：

试验1

本试验的一种超声辅助荧光染色检测栅藻油脂含量的方法是按照以下步骤进行的：

一、取50mL栅藻藻液（Scenedesmaceae），在转速为10000rmin^-1的条件下离心10min，收集固相物，加入等体积的超纯水后，重悬藻细胞，分成两份待用；

二、将装有步骤一中得到的一份重悬藻细胞的离心管在温度为0～4℃的条件下在细胞破碎仪上进行超声处理，超声破碎仪的工作条件为：破碎时间5min，每超声30s，间隔5s，循环，超声波细胞破碎仪输出功率为120W；

三、经步骤二超声处理后的藻液中加入尼罗红，使溶液中尼罗红的浓度为1.5mgL^-1，混匀后避光染色15min，将染色后的微藻细胞分为两份；

四、取步骤三中的一份染色后的微藻细胞，采用三维荧光光谱测定最适的激发波长与发射波长，其中，激发波长为220～750nm，发射波长为220～750nm；

五、取步骤三中另一份的染色后的微藻细胞，采用二维荧光光谱测定荧光强度，其中，激发波长为530～540nm，发射波长为565～575nm；将染色后的微藻细胞二维荧光光谱测定的染色微藻细胞荧光强度数值与尼罗红和未进行尼罗红染色的微藻细胞在上述二维荧光光谱波长下测得的荧光强度数值之和作差，即得相对荧光强度，然后取步骤一所得的另一份重悬微藻细胞用有机溶剂提取法测定油脂含量，通过所测得的相对荧光强度与油脂含量，构建相对荧光强度-油脂含量标准曲线；

六、根据标准曲线公式计算待测微藻的油脂含量；

标准曲线公式为：y=0.0268x-1.5532；其中，R²=0.9957，y为油脂含量，单位为mgL^-1；x为相对荧光强度。

本试验步骤一中所述的栅藻，筛选方法是按以下步骤实现：一、取微藻样品，加入到培养基A中富集培养15～30天；二、取步骤一得到的藻液，按体积百分含量为10%的接种量接种于培养基A中，在温度为25℃的光照培养箱中培养7～14天；三、重复步骤二2～3次，得藻液A；四、取步骤三得到的藻液A，按体积百分含量为10%的接种量接种于培养基B中，在温度为25℃的培养箱中培养7～14天，得藻液B；五、取步骤四得到的藻液B以无菌水按10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5和10^-6的倍数进行稀释，将10^-5～10^-6倍数稀释后的藻液均匀涂布于固体培养基C平板上，在25℃培养箱中培养至出现藻落；六、在无菌环境中，挑取生长较快、较大的单藻落，转入到培养基B中，在温度为25℃的培养箱中培养7～14天；七、重复步骤五至步骤六3～4次，即完成藻株的分离，得到微藻液；八、取步骤七得到的微藻液，用超声波进行破碎，在破碎后的藻液中加入尼罗红溶液，混匀染色后，测定藻液的荧光强度，选择荧光强度最高的藻株，即得到栅藻；

其中，步骤一和步骤二中所述的培养基A按重量分数是由1份硝酸钠、0.075份硫酸镁、0.04份磷酸氢二钾、0.036份氯化钙、0.02份碳酸钠、0.006份柠檬酸、0.006份柠檬酸铁铵、0.001份乙二胺四乙酸和0.00541份微量元素组成的；

步骤四和步骤六中所述的培养基B按重量分数是由0.5份硝酸钠、0.075份硫酸镁、0.04份磷酸氢二钾、0.036份氯化钙、0.02份碳酸钠、0.006份柠檬酸、0.006份柠檬酸铁铵、0.001份乙二胺四乙酸、0.00541份微量元素和10份葡萄糖组成的；

步骤五中所述的固体培养基C按重量分数是由0.5份硝酸钠、0.075份硫酸镁、0.04份磷酸氢二钾、0.036份氯化钙、0.02份碳酸钠、0.006份柠檬酸、0.006份柠檬酸铁铵、0.001份乙二胺四乙酸、0.00541份微量元素、10份葡萄糖和15份琼脂组成的；

步骤八中所述的藻液与尼罗红溶液的体积比为3:1000。

本试验测得的微藻油脂含量的三维荧光光谱结果如图1所示，由图1可以得出最适的激发波长为530～540nm，发射波长为565～575nm；

本试验测得的微藻油脂含量的二维荧光光谱测定结果如图2所示，由图2可以得出超声破碎可以显著提高染色藻液的荧光强度，与未经超声处理的染色微藻液相比，经超声破碎后染色微藻液的荧光强度增长了3倍多；

图3为本试验构建的相对荧光强度-油脂含量标准曲线，从图3中可以看出相对荧光强度与油脂含量呈显著相关性，通过测定经所述步骤超声处理后的染色藻液所发的荧光强度，即可定量的得到微藻的油脂含量，达到了快速、高效测定富油微藻油脂含量的目的。

试验2

本试验与试验1不同的是：步骤一中所采用的微藻藻液为市售栅藻，其它与试验1相同。

本试验的测定结果为经本方法处理的样品荧光强度为380.965，比未经本方法处理提高了约2.4倍。

Claims

1.一种超声辅助荧光染色检测微藻油脂含量的方法，其特征在于它是按下列步骤实现的：

六、根据标准曲线公式计算待测微藻的油脂含量；

2.根据权利要求1所述一种超声辅助荧光染色检测微藻油脂含量的方法，其特征在于所取藻液的体积为3～60mL。

3.根据权利要求1所述一种超声辅助荧光染色检测微藻油脂含量的方法，其特征在于步骤一中所述的微藻藻液所用微藻为小球藻、栅藻、硅藻、隐甲藻、扁藻、杜氏藻、螺旋藻或金藻。

4.根据权利要求1所述一种超声辅助荧光染色检测微藻油脂含量的方法，其特征在于步骤二中所述的超声条件为：超声时间为3～30s，间隔时间为2～6s，超声功率为15～150W。

5.根据权利要求1所述一种超声辅助荧光染色检测微藻油脂含量的方法，其特征在于步骤三中所述的尼罗红加入量为加入尼罗红至溶液中尼罗红的浓度为1.0～3.0mgL^-1。

6.根据权利要求1所述一种超声辅助荧光染色检测微藻油脂含量的方法，其特征在于步骤五中所述的二维荧光光谱的激发波长为530～540nm，发射波长为565～575nm。

7.根据权利要求1所述一种超声辅助荧光染色检测微藻油脂含量的方法，其特征在于步骤五中所述的有机溶剂提取法为氯仿-甲醇法、索氏抽提法、正己烷-异丙醇法、正己烷-乙醇法或乙醚-石油醚法。