CN113025665B - 一种利用赤潮藻和溶藻菌生产生物柴油的方法 - Google Patents

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Abstract

一种利用赤潮藻和溶藻菌生产生物柴油的方法，涉及生物柴油。将赤潮藻细胞接入f/2培养基中，于光照培养室中静置培养；将杀藻菌Y42于液体培养基培养，获取无菌上清液；将无菌上清液加入东海原甲藻培养液中中继续培养，氧化脂肪酸，裂解赤潮藻细胞；采用旋转蒸发法反复萃取裂解后的藻液，干燥后得粗脂提取物；油脂甲酯化，得生物柴油生产原料。运用溶藻菌株Y42上清液裂解藻细胞，不仅简化下游提取的裂藻工艺，节省生产成本，还能改变其油脂组成，有效降低藻细胞油脂不饱和度，使油脂IV<120，CN>47，使油脂组成适合于生物柴油生产。杀藻菌处理72h后能裂解90％以上的藻细胞，有利于生物柴油的开发，实现变害为宝。

Description

一种利用赤潮藻和溶藻菌生产生物柴油的方法
技术领域
本发明涉及生物柴油，尤其是涉及一种利用赤潮藻和溶藻菌生产生物柴油的方法。
背景技术
生物质能源作为一种来源广泛的可再生能源，其开发利用不仅有助于缓解化石燃料日益枯竭给全球经济发展带来的危机，还可避免对环境的污染。近年来，藻类作为一种新型能源原料的优势显而易见，得到广泛关注。藻类是水生类植物，不会占用耕地或者畜牧业面积；生长环境简单，所需养分主要是阳光、水和CO2，固定的CO2能转化为油脂或淀粉，从而缓解温室效应，利于环保。藻类生长周期短，繁殖速度快,产量非常高，无根、茎、叶等，不产生无用的生物量，易于粉碎和干燥，生产工艺简单；产生的脂肪酸分子一般为14～20个碳链，与柴油分子的碳数相近(彭金荣，李春红.国外战略性新兴产业的发展态势及启示.改革与战略，2011，27：167-171；王新新.战略性新兴产业发展的国际经验及启示.科技管理研究，2011，12：90-95)；因此，微藻生物柴油获得了巨大的关注，具有广阔的应用前景。
富油藻种的筛选是用微藻生产生物柴油最关键的前提，筛选到适合的藻种，能够在后期的研发过程中起到事半功倍的效果。富油微藻通常指体内油脂含量超过20％干重的微藻种类(Griffiths M J,Harrison S T L.Lipid productivity as a keycharacteristic for choosing algal species for biodiesel production[J].Journalof Applied Phycology,2009,21(5):493-507)。微藻细胞可以通过光合作用把二氧化碳转化成微藻自身生物质，再通过一系列生化反应转变成油脂、蛋白质、维生素等有机物。通常在培养周期的平台期，微藻细胞会大量积累脂肪酸，其含量占干重20％以上(ChistiY.Biodiesel from microalgae[J].Biotech Advances,2007,25:294-306)，在逆境环境下，如缺氮、缺磷条件下，脂肪酸含量可以达到细胞干重的80％(Yang Z K，etal.Molecular and cellular mechanisms of neutral lipid accumulation in diatomfollowing nitrogen deprivation.Biotechnol.Biofuels,2013,6(1):67-.doi:10.1186/1754-6834-6-67；Feng T Y et al.Examination of metabolic responses tophosphorus limitation via proteomic analyses in the marine diatomphaeodactylum tricornutum.Sci.Rep.,2015,28；5:10373.doi:10.1038/srep10373)。1978～1996年，美国Aquatic Species Program对从湖泊和近海中采集的3000多株藻的产油效率进行分析之后，从中筛选出约300株可用藻种，大部分是绿藻和硅藻。目前研究和生产中常用的能源微藻有：三角褐指藻、微拟球藻、小球藻等。
海洋微藻作为最具潜力的生物柴油原料很值得深入研究。大批量工业化产油的微藻种类并不多，所以发现新的优秀藻种十分必要。
随着人口和经济的快速增长，以及全球气候日渐变暖，沿海和湖泊地区对自然资源掠夺式利用和水质环境退化的危机日益加剧，导致赤潮不断爆发。我国有着广阔的领海，海岸线长达3.2万公里(周名江,朱明远,中国赤潮的发生趋势和研究进展,生命科学,13(2001)54-59)，赤潮灾害已经成为影响我国海洋经济的重要因素之一。多年的现场调查表明,我国海区频繁发生原甲藻赤潮，第一优势种为东海原甲藻(Prorocentrumdonghaiense)。东海原甲藻为我国东海及日本、韩国海域所特有的一种甲藻，由东海原甲藻引发的赤潮几乎每年都会在东海出现，呈现面积大、时间长的特点。2010～2019年，由东海原甲藻引发的赤潮超过120次，影响面积超过30000平方公里，不仅严重破坏了海洋的生态环境，还威胁到长江口及其邻近海域的渔业生产和水产食品的食用安全，引起广泛关注(叶属峰，纪焕红，曹恋，黄秀清.长江口海域赤潮成因及其防治对策.海洋科学,2004,28(5)：26-32；中国海洋灾害公报(2010-2019)http://www.mnr.gov.cn/sj/sjfw/hy/gbgg/zghyzhgb/)。因此，东海原甲藻研究已成为赤潮生物学的热点之一(戴鑫烽陆斗定等。2010—2011年东海藻华高发区水体层化对东海原甲藻(Prorocentrum donghaiense Lu)藻华的影响，海洋与湖沼，2014，45(2)：217-224)。目前，对东海原甲藻赤潮的研究大多是集中在东海原甲藻的生长动力学、生活史、生态、赤潮形成成因和赤潮防治等方面，而对其生理代谢尤其是代谢产物的研究和开发利用则是非常匮乏。由于东海原甲藻为我国特有的赤潮优势藻种，国外的相关研究报道也不多。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术存在的细胞破机械碎成本高等问题，提供节省能源，改变油脂组分，简化下游裂藻提取工艺的一种利用赤潮藻和溶藻菌生产生物柴油的方法。
本发明包括以下步骤：
1)将赤潮藻细胞接入f/2培养基中，于光照培养室中静置培养；
2)将杀藻菌Y42于液体培养基培养，获取无菌上清液；
3)将无菌上清液加入步骤1)东海原甲藻培养液中中继续培养，氧化脂肪酸，裂解赤潮藻细胞；
4)采用旋转蒸发法反复萃取裂解后的藻液，干燥后得粗脂提取物；
5)油脂甲酯化，得生物柴油生产原料。
在步骤1)中，所述赤潮藻采用东海原甲藻，由厦门大学近海海洋环境科学国家重点实验室提供，可购买；所述培养的具体方法可为：将东海原甲藻细胞按1～1.5×105/L的浓度接入f/2培养基中，于光照培养室中静置培养，培养条件为温度20～27℃，光照周期12h：12h(L/D)，光照强度为50～200μmol photons m-2s-1，每天振摇1～2次，用尼罗红染色方法监测细胞油脂含量变化，直至尼罗红荧光不再增强；所述培养的时间可为16～18天。
在步骤2)中，所述杀藻菌Y42为Paracoccus sp.Y42，已于2021年02月20日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，邮编：510070，保藏中心登记入册编号：GDMCC No.61473；
所述将杀藻菌Y42于液体培养基培养，获取无菌上清液的具体方法可为：从固体2216E平板中挑单克隆Paracoccus sp.Y42菌株，接种于1～10mL 2216E液体培养基中培养过夜，然后将过夜培养的菌液按1～10％(v/v)的接种量接种于2216E液体培养基中培养48～72h至稳定期，6,000～10,000rpm离心5～10min，弃沉淀，收集培养液的上清，并用0.22μm无菌滤膜过滤收集的菌培养液上清，收集的无菌上清可直接加入藻细胞或-20～-80℃保存备用。
在步骤3)中，所述裂解赤潮藻细胞的具体方法可为：将步骤2)过滤收集的无菌上清液按3～10％(v/v)的浓度加入步骤1)培养的东海原甲藻培养液中，混匀，在原培养条件下继续培养12～72h，对藻细胞形成氧化胁迫环境，将细胞内高含量的不饱和脂肪酸氧化，降低油脂不饱和度，12～72h后用显微镜检查细胞裂解率，裂解率达90％后可进入下一步骤。
在步骤4)中，所述得粗脂提取物的具体方法可为：向步骤3)裂解后的藻液中加入氯仿甲醇混合液，磁力搅拌混合，加入饱和氯化钠溶液，静置，离心，取下层有机相液体转入旋转蒸发瓶内；在残留的上层溶液加入氯仿，磁力搅拌混匀，然后加入饱和氯化钠溶液，静置，离心，取下层有机相液体转入旋转蒸发瓶内；重复萃取至下层有机溶液无色；合并旋转蒸发瓶内的溶液并置于旋转蒸发仪上旋转蒸发，至瓶中液体蒸发完全，瓶内干燥物即为粗脂提取物；
在步骤4)中，所述氯仿甲醇混合液中氯仿︰甲醇＝2︰1；所述氯仿甲醇混合液的加入量按体积百分比可为藻液的20％；所述磁力搅拌混合的时间可为1h；所述饱和氯化钠溶液的加入量按体积百分比可为有机相的2％；所述静置的时间可为30min；所述离心可于4℃，8,000～10,000rpm，离心8～15min；所述氯仿的加入量按体积百分比可为残留的上层溶液的10％；所述重复萃取的次数可为至少3次；所述旋转蒸发的条件为水浴温度50～60℃，转速80～100r/min，时间10～20min。
在步骤5)中，所述油脂甲酯化的具体方法可为：用合适体积的氯仿将旋转蒸发瓶中的样品溶解，移至玻璃试管中，再将氯仿蒸干；向玻璃试管中加入1％H2SO4的甲醇溶液，60～80℃水浴1～2h。室温冷却后，加入合适体积的正己烷和5倍于正己烷体积的双蒸水，混匀后静置分层，弃下层液体，收集的上层液体即为生物柴油生产原料；氯仿︰甲醇溶液︰正己烷︰双蒸水︰藻液＝2～3mL︰1mL︰1mL︰5mL︰100mL。
本发明发现赤潮优势藻种东海原甲藻在生长平台期能大量积累油脂，油脂含量可达细胞干重的50％以上，且PUFA含量丰富，尤其是DHA含量接近20％，可用于保健品DHA的生产。本发明分离获得能裂解东海原甲藻细胞的杀藻菌株Paracoccus sp.Y42，可以用于藻细胞的裂解，能简化细胞裂解工艺，降低生产成本。5％杀藻菌株Y42的培养上清液处理72h后，藻细胞破壁率可达到90％以上，而油脂含量与对照组相比无显著性差异(p>0.05)，分别为124mg/L和119mg/L，说明杀藻菌裂解藻细胞后对藻细胞的油脂总量没有影响。因此，通过杀藻菌Y42裂解细胞壁可以降低油脂提取过程中的破壁处理成本，是一种高效、低成本的裂解藻细胞的方法。
本发明运用溶藻菌株Y42上清液裂解藻细胞，不仅可以简化下游提取的裂藻工艺，节省生产成本，还能改变其油脂组成，有效降低藻细胞油脂不饱和度，使油脂IV<120，CN>47，使油脂组成适合于生物柴油的生产。同时，杀藻菌处理72h后能裂解90％以上的藻细胞，大大简化下游提取裂藻工艺，节省能源；本发明有利于生物柴油的开发，实现变害为宝。
附图说明
图1为东海原甲藻细胞生长曲线及油脂含量积累图。
图2为东海原甲藻细胞油脂含量变化图。其中，a为培养第16的细胞，b为培养第16的细胞内油脂分布。
图3为东海原甲藻细胞培养至第16天的藻细胞内油脂滴的超显微结构图。
图4为杀藻菌株Paracoccus sp.Y42的鉴定。其中，图a为菌株Y42的扫描电镜图，b为透射电镜图。
图5为杀藻菌株Paracoccus sp.Y42的系统分类鉴定图。
图6为不同浓度杀藻菌Paracoccus sp.Y42培养上清对藻细胞的杀藻率。
图7为5％杀藻菌培养上清处理前(a)、处理后(b)的藻细胞形态(bars＝25μm)。
图8为不同浓度的菌株Y42上清液处理后藻细胞总油脂含量变化。
图9为不同浓度的菌株Y42上清液处理后藻细胞油脂成分变化。
具体实施方式
以下实施例将结合附图对本发明作进一步的说明。
1.材料与方法
1.1藻种及培养：本发明实施例所用的藻种为东海原甲藻(Prorocentrumdonghaiense)，保藏在厦门大学近海海洋环境科学国家重点实验室(株系号：364，分离于东海长江口)，可购买。于f/2液体培养基中以4％的接种量培养，并于室温20～27℃、光照强度为50～200μmoL photons m-2s-1的光暗(12h/12h)条件下培养。
表1 f/2培养基主要成分
1.2溶藻菌株及培养：
溶藻菌株Paracoccus sp.Y42从漳州红树林国家自然保护区分离获得，已于2021年02月20日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，邮编：510070，保藏中心登记入册编号：GDMCC No.61473；按1％的比例接种于100mL的2216E液体培养基中，在30℃，150rpm的恒温摇床中培养48～72h。
表2 Zobell 2216E培养基主要成分
1.3所用试剂：
尼罗红试剂产自广州和为化工有限公司；氯仿、甲醇和硫酸溶液等有机试剂购自上海国药集团；正己烷购自为西陇化工股份有限公司；正十九酸甲酯，为SIGMA-ALDRICH公司所产试剂。
1.4所需仪器设备
表3所需主要仪器
1.5实验方法
1.5.1正常培养下东海原甲藻细胞生长的测定
1)以初始细胞密度为10,000个/mL转接至灭菌后的500mL f/2培养基中，设3个生物学重复，光照培养室中静置培养，培养条件为温度20～27℃，光照周期12h：12h(L/D)，光照强度为50～200μmol photons m-2s-1，每天振摇1～2次。
2)分别于2、4、6、8、10、13、16和20天取样用细胞计数仪测定细胞密度。
1.5.2正常培养下东海原甲藻油脂积累的荧光检测
1)东海原甲藻培养8、12、16、18、20天取样，取1mL藻液于EP管中，放入离心机5,000rpm、5min离心，除去上清后用500μL0.1 M PBS清洗重悬沉淀，再次重复上述操作。
2)加浓度为0.1mg/mL的尼罗红染料3μL，用锡箔纸包住EP管避光染色，染色8min后5,000rpm、5min离心，除去上清用500μL PBS清洗，再次重复上述操作，得到藻细胞沉淀。
3)取一部分藻细胞沉淀，用少量PBS重悬，在荧光显微镜下观察拍照。
4)取剩下一部分藻细胞沉淀，加入800μL PBS重悬，将藻细胞重悬液加入到流式管中，在流式细胞仪Fortessa上分析。
1.6油脂含量的测定和脂肪酸成分分析
1.6.1碳十九脂肪酸标准曲线的测定
1)分别准确称取0、0.2、0.6、1和1.6mg碳十九脂肪酸样品，用3mL氯仿溶解后转移至玻璃试管中，再将氯仿悬干。
2)向玻璃试管中加入2mL 1％H2SO4的甲醇溶液，80℃水浴1h。
3)室温冷却后，加入2mL正己烷，5mL双蒸水，等待静置12h分层。
4)吸取上清(正己烷层)至棕色气相瓶中，最后进行GC-MS检测。采用Finnigan GC-MS Trace DCQ进行分析，色谱柱为DB-5(0.125mm×30m×0.125μm)，程序升温：150℃恒温1min，以3℃/min升温速率至250℃，并保留2min。进样口温度为250℃，气化室温度为250℃，离子源温度为250℃，载气为氦气，流速0.18mL/min，分流比为1︰10，进样量1μL。
5)计算C19峰面积，并通过相应浓度绘制标准曲线。
1.6.2藻细胞细胞内油脂含量测定
1)东海原甲藻培养至稳定后期(第20天)尼罗红荧光不再增强后，离心(5,000rpm，6min)收集藻细胞，并将藻细胞冻干称重。称取100mg左右冷冻干燥的藻粉，转移至50mL离心管中，加入4mL蒸馏水，振荡混匀后，使用超声破碎仪(SCIENTZ JY92-Ⅱ，China)进行破碎；条件设置为功率200w，工作时间5s，间隔时间5s，循环99次。
2)加入0.2mg碳十九脂肪酸(WC19)作为内标，磁力搅拌混匀；然后加入12mL氯仿︰甲醇(2︰1)的混合液，于旋涡振荡器上振荡混合20min。
3)加入适量饱和氯化钠溶液，静置30min；4℃，8,000g，离心10min，取下清液于称完重的旋转蒸发瓶内(W1)。
4)残留物加入6mL氯仿，振荡重悬混匀20min，重复步骤3，此操作重复至少3次。
5)将装有粗脂提取液的旋转蒸发瓶置于旋转蒸发仪上旋转蒸发，条件设置为水浴温度50～60℃，转速80～100r/min，持续时间为8～15min。
6)旋转蒸发完将瓶身擦拭干净，冷却称重(W2)，得出粗提物重量。
7)脂肪酸成分分析：
a.将旋转蒸发瓶中的样品用3mL氯仿溶解后转移至玻璃试管中，再将氯仿悬干。
b.后续步骤同上述1.6.1方法中2)～4)步骤。
8)根据标准曲线得出碳十九脂肪酸的萃取量(W)后，计算东海原甲藻胞内油脂含量。计算公式如下所示：
油脂含量(％)＝(W2-W1-W)/(W/WC19)÷藻细胞干重×100％
WC19：添加的C19内标重量；W：C19实际萃取所得重量；
W1：空旋瓶重量；W2：旋瓶加油脂粗提物的重量
1.7菌株Y42处理东海原甲藻后细胞油脂含量和脂肪酸成分分析
1)将生长至稳定后期的藻细胞分装于三角瓶中，每瓶分装100mL藻液，每组设三个平行，在原有的条件下培养24h以适应生长。
2)将杀藻菌Y42接种到液体2216E培养基，培养72h至稳定期，8,000rpm，离心8～15min收集上清，并用0.22μm无菌滤膜过滤收集菌培养液上清。
3)对照组为正常生长添加5％无菌的2216E培养基的藻液；处理组则在藻液中分别添加1％，3％，5％(v/v)的步骤2)所获得的Y42培养上清液，处理72h后，取样检测藻裂解效果，计算杀藻率。
4)于72h收样测定东海原甲藻的油脂含量：
对照组，1％和3％处理组：藻细胞用超声破碎仪(SCIENTZ JY92-Ⅱ，China)进行破碎；条件设置为功率200w，工作时间5s，间隔时间5s，循环99次。
破碎完全后加入0.5mg碳十九脂肪酸作为内标，磁力搅拌混匀；
5％处理组：不用破碎，在100ml藻液中直接加入0.5mg碳十九脂肪酸作为内标，磁力搅拌混匀。
5)向上述各组中分别加入20mL氯仿︰甲醇(2︰1)的混合液，磁力搅拌混合1h，然后加入适量饱和氯化钠溶液，静置30min。
6)4℃，8,000rpm，离心10min，取下清液于称完重的旋转蒸发瓶(W1)内。
7)残留溶液加入10mL氯仿，磁力搅拌混匀1h，然后加入适量饱和氯化钠溶液，静置30min，重复步骤5)，此操作重复至少3次。
8)将装有粗脂提取液的旋转蒸发瓶置于旋转蒸发仪上旋转蒸发，条件设置为水浴温度55℃，转速90r/min，持续时间为15min。
9)旋转蒸发完将瓶身擦拭干净，冷却称重(W2)，得出粗提物重量。
10)脂肪酸成分分析：
a.将旋转蒸发瓶中的样品用3mL氯仿溶解后转移至玻璃试管中，再将氯仿悬干。
b.后续步骤同第1.6.1步骤2)～4)。
11)根据标准曲线得出碳十九脂肪酸的萃取量(W)后，计算东海原甲藻产生的总油脂含量。计算公式如下所示：
油脂含量(mg/L)＝(W2-W1-W)/(W/WC19)÷藻细胞培养体积(L)
WC19：添加的C19内标重量；W：C19实际萃取所得重量；
W1：空旋瓶重量；W2：旋瓶加油脂粗提物的重量
1.8油脂品质的评价
油脂的皂化值(saponification valueSV)，碘值(iodine value IV)和十六烷值(cetane number，CN)反映柴油品质,根据以下公式计算(Cho K,Lee CH,Ko K,Lee YJ,KimKN,Kim MK,Chung YH,Kim D,Yeo I-K,Oda T:Use of phenol-induced oxidative stressacclimation to stimulate cell growth and biodiesel production by the oceanicmicroalga Dunaliella salina.Algal Research 2016,17:61-66；Mandotra SK,Kumar P,Suseela MR,Ramteke PW:Fresh water green microalga Scenedesmus abundans:apotential feeds for high quality biodiesel production.Bioresour Technol 2014,156:42-47.)：
DU＝(MUFA,wt％)+(2×PUFA,wt％)
IV＝Σ(254×F×D)/Mw
SV＝Σ(560×F)/Mw
CN＝(46.3+5458/SV)–(0.225×IV)
其中，DU表示不饱和度(degree of unsaturation)；MUFAs表示单不饱和脂肪酸(monounsaturated fatty acids)；PUFAs表示多不饱和脂肪酸(polyunsaturatedfattyacids)；F表示每种脂肪酸的百分含量；Mw表示脂肪酸的分子量；D表示脂肪酸中的双键数。.
2、结果
2.1东海原甲藻生长曲线及细胞油脂含量变化
为了探究东海原甲藻的产油能力，采用尼罗红染色的方法通过荧光显微镜和流式细胞仪测定了东海原甲藻的生长情况和油脂含量。如图1所示，正常条件下培养的东海原甲藻迟缓期为2天，藻细胞数为0.8×105个/mL左右，从第3天开始藻细胞进入对数生长期，该时期藻细胞内油脂含量少；第8天藻细胞进入生长稳定期，第12天油脂含量显著增加，培养至第18天，油脂含量达到最大值，是第8天的6倍。从图2中可看到第16天的细胞内被尼罗红染色的油脂滴多，跟流式检测数据一致。在透射电子显微镜下也观察到培养第16天的藻细胞内部油脂滴积累(图3，箭头所示)，这说明东海原甲藻是具有产油能力。
2.2东海原甲藻细胞油脂含量和脂肪酸成分分析
东海原甲藻细胞油脂含量高，可达细胞干重的50％以上，日产油脂量为85.76mg·L-1·d-1(表3)，属于富油藻种。其油脂成分种类丰富，其中SAF含量为53.7％，PUFA含量达到40.9％，而MUFA含量较低，仅为5.33％。尤以棕榈酸C16:0、C18:5n3和C22:6(DHA)三者含量居多，分别占38.51％、12.51％、10.07％和19.7％(表4)。通过对油脂成分分析可知，东海原甲藻细胞PUFA含量高，不饱和度高达87.05％，油脂的IV值为172，高于生物柴油标准(IV<120)，CN值为36，低于生物柴油标准(CN>47)，不适于作为生物柴油的生产原料。但是由于其PUFA含量高，尤其是DHA(C22:6)含量近20％，可作为保健品生产原料。
表3东海原甲藻的油脂含量和日产量
表4东海原甲藻油脂组成成分和品质分析
2.3杀藻菌Y42上清液对藻细胞的油脂含量及脂肪酸成分的影响
上世纪70年代国外就开始进行微藻生物柴油的开发，但是由于油脂提取成本尤其是细胞破机械碎成本高，导致微藻生物能源的开发受限，急需寻求一种降低下游提取成本的方法。前期研究中我们分离获得了能裂解东海原甲藻细胞的杀藻菌株Paracoccussp.Y42(图4和5)，可以用于藻细胞的裂解，能简化细胞裂解工艺，降低生产成本。如图6和7所示，5-10％杀藻菌株Y42的培养上清液处理72h后，藻细胞破壁率可达到90％以上，而油脂含量与对照组相比无显著性差异(p>0.05，图8)，说明杀藻菌裂解藻细胞后对藻细胞的油脂总量没有影响。因此，通过杀藻菌Y42裂解细胞壁可以降低油脂提取过程中的破壁处理成本，是一种高效、低成本的裂解藻细胞的方法。
2.4杀藻菌Y42上清对细胞脂肪酸成分的影响
为了研究杀藻菌Y42上清液对油脂品质的影响，通过GC-MS对各组的脂肪酸成分进行分析，结果如图9所示，正常培养的藻细胞SAF含量为56.3％，PUFA含量达到37.5％，而MUFA含量较低，仅为6.21％。3％和5％的Y42上清液处理的东海原甲藻细胞脂肪酸成分占比明显改变，SAF含量显著升高，达到73％以上，MUFA含量也分别提高到17.4％和22.1％，而PUFA含量则下降到8.92％和7.04％。其中C16:0、C18:0和C18:1明显升高，C16:0由原来的38.51％提升至48.91％和56.27％，C18:1由原来的2.49％提高至9.32％和20.04％，而PUFA中的C18:5和C22:6大幅度降低，C18:5由10.07％降至1.05％和0％，C22:6由17.96％降至4.17％和2.34％。3％和5％的Y42上清液处理组的脂肪酸不饱和度(DU)明显下降，碘值(IV)分别为46.47和30.81(低于120)，而辛烷值(CN)则为66.36和66.04(高于47)，完全符合生物柴油的生产标准。Y42胁迫下细胞肪酸成分及总脂中SFA、MUFA和PUFA比较见表5。
表5 Y42胁迫下细胞肪酸成分及总脂中SFA、MUFA和PUFA比较
2.5杀藻菌Y42处理东海原甲藻细胞，降低油脂不饱和度，简化生物柴油提取下游步骤的工艺
根据上述实验结果，利用杀藻菌Y42改变东海原甲藻油脂组分，裂解细胞生产生物柴油的具体方法步骤如下：
2.5.1东海原甲藻细胞的培养：
将东海原甲藻细胞按1～1.5×105/L的浓度接入f/2培养基中(表1)，于光照培养室中静置培养，培养条件为温度20～27℃，光照周期12h：12h(L/D)，光照强度为50～200μmol photons m-2s-1，每天振摇1～2次。培养12天开始用尼罗红染色方法监测细胞油脂含量变化，直至尼罗红荧光不再增强(一般为培养第16～18天)。
2.5.2杀藻菌Y42的培养和菌上清液的获取：
从固体2216E平板中挑单克隆Y42菌株，接种于4mL 2216E液体培养基(表2)中培养过夜。然后将过夜培养的菌液按1％(v/v)的接种量接种于2216E液体培养基中培养72h至稳定期，8,000rpm离心8～15min，弃沉淀，收集培养液的上清，并用0.22μm无菌滤膜过滤收集的菌培养液上清。收集的无菌上清可直接加入藻细胞或-20～80℃保存备用。
2.5.3杀藻菌Y42处理藻细胞，氧化脂肪酸和裂解藻细胞：
将过滤收集的无菌上清液按5％(v/v)的浓度加入培养16～18天的东海原甲藻培养液中，混匀，在原培养条件下继续培养72h，对藻细胞形成氧化胁迫环境，将细胞内高含量的不饱和脂肪酸氧化，降低油脂不饱和度。72h后用显微镜检查细胞裂解率。
2.5.4粗脂提取
镜检藻细胞裂解率达90％以上后，向裂解的藻液中加入20％(v/v)的氯仿︰甲醇(2:1)的混合液，磁力搅拌混合1h，然后加入适量饱和氯化钠溶液(有机相的2％，v/v)，静置30min。然后于4℃，8,000g，离心10min，取下层有机相液体转入旋转蒸发瓶内。在残留的上层溶液加入10％氯仿，磁力搅拌混匀1h，然后加入适量饱和氯化钠溶液，静置30min，于4℃，8,000rpm，离心8～15min，取下层有机相液体转入旋转蒸发瓶内。此操作重复至萃取的下层有机溶液无色(至少3次)。合并旋转蒸发瓶内的溶液并置于旋转蒸发仪上旋转蒸发，条件设置为水浴温度50～60℃，转速90r/min，持续至瓶中液体蒸发完全(时间为15min或更长，与收集到的液体体积有关)，瓶内干燥样品为粗脂提取物。
2.5.5油脂的甲酯化
用合适体积的氯仿(2～3mL/100mL藻液)将旋转蒸发瓶中的样品溶解，移至玻璃试管中，再将氯仿蒸干。向玻璃试管中加入1％H2SO4的甲醇溶液(1mL/100mL藻液)，80℃水浴1h。室温冷却后，加入合适体积的正己烷(1mL/100mL藻液)和5倍于正己烷体积的双蒸水，混匀后静置分层，弃下层液体，收集的上层液体即为生物柴油生产原料。
综上，本发明研究发现赤潮优势藻种东海原甲藻在生长平台期能大量积累油脂，油脂含量可达细胞干重的50％以上，且PUFA含量丰富，尤其是DHA含量接近20％，可用于保健品DHA的生产。本发明运用溶藻菌株Y42上清液裂解藻细胞，不仅可以简化下游提取的裂藻工艺，节省生产成本，还能有效降低藻细胞油脂不饱和度，使油脂IV<120，CN>47，有利于生物柴油的开发，实现变害为宝。

Claims (8)

1.一种利用赤潮藻和溶藻菌生产生物柴油的方法，其特征在于包括以下步骤：
1）将赤潮藻细胞接入f/2培养基中，于光照培养室中静置培养；所述赤潮藻采用东海原甲藻；所述培养的具体方法为：将东海原甲藻细胞按1~1.5×105/L的浓度接入f/2培养基中，于光照培养室中静置培养，培养条件为温度20~27℃，光照周期12 h：12 h，光照强度为50~200 μmol photons m−2 s−1，每天振摇1 ~ 2 次，用尼罗红染色方法监测细胞油脂含量变化，直至尼罗红荧光不再增强；所述培养的时间为16~18天；
2）将杀藻菌Y42于液体培养基培养，获取无菌上清液；所述杀藻菌Y42为Paracoccus sp. Y42，已于2021年02月20日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏中心登记入册编号：GDMCC No.61473；
3）将无菌上清液加入步骤1）东海原甲藻培养液中继续培养，氧化脂肪酸，裂解赤潮藻细胞；
4）采用旋转蒸发法反复萃取裂解后的藻液，干燥后得粗脂提取物；
5）油脂甲酯化，得生物柴油生产原料。
2.如权利要求1所述一种利用赤潮藻和溶藻菌生产生物柴油的方法，其特征在于在步骤2）中，所述将杀藻菌Y42于液体培养基培养，获取无菌上清液的具体方法为：从固体2216E平板中挑单克隆Paracoccus sp. Y42菌株，接种于1~10mL 2216E液体培养基中培养过夜，然后将过夜培养的菌液按1~10%（v/v）的接种量接种于2216E液体培养基中培养48~72 h至稳定期，6,000~10,000 rpm离心5~10 min，弃沉淀，收集培养液的上清，并用0.22 μm无菌滤膜过滤收集的菌培养液上清，收集的无菌上清直接加入赤潮藻藻细胞或-20~-80℃保存备用。
3.如权利要求1所述一种利用赤潮藻和溶藻菌生产生物柴油的方法，其特征在于在步骤3）中，所述裂解赤潮藻细胞的具体方法为：将步骤2）过滤收集的无菌上清液按3~10%（v/v）的浓度加入步骤1）培养的东海原甲藻培养液中，混匀，在原培养条件下继续培养12~72h，对藻细胞形成氧化胁迫环境，将细胞内高含量的不饱和脂肪酸氧化，降低油脂不饱和度，12~72h后用显微镜检查细胞裂解率，裂解率达90%后进入下一步骤。
4.如权利要求1所述一种利用赤潮藻和溶藻菌生产生物柴油的方法，其特征在于在步骤4）中，所述得粗脂提取物的具体方法为：向步骤3）裂解后的藻液中加入氯仿甲醇混合液，磁力搅拌混合，加入饱和氯化钠溶液，静置，离心，取下层有机相液体转入旋转蒸发瓶内；在残留的上层溶液加入氯仿，磁力搅拌混匀，然后加入饱和氯化钠溶液，静置，离心，取下层有机相液体转入旋转蒸发瓶内；重复萃取至下层有机溶液无色；合并旋转蒸发瓶内的溶液并置于旋转蒸发仪上旋转蒸发，至瓶中液体蒸发完全，瓶内干燥物即为粗脂提取物。
5.如权利要求4所述一种利用赤潮藻和溶藻菌生产生物柴油的方法，其特征在于所述氯仿甲醇混合液中氯仿︰甲醇=2︰1；所述氯仿甲醇混合液的加入量按体积百分比为藻液的20%；所述磁力搅拌混合的时间为1 h；所述饱和氯化钠溶液的加入量按体积百分比为有机相的2%；所述静置的时间为30 min。
6.如权利要求4所述一种利用赤潮藻和溶藻菌生产生物柴油的方法，其特征在于所述离心是于4℃，8,000～10,000 rpm，离心8～15min；所述氯仿的加入量按体积百分比为残留的上层溶液的10%；所述重复萃取的次数为至少3次；所述旋转蒸发的条件为水浴温度50～60℃，转速80～100 r/min，时间10～20 min。
7.如权利要求1所述一种利用赤潮藻和溶藻菌生产生物柴油的方法，其特征在于在步骤5）中，所述油脂甲酯化的具体方法为：用氯仿将旋转蒸发瓶中的样品溶解，移至玻璃试管中，再将氯仿蒸干；向玻璃试管中加入1% H2SO4的甲醇溶液，高温水浴；室温冷却后，加入正己烷和双蒸水，混匀后静置分层，弃下层液体，收集的上层液体即为生物柴油生产原料；所述高温水浴的温度为60～80℃。
8.如权利要求7所述一种利用赤潮藻和溶藻菌生产生物柴油的方法，其特征在于所述高温水浴的时间为1～2 h；所述氯仿︰甲醇溶液︰正己烷︰双蒸水︰藻液=2～3mL︰1 mL︰1 mL︰5 mL︰100 mL。
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