CN101988053A - 聚氨酯泡沫固定海洋杀藻菌sp48的方法 - Google Patents

Abstract

聚氨酯泡沫固定海洋杀藻菌SP48的方法，涉及一种微生物吸附固定方法。提供一种不仅可有效解决包埋法固定化细胞的缺点，而且以聚氨酯泡沫作为吸附载体，可有效持久使海洋杀藻菌SP48表现高效杀藻活性的聚氨酯泡沫固定海洋杀藻菌SP48的方法。将经过制粒、煮沸、烘干的聚氨酯泡沫与杀藻菌培养基共同灭菌后，接入SP48进行摇瓶培养，SP48进入或依附于聚氨酯泡沫内壁生长，形成含海洋杀藻菌SP48的聚氨酯泡沫。采用一定密度及大小的具有强吸附能力、无毒副污染、传质传能效果良好且方便廉价的聚氨酯泡沫吸附固定化SP48，在实际赤潮治理中的应用性能显著提高，使用过后的聚氨酯泡沫通过处理可实现回收利用，具有良好经济效益。

Description

聚氨酯泡沫固定海洋杀藻菌SP48的方法

技术领域

本发明涉及一种微生物吸附固定方法，尤其是涉及一种采用聚氨酯泡沫(polyurethane foam，PUF)作为载体吸附固定海洋杀藻菌Pseudoalteromonas sp.SP48的方法。

背景技术

微生物吸附固定化技术是海洋环境保护领域中一个较新的技术，是依据带电的微生物细胞和载体之间的静电、表面张力和黏附力的作用，而使微生物细胞固定在载体表面和内部形成生物膜的方法。相比普通的包埋技术，吸附固定化技术具有以下优点：可以减少因为氧传递及营养传递等导致的细胞生长迟滞，而且也不会像包埋法一样受到扩大培养的限制，方便应用于工业化生产中。

吸附法的技术关键是选择合适的吸附载体。常用的载体有：活性炭、木屑、硅藻土、聚氨酯泡沫(PUF)等。活性炭不仅具有多孔隙构造、粗糙表面和良好吸附特性，而且原料来源广泛价格低廉([1]程仕伟，董桂秀，郑彬彬，王艺霖.活性炭吸附固定化粪产碱杆菌青霉素G酰化酶[J].生物技术，2009，19(6)：64-66)。而硅藻土孔隙率高、比表面积大、比重小、吸附性强、化学稳定性好等各项优异的理化性质都成为其在吸附固定化应用中的优势([2]王琳，罗启芳.硅藻土吸附固定化微生物对邻苯二甲酸二丁酯的降解特性研究[J].卫生研究，2006，35(1)：23-25)。

有研究表明，PUF具有孔径与细胞尺相比较大，内外表面都能作为固定化吸附界面；空隙率高，便于传质；载体为化学惰性，对细胞不具毒害作用；可与培养基共同灭菌，培养结束后易于迅速获取细胞；处理方便，价格低廉，适合作为工业化固定化载体等特点。由于物理吸附对菌体伤害小，相对包埋法和微胶囊等固定化方法，聚氨醋泡沫固定化培养菌体可以使菌体保持较强的生命力。作为固定化载体，聚氨酯泡沫在环保、发酵及生物柴油制备领域中的应用正受到广泛关注([3]Quek，E.，Ting，Y.-P.，Tan，H.M.Rhodococcus sp.F92 immobilized on polyurethane foam shows ability to degrade various petroleum products[J].Bioresource Technology，2006，97(1)：32-38；[4]欧阳军梅，段学辉，傅奇，牛春铃.聚氨酯泡沫固定产脂肪酶粗状假丝酵母(Candida valida T2)细胞的研究[J].生物加工过程，2008，6(6)：52-57；[5]Ban，K.，Kaieda，M.，Matsumoto，T.，Kondo，A.，Fukuda，H.Whole cell biocatalyst for biodiesel fuel production utilizing Rhizopus oryzae cells immobilized within biomass support particles[J].Biochemical Engineering Journal，2001，8(1)：39-43)。

聚氨酯(polyurethane)是主链含-NHCOO-重复结构单元的一类聚合物，由异氰酸酯(单体)与羟基化合物聚合而成。由于含强极性的氨基甲酸酯基，不溶于非极性基团，具有良好的耐油性、韧性、耐磨性、耐老化性和粘合性。通过不同原料可制得适应较宽温度范围(-50～150℃)的材料，包括弹性体、热塑性树脂和热固性树脂；高温下不耐水解，亦不耐碱性介质。用聚氨酷泡沫作为固定化载体时，由于吸附载体的孔径尺寸相对细胞直径比较大，吸附作用不仅仅发生在载体外表面，孔径内表面也会为细胞生长提供充分的吸附界面，促进菌体的生长([6]Ory，I.d.，Romero，L.E.，Cantero，D.Optimization of immobilization conditions for vinegar production.Siran，wood chips and polyurethane foam as carriers for Acetobacter aceti[J].Process Biochemistry，2004，39(5)：547-555)。

赤潮是在特定的环境条件下，海水中某些浮游植物、原生动物或细菌爆发性增殖或高度聚集而引起水体变色的一种有害生态现象，它作为一种严重的全球性海洋灾害，对公众健康、海洋环境、水产业和自然资源造成了严重负面影响，也由此引发针对赤潮治理的广泛研究。赤潮生消是一个复杂的生态变化的过程，是诸多因素如理化、生物、气象、水文、海况等因子综合作用的结果。关于赤潮的治理方向，主要包括物理法、化学法以及生物方法。根据国际上对赤潮防治剂“高效、低毒、价廉、易得”的要求，目前采用的物理化学防治方法多数不太理想，因此，人们把更多的目光投向了生物方法。

利用生物(包括动物、植物和微生物)相互之间的生态关系来消除赤潮的方法称为生物法。目前利用生物治理赤潮的方法主要有：利用培养的浮游动物桡足类或者双壳贝类等摄食赤潮藻；利用微生物(包括细菌和藻类病毒)治理赤潮；利用生物絮凝剂防治赤潮。其中微生物治理方面，藻菌关系在赤潮生消过程中起着潜在的调控作用，而细菌杀藻现象的发现证明杀藻细菌可能是调控赤潮的主要因素之一([7]郑天凌，苏建强.海洋微生物在赤潮生消过程中的作用[J].水生生物学报，2003，27(3)：291-295)。

至今发现细菌的溶藻方式主要有两种：直接接触溶藻、释放物质杀藻。

研究表明，海洋杀藻假交替单胞菌Pseudoalteromonas sp.SP48是通过释放活性物质间接抑制溶解赤潮塔玛亚历山大藻的([8]Su，J.Q.，Yang，X.R.，Zheng，T.L.，Tian，Y.，Jiao，N.Z.，Cai，L.Z.，Hong，H.S.Isolation and characterization of a marine algicidal bacterium against the toxic dinoflagellate Alexandrium tamarense[J].Harmful Algae，2007，6(6)：799-810)。近年来杀藻细菌的分离鉴定的研究较为成熟，然而对杀藻菌固定化研究尚属空白。而由于Pseudoalteromonassp.SP48菌液是液体，直接投入到赤潮海域中，菌群缺乏载体，容易随海洋水体而流失或者沉入海洋底泥中，使得其对赤潮藻的抑制消灭效果不好。Pseudoalteromonas sp.SP48是通过分泌活性物质来发挥作用的，作用周期较长，这更不利于杀藻菌的富集生长，也不利于赤潮的治理。

微生物固定化是细胞固定化技术的一种。微生物细胞被固定化后细胞密度高、反应速度快、耐毒害能力强、产物分离容易、能实现连续操作，可以大大提高生产能力等优势，因此在近几十年来固定化细胞技术得到了迅速的发展和广泛的应用([9]Grootjen，D.R.J.，L.H.H.M.Meijlinka，Lansa，R.G.J.M.v.d.，Luybena，K.C.A.M.Cofermentation of glucose and xylose with immobilized Pichia stipitis and Saccharomyces cerevisiae[J].Enzyme and Microbial Technology，1990，12：860-864；[10]Shalaby，W.S.W.，Blevins，W.E.，Park，K.In vitro and in vivo studies of enzyme-digestible hydrogels for oral drug delivery[J].Journal of Controlled Release，1992，19(1-3)：131-144)。

关于聚氨酯泡沫固定化的研究近年来出现了很多，刘幽燕等([11]刘幽燕，李青云，覃益民，韦炳努，何勇强，童张法.聚氨酯泡沫固定化产碱杆菌细胞生物转化氰化物[J].环境科学，2006，27(3)：586-589)利用聚氨酯泡沫为载体进行固定化降氰菌株，研究其转化特性。结果表明，采用吸附生长法能有效实现菌株DN25的固定，对于高浓度氰化物，固定化细胞具有明显优势，不仅可耐受更高浓度的氰化物转化，其转化速率也高于游离细胞，通过初步的摇瓶模拟序列批式反应，固定化细胞活性可保持20天。梁兴超等([12]梁兴超，卢英华，陈杰，徐志南.聚氨酯泡沫半固定化培养盘基网柄菌[J].生物加工过程，2007，5(2)：52-56)以简单处理过的聚氨酯泡沫为载体，实现盘基网柄菌的固定化培养。他们考察了载体粒径大小、载体量和摇床转速等对固定化培养的影响，在优化的培养条件和固定化条件下，盘基网柄菌的最大细胞密度是悬浮培养的2～4倍，取得了满意的培养效果。

发明内容

本发明的目的在于针对在现有的微生物吸附过程中，由于固定化材料或者聚氨酯泡沫的密度、尺寸及固定化时间选择不当而造成细菌固定化效果不好的缺陷，以及游离海洋细菌实际应用价值不高的难题，提供一种不仅可有效解决包埋法固定化细胞的缺点，而且以聚氨酯泡沫作为吸附载体，可有效持久使海洋杀藻菌Pseudoalteromonas sp.SP48表现高效杀藻活性的聚氨酯泡沫固定海洋杀藻菌SP48的方法。

所述海洋杀藻菌Pseudoalteromonas sp.SP48已于2010年08月03日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址为中国武汉武汉大学(邮编为430072)，保藏中心保藏编号为CCTCC NO：M2010194。

本发明解决其技术问题所采取的技术方案是：

将经过制粒、煮沸、烘干的聚氨酯泡沫与杀藻菌培养基共同灭菌后，接入海洋杀藻菌Pseudoalteromonas sp.SP48进行摇瓶培养，所述海洋杀藻菌Pseudoalteromonas sp.SP48进入或依附于聚氨酯泡沫内壁生长，形成含海洋杀藻菌Pseudoalteromonas sp.SP48的聚氨酯泡沫。

所述聚氨酯泡沫的密度可为65kg/m³，所述制粒，可将聚氨酯泡沫制成立方体，所述立方体的边长最好为5mm；所述烘干可在烘箱中烘干，烘干的温度可为70℃，最好烘干至恒重。

所述杀藻菌培养基可采用Zobell 2216E培养基，Zobell 2216E培养基是一种常用的海洋好气性细菌分离培养基，是由代海洋微生物学之父—佐贝尔(C.E.ZoBell)发明，配方为：蛋白胨(Peptone)5g，酵母提取物(Yeast Extract)1g，磷酸高铁0.1g，琼脂粉10g(固体培养基)，pH7.0～7.2，陈海水定容到1L(参见文献：Su，J.Q.，Yang，X.R.，Zheng，T.L.，Tian，Y.，Jiao，N.Z.，Cai，L.Z.，Hong，H.S.Isolation and characterization of a marine algicidal bacterium against the toxic dinoflagellate Alexandrium tamarense[J].Harmful Algae，2007，6(6)：799-810)。

所述接入海洋杀藻菌Pseudoalteromonas sp.SP48进行摇瓶培养，接入量可按杀藻菌培养基总量的1％计算。

本发明采用聚氨酯泡沫为载体，并将聚氨酯泡沫切成指定大小的方块，使用前经过沸水煮沸，以除去泡沫中含有可能对细胞有害的聚醚类物质，之后烘干。经过处理的聚氨酯泡沫，凭借它孔隙强吸附能力、无毒副污染、传质传能效果良好等特点，可以作为安全有效的吸附载体。聚氨酯泡沫在震荡中吸附游离杀藻菌SP48的同时，其表面也被磨成近似球状，间接地增加其比表面积，也提高了其吸附能力。使用过的聚氨酯泡沫可通过反复挤压清洗、超声波清洗、去离子水清洗及煮沸后烘干的方法进行回收再利用，这也降低了使用成本，提高了该固定方法的经济效益。为解决实际杀藻菌投入海洋中效率低下的难题，以高效杀藻菌Pseudoalteromonas sp.SP48作为吸附用细菌，将其吸附在聚氨酯泡沫内壁或孔隙中生长，防止其流失，同时为杀藻菌提供了一个相对稳定的生长环境，发挥其最佳的生物功效。

经过试验，所述聚氨酯泡沫能在60min内吸附已生长的90％以上的海洋杀藻菌Pseudoalteromonas sp.SP48细胞，并且在实验室条件下模拟的赤潮藻单细胞塔玛亚历山大藻(Alexandrium tamarense)生长环境中，固定化细菌对该藻在4天内达到的杀藻率87.4％。连续观察检测10天，杀藻率稳定在97％～98％。

由此可见，本发明的有益效果是，采用一定密度及大小的具有强吸附能力、无毒副污染、传质传能效果良好且方便廉价的聚氨酯泡沫吸附固定化海洋杀藻菌Pseudoalteromonassp.SP48，使其在实际赤潮治理中的应用性能显著提高，而且使用过后的聚氨酯泡沫通过特定处理可实现回收利用，具有良好的经济效益。

附图说明

图1为PUF密度对Pseudoalteromonas sp.SP48的杀藻率的影响。在图1中，横坐标为聚氨酯泡沫密度density(kg m^-3)，纵坐标为杀藻率Algicidal activity(％)。

图2为不同尺寸PUF固定Pseudoalteromonas sp.SP48的杀藻效果。在图2中，横坐标为聚氨酯泡沫边长(mm)，纵坐标为杀藻率Algicidal activity(％)。

图3为Pseudoalteromonas sp.SP48在聚氨酯泡沫中的固定化曲线。在图3中，横坐标为时间Time(min)，纵坐标为细胞密度Cell Density(10⁸cells/mL)。

图4为PUF固定化杀藻菌扩大试验的杀藻效果。在图4中，横坐标为培养时间Time(d)，纵坐标为杀藻率algicidal activity(％)。

图5为扫描电镜观察聚氨酯泡沫未吸附海洋杀藻菌Pseudoalteromonas sp.SP48的PUF内部的扫描电镜照片(75×)。在图5中，标尺为200μm。

图6为扫描电镜观察吸附海洋杀藻菌Pseudoalteromonas sp.SP48的PUF内部的扫描电镜照片(270×)。在图6中，标尺为50μm。

具体实施方式

1.海洋杀藻菌Pseudoalteromonas sp.SP48菌液的制备

将活化后的SP48菌液按1％的接种量接入含100mL Zobell 2216E培养基的250mL锥形瓶中，150r/min，28℃摇瓶培养16～24h。

2.聚氨酯泡沫的制备

购买不同密度的市售聚氨酯泡沫，按需要切割成一定尺寸的方块泡沫，之后泡沫经沸水煮沸3～4次，烘箱70℃烘至恒重。

3.聚氨酯固定化杀藻菌的制备

备用的聚氨酯泡沫与杀藻菌培养基共同灭菌，按1％接入经活化的SP48菌液，摇瓶培养。

4.固定化杀藻菌的杀藻活性检测

取出固定化后的聚氨酯泡沫风干，按聚氨酯泡沫(按质量计算)∶藻培养体系(按体积计算)＝6g∶1L的比例在藻液中投入固定化后的聚氨酯泡沫，每天取样检测藻细胞数量。

图1及表1给出在载体尺寸、添加量相同的条件下，3种不同密度的PUF对Pseudoalteromonas sp.SP48的固定化效果差别显著，杀藻效果区别较为明显。密度为65kg/m³的1号泡沫具有最佳吸附能力(4.7×10¹⁸cells g^-1)和较高杀藻率(97.5％)。

表1不同密度聚氨酯泡沫固定化效果

PUF为大孔径空隙率高的载体，但载体粒径大小不同，载体提供的比表面积也不同，固定化效果也会有所差异。图2及表2均说明不同尺寸的PUF固定化效果差别非常明显。不论是吸附菌量还是杀藻率的结果都显示，体积越小的PUF其吸附菌体的量越大杀藻效果越好。

表2不同尺寸聚氨酯泡沫固定化效果

经过约60min，载体外悬浮的菌体浓度基本不再变化，Pseudoalteromonas sp.SP48在PUF载体中固定化基本达到平衡。载体外菌液总细胞数约为1.86×10¹⁰cells，仅为初始总菌数的2.76％，说明聚氨酯泡沫在短短60min之内吸附了90％以上的菌细胞。这说明简单的物理吸附固定化方法培养Pseudoalteromonas sp.SP48的效率较高。经过6小时的检测，菌株在聚氨酯泡沫中的固定化曲线见图3。

为了实现聚氨酯泡沫吸附法固定化杀藻菌的实际应用，将藻培养规模扩大至20L，按照PUF∶藻液＝6g∶1L的比例进行杀藻实验。扩大试验的杀藻结果如图4所示。

为了更清楚的直观了解Pseudoalteromonas sp.SP48在PUF载体内的被吸附的情况，采用电镜扫描检测固定化培养48h的菌体，扫描结果如图5所示。

图5显示的是未吸附杀藻菌的PUF内部，可以看到PUF内部孔隙率很高，适合菌体吸附及增殖过程中物质的传递。

图6所示菌体在固定化载体表面分布并不十分均一，空隙开口处的菌体相对较少，可能由于培养基在孔间对流流动的影响，孔膜上的菌体有可能与载体间结合不是很牢固。PUF载体膜结构中间存在的孔隙，对营养物质在载体内的传递非常重要。

Claims (7)

1.聚氨酯泡沫固定海洋杀藻菌SP48的方法，其特征在于所述海洋杀藻菌Pseudoalteromonas sp.SP48已于2010年08月03日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏中心保藏编号为CCTCC NO：M2010194；所述方法为：

将经过制粒、煮沸、烘干的聚氨酯泡沫与杀藻菌培养基共同灭菌后，接入海洋杀藻菌Pseudoalteromonas sp.SP48进行摇瓶培养，所述海洋杀藻菌Pseudoalteromonas sp.SP48进入或依附于聚氨酯泡沫内壁生长，形成含海洋杀藻菌Pseudoalteromonas sp.SP48的聚氨酯泡沫。

2.如权利要求1所述的聚氨酯泡沫固定海洋杀藻菌SP48的方法，其特征在于所述聚氨酯泡沫的密度为65kg/m³。

3.如权利要求1所述的聚氨酯泡沫固定海洋杀藻菌SP48的方法，其特征在于所述制粒，是将聚氨酯泡沫制成立方体。

4.如权利要求3所述的聚氨酯泡沫固定海洋杀藻菌SP48的方法，其特征在于所述立方体的边长为5mm。

5.如权利要求1所述的聚氨酯泡沫固定海洋杀藻菌SP48的方法，其特征在于所述烘干是在烘箱中烘干，烘干的温度为70℃。

6.如权利要求1所述的聚氨酯泡沫固定海洋杀藻菌SP48的方法，其特征在于所述杀藻菌培养基采用Zobell 2216E培养基，配方为蛋白胨5g，酵母提取物1g，磷酸高铁0.1g，琼脂粉10g，pH7.0～7.2，陈海水定容到1L。

7.如权利要求1所述的聚氨酯泡沫固定海洋杀藻菌SP48的方法，其特征在于所述接入海洋杀藻菌Pseudoalteromonas sp.SP48进行摇瓶培养，接入量是按杀藻菌培养基总量的1％计算。

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