CN103146678A - 一种高脂质含量葡萄藻新品系的选育方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及葡萄藻开发利用，旨在提供一种高脂质含量葡萄藻新品系的选育方法。该方法是向葡萄藻液中加入微粒型的黄单胞多糖，置于冰水浴中用超声波将葡萄藻集落制备成单细胞；经紫外线辐射诱变及低熔点琼脂糖固定化培养后，利用尼罗红显微荧光活体筛检技术获得高含脂量的葡萄藻候选突变体；再经扩大培养和脂质含量测定选育出高脂质含量的葡萄藻新品系。本发明方法与传统选育方法相比，具有简便、高效，且可实现高通量筛检等优点，可为葡萄藻育种等提供必要的技术方法。
Description
技术领域
本发明属于能源微藻——葡萄藻开发利用的技术，特别涉及一种高脂质含量葡萄藻新品系的选育方法。
背景技术
葡萄藻（Botryococcus）是一种世界广布的能源微藻，该藻因脂质含量通常为其细胞干重的25-35%，普遍高于小球藻等其它微藻，且脂质的组成和结构与化石原油的也最为相近，而被誉为“油藻”，以其生产航空燃油等高品质燃料一直是近年来全球生物能源领域的研发热点之一[Metzger & Largeau. Botryococcus braunii: a richsource for hydrocarbons and related ether lipids. Appl Microbiol Biotechnol. 2005, 66: 486–496; Sakamoto,et al. Optimization of light for growth, photosynthesis, and hydrocarbon production by the colonial microalga Botryococcus braunii BOT-22. Bioresource Technology. 2012, 110: 474−479.]。种子工程是农业与生物产业的基础，选育优良种质的重要性不仅在螺旋藻、小球藻等经济微藻的产业化进程中得到了充分体现，在推进水稻、小麦、玉米等农作物高产、优质、低成本生产中更是表现得淋漓尽致。值得指出的是，有关葡萄藻优良种质选育虽已受到国内外的高度重视，但在葡萄藻遗传育种研究方面迄今近乎空白，而从自然界分离藻株的适应性差、脂质产率低等问题，也正是制约着葡萄藻至今尚未能得到商业化开发应用的主要瓶颈。因此，迫切需要运用诱发突变等现代育种技术，对从自然界分离获得的葡萄藻种进行遗传改良，显著提高其对人工培养条件的适应性、生长速率及含脂量，这对实现葡萄藻的低成本工业化培殖并以之生产品质和价格等均能与化石燃油相竞争的生物燃油，推进葡萄藻制油的产业化进程，具有重要意义。目前，开展高脂质含量葡萄藻新品系选育主要面临着以下两方面的技术难题：1、葡萄藻呈由几十至几百个细胞聚集而成的集落状，其诱变频率及突变体筛选效率远低于小球藻等呈单细胞态的微藻；2、还没有建立适于筛选高脂质含量突变体的选择压力，只能先将藻液涂于平板分离培养，再将大量的克隆逐一接种到培养液扩大培养后再进行脂质测定，因而筛选的工作量大、效率低、成功率小。因此，迫切需要建立一种简便、高效、高通量的高脂质含量葡萄藻新品系的培育方法。
发明内容
本发明要解决的技术问题是，克服现有技术中的不足，建立一种高脂质含量葡萄藻新品系的选育方法。
为解决技术问题，本发明的解决方案是：
提供一种高脂质含量葡萄藻新品系的选育方法，该方法是：将葡萄藻液置于离心管，加入微粒型的黄单胞多糖，然后置于冰水浴中，并用超声波将由几十至上百个细胞形成的葡萄藻集落制备成单细胞；单细胞化的葡萄藻经紫外线辐射诱变及低熔点琼脂糖（low melting agarose）固定化培养后，利用尼罗红显微荧光活体筛检技术获得高含脂量的葡萄藻候选突变体；再经扩大培养和脂质含量测定选育出高脂质含量的葡萄藻新品系；所述的低熔点琼脂糖是指在多糖链上引入羟乙基后的琼脂糖（低熔点琼脂糖系常用的生物培养与分子操作实验素材，其熔点约为65℃，比普通琼脂糖的熔点低30℃左右）；所述的高脂质含量的葡萄藻是指脂质含量比其出发品系至少高30%的葡萄藻。
本发明具体包括以下步骤：
(1) 取4 mL待测葡萄藻液于5 mL离心管中，再加入微粒型黄单胞多糖，并置于冰水浴中预冷；微粒型黄单胞多糖的添加量为5粒，0.2mg/粒，共1 mg；
(2) 预冷藻液经超声波处理10 s后，在光学显微镜下观察葡萄藻集落是否已被分散成单细胞；
(3) 若没有，则用每次5 s的超声波进行多次处理，直至被分散成单细胞，由此计算被测葡萄藻液适宜的超声处理时间T=10+5×n，单位为s，其中n为每超声处理5 s的次数；
(4) 用孔径为0.45 µm的无菌滤膜过滤藻液使藻细胞均匀平铺于滤膜上，并用紫外线进行诱变处理；
(5) 将滤膜上的藻细胞转移至培养液中，并使其560 nm的光密度D560为0.05，转入10 ml的PE管中，每管装4 ml，并置于37℃水浴中保温；
(6) 用低熔点琼脂糖固定细胞，并置于25℃光照培养箱中培养30 d；
(7) 将含藻细胞的低熔点琼脂糖凝胶切成1 mm厚的圆片，并置于含2%(V/V)二甲基亚砜和1 µg/mL尼罗红的染色液中于黑暗下40℃染色10 min；
同时，按上述步骤制备对照组，其中省去步骤(4)中用紫外线诱变处理藻细胞；
(8) 取1片染色后的对照组藻细胞的凝胶片并展到载玻片上，置于荧光显微镜上用蓝光激发，通过调节荧光显微镜上蓝色激发光电流调控旋钮调节激发光强度直至能看到具红色荧光的葡萄藻细胞，再通过调节荧光显微镜上蓝色激发光电流调控旋钮逐渐调低激发光的强度，至显微视野中藻细胞的荧光刚好消失，记下电流表上表征此时蓝色激发光强度的电流值I，继续调节蓝色激发光电流调控旋钮使电流表的电流值降至2I/3，保持此时旋钮的位置不变；
(9) 将经紫外线诱变的藻细胞的凝胶片用尼罗红染色后展到载玻片上，并置于荧光显微镜上用调节好光强度的蓝光激发，当观察到具红色荧光的藻细胞时，用接种针挑取相应的凝胶块，并置于含1 ml培养液的2 ml PE管中，用频率为20 kHz、发射功率为100 W、以1 s / 1 s 的开/关间歇的超声波处理20 s以粉碎凝胶块，再置于25℃光照培养箱中培养30 d，即获得高脂质含量的葡萄藻新品系。
本发明中，在步骤（2）或（3）中制备葡萄藻单细胞时，设定超声波仪的频率为20 kHz，发射功率为100 W，将Φ2型变幅杆前端2 cm浸入预冷藻液，以1 s / 1 s 的/关间歇超声处理15~25 s。
在本发明步骤（4）中，所述诱变处理是：将滤膜上的藻细胞放置于距18W紫外灯管20 cm处，用紫外线照射15 min，再避光3 h。
在本发明步骤（6）中，使用与藻液等体积的浓度为2%、65℃的低熔点琼脂糖（low melting agarose）进行固定藻细胞。
与现有技术相比，本发明的显著优点：
本发明方法与传统选育方法相比，具有简便、高效，且可实现高通量筛检等优点，可为葡萄藻育种等提供必要的技术方法。
具体实施方式
为提高诱变育种的诱变频率及突变体的有效筛选率，通常需将诱变材料单细胞化。本方法用适当功率超声波处理将细胞呈集落状的葡萄藻制备成单细胞。为减少超声波对藻细胞的机械损伤，本方法于超声处理前在藻液中加入少量黄单胞多糖（Xanthan gum），利用其能在藻细胞表面形成膜状物，且可使超声波能量传递变得更加平缓等特性，而达到了良好效果。紫外线是一种高效的物理诱变因子，它能使生物的遗传物质DNA发生变异。同时，尼罗红（9-(diethylamino) benzo[a]phenoxazin-5(5H)-one）是一类亲脂性的噁嗪类染料，进入藻细胞后能与胞内脂质结合并发出特异波长的荧光，且荧光强度与脂质含量呈正相关，因而可利用荧光显微镜观测藻细胞的荧光强度，筛选出脂量含量比出发品系的至少高30%的新品系。在实际筛选中，可通过调节荧光显微镜上激发光强度的电流调控旋钮使未经诱变处理的藻细胞（即出发品系）的荧光刚消失，此时表征蓝色激发光强度的电流为I，继续调节蓝色激发光电流调控旋钮使表征蓝色激发光强度的电流降至2I/3，在此条件下，只有含脂量比出发品系的至少高30%的藻细胞才能见有荧光，且荧光越亮即意谓藻细胞的脂质含量越高，将具荧光的藻细胞挑选出来后经进一步培养与检测，即可获得高脂质含量的突变体。本方法比传统方法更简便、高效，且可实现高通量筛检。
下面通过具体实施例子，对本发明的实现方式进行详细描述。
本发明的技术方案可以通过以下步骤实现：
1、选用样本材料：以公知的葡萄藻品系UTEX 572（保藏单位: Culture Collection of Algae at the University of Texasat Austin；地址: The University of Texas at Austin,The Culture Collection of Algae (UTEX), 205 W. 24thSt. Stop A6700, Austin, TX 78712-1240, USA）为材料，这株品系是实验室常用的葡萄藻，在发明人所在的浙江大学原子核农业科学研究所生物资源与分子工程实验室也有保存，可随时提供样本。
2、试剂和仪器：本发明中所用的微粒型黄单胞多糖（Xanthan gum，约0.2 mg/粒）、尼罗红（NR）、二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide, DMSO）、低熔点琼脂糖（low melting agarose）均为美国Sigma公司产品；微粒型黄单胞多糖是指用造粒-干燥设备先将黄单胞多糖等物料制成大小均匀的圆球体颗粒、再进行干燥而获得的微粒状剂型，其单粒重可通过调整工艺参数进行调控。JY92-II型超声波发生仪由宁波新芝生物科技股份有限公司生产；Ultrospec 2000型紫外−可见分光光度计为美国Pharmacia公司产品；TE214S型电子天平为北京赛多利斯产品；18W紫外灯管为Philip公司产品；CFM-330型荧光显微镜为上海长方光学仪器有限公司产品。
3、高脂质含量葡萄藻新品系的选育方法的主要步骤如下：
(1) 取4 mL待测光密度值的葡萄藻液于5 mL离心管中，再加入5粒（1 mg）微粒型黄单胞多糖（Xanthan gum），并置于冰水浴中预冷；
(2) 设定超声波仪的频率为20 kHz，发射功率为100 W，将Φ2型变幅杆前端2 cm浸入步骤(1)的预冷藻液，以1 s / 1 s (开/关)间歇超声10 s后，用玻璃吸管取约10 µL藻液在光学显微镜下观察葡萄藻集落是否已被分散成单细胞；
(3) 若葡萄藻集落未被分散成单细胞，则按步骤(2)中的方法再超声处理5 s，再用光学显微镜下观察是否已被分散成单细胞；
(4) 重复步骤(3)，直至将葡萄藻集落分散成单细胞，由此可计算被测葡萄藻液适宜的超声处理时间T=10+5*n，单位为s，其中n为每超声处理5 s的次数；
(5) 用孔径为0.45 µm的无菌滤膜过滤藻液使藻细胞均匀平铺于滤膜上，并放置于距18W紫外灯管20 cm处紫外线照射15 min，再避光3 h以阻止DNA损伤光修复；
(6) 将滤膜上的藻细胞转移至培养液中，并使其560 nm的光密度（D560）为0.05，转入10 ml的PE管中，每管装4 ml，并置于37℃水浴中保温；
(7) 各PE管中加入65℃浓度为2%的低熔点琼脂糖4 ml，迅速盖好盖并巅倒混匀后，竖直置于试管架上，于25℃光照培养箱中培养30 d；
(8) 用手术刀和手术剪小心切开PE管，取出圆柱形的低熔点琼脂糖凝胶，用手术刀切成约1 mm厚的圆片，并置于含2%(V/V)二甲基亚砜和1 µg/mL尼罗红的染色液中于黑暗下40℃染色10 min；
同时，按上述步骤制备对照组，其中省去步骤(4)中用紫外线诱变处理藻细胞；
(9) 取1片染色后的对照组藻细胞的凝胶片并展到载玻片上，置于荧光显微镜上用蓝光激发，通过调节荧光显微镜上蓝色激发光电流调控旋钮调节激发光强度直至能看到具红色荧光的葡萄藻细胞，再通过调节荧光显微镜上蓝色激发光电流调控旋钮逐渐调低激发光的强度，至显微视野中藻细胞的荧光刚好消失，记下电流表上表征此时蓝色激发光强度的电流值I，继续调节蓝色激发光电流调控旋钮使电流表的电流值降至2I/3，保持此时旋钮的位置不变；
(9) 将经紫外线诱变的藻细胞的凝胶片用尼罗红染色后展到载玻片上，并置于荧光显微镜上用调节好光强度的蓝光激发，当观察到具红色荧光的藻细胞时，用接种针挑取相应的凝胶块，并置于含1 ml培养液的2 ml PE管中，用频率为20 kHz、发射功率为100 W、以1 s/ 1 s 的开/关间歇的超声波处理20 s以粉碎凝胶块，再置于25℃光照培养箱中培养30 d，即可获得脂质含量至少比出发品系的高30%的葡萄藻新品系。
4、结果与分析
根据实验结果，葡萄藻品系UTEX 572藻液在含0.25‰黄单胞多糖（Xanthan gum）的情况下，经20 s (n=2)超声处理，由几十至上百个细胞形成的集落可被分散成单细胞。这种单细胞化的葡萄藻过滤至0.45 µm的无菌滤膜上，并放置于距18W紫外灯管20 cm处用紫外线照射15 min后再避光3 h，利用低熔点琼脂糖固定及尼罗红显微荧光活体筛检技术，筛选到1株高含脂量的葡萄藻候选突变体。经扩大培养和脂质含量测定[按Rao等（Influence of CO2 on growth and hydrocarbon production in Botryococcus braunii. J. Microbiol. Biotechnol. 2007, 17: 414–419) 干重称量法进行]，此新品系的脂质含量为细胞干重的50.4%，比其出发品系UTEX 572的高51%。
作为实例，我们另选取公知的2株脂质含量分别为32.6%和28.8%的葡萄藻品系UTEX 2441和UTEX B2629来验证本发明的实用性。利用本发明方法，UTEX 2441和UTEX B2629分别经15 s和25 s超声处理制得单细胞，放置于距18W紫外灯管20 cm处用紫外线照射15 min后再避光3 h，利用低熔点琼脂糖固定及尼罗红显微荧光活体筛检技术，分别选育出1株含脂量比UTEX 2441的高43%，以及1株含脂量比UTEX B2629的高46%的高含脂葡萄藻新品系。这些例子进一步说明，本发明建立的高脂质含量葡萄藻新品系的选育方法是有效和实用的。
Claims (5)
1.一种高脂质含量葡萄藻新品系的选育方法，其特征在于，该方法是：将葡萄藻液置于离心管，加入微粒型的黄单胞多糖，然后置于冰水浴中，并用超声波将由几十至上百个细胞形成的葡萄藻集落制备成单细胞；单细胞化的葡萄藻经紫外线辐射诱变及低熔点琼脂糖固定化培养后，利用尼罗红显微荧光活体筛检技术获得高含脂量的葡萄藻候选突变体；再经扩大培养和脂质含量测定选育出高脂质含量的葡萄藻新品系；所述的低熔点琼脂糖是指在多糖链上引入羟乙基后的琼脂糖；所述的高脂质含量的葡萄藻是指脂质含量比其出发品系至少高30%的葡萄藻。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，具体包括以下步骤：
(1) 取4 mL待测葡萄藻液于5 mL离心管中，再加入微粒型黄单胞多糖，并置于冰水浴中预冷；微粒型黄单胞多糖的添加量为5粒，0.2mg/粒，共1 mg；
(2) 预冷藻液经超声波处理10 s后，在光学显微镜下观察葡萄藻集落是否已被分散成单细胞；
(3) 若没有，则用每次5 s的超声波进行多次处理，直至被分散成单细胞，由此计算被测葡萄藻液适宜的超声处理时间T=10+5×n，单位为s，其中n为每超声处理5 s的次数；
(4) 用孔径为0.45 µm的无菌滤膜过滤藻液使藻细胞均匀平铺于滤膜上，并用紫外线进行诱变处理；
(5) 将滤膜上的藻细胞转移至培养液中，并使其560 nm的光密度D560为0.05，转入10 ml的PE管中，每管装4 ml，并置于37℃水浴中保温；
(6) 用低熔点琼脂糖固定细胞，并置于25℃光照培养箱中培养30 d；
(7) 将含藻细胞的低熔点琼脂糖凝胶切成1 mm厚的圆片，并置于含2%(V/V)二甲基亚砜和1 µg/mL尼罗红的染色液中于黑暗下40℃染色10 min；
同时，按上述步骤制备对照组，其中省去步骤(4)中用紫外线诱变处理藻细胞；
(8) 取1片染色后的对照组藻细胞的凝胶片并展到载玻片上，置于荧光显微镜上用蓝光激发，通过调节荧光显微镜上蓝色激发光电流调控旋钮调节激发光强度直至能看到具红色荧光的葡萄藻细胞，再通过调节荧光显微镜上蓝色激发光电流调控旋钮逐渐调低激发光的强度，至显微视野中藻细胞的荧光刚好消失，记下电流表上表征此时蓝色激发光强度的电流值I，继续调节蓝色激发光电流调控旋钮使电流表的电流值降至2I/3，保持此时旋钮的位置不变；
(9) 将经紫外线诱变的藻细胞的凝胶片用尼罗红染色后展到载玻片上，并置于荧光显微镜上用调节好光强度的蓝光激发，当观察到具红色荧光的藻细胞时，用接种针挑取相应的凝胶块，并置于含1 ml培养液的2 ml PE管中，用频率为20 kHz、发射功率为100 W、以1 s/ 1 s 的开/关间歇的超声波处理20 s以粉碎凝胶块，再置于25℃光照培养箱中培养30 d，即获得高脂质含量的葡萄藻新品系。
3.据权利要求2所述的方法，其特征在于，在步骤（2）或（3）中制备葡萄藻单细胞时，设定超声波仪的频率为20 kHz，发射功率为100 W，将Φ2型变幅杆前端2 cm浸入预冷藻液，以1 s / 1 s 的/关间歇超声处理15~25 s。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，在步骤（4）中，所述诱变处理是：将滤膜上的藻细胞放置于距18W紫外灯管20 cm处，用紫外线照射15 min，再避光3 h。
5.据权利要求2所述的方法，其特征在于，在步骤（6）中，使用与藻液等体积的浓度为2%、65℃的低熔点琼脂糖进行固定藻细胞。
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| CN103834567A (zh) * | 2014-02-26 | 2014-06-04 | 新奥科技发展有限公司 | 一种微藻培养方法 |
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