CN103468622A

CN103468622A - 海藻酸钠-微孔淀粉固定抑藻菌dh46的方法

Info

Publication number: CN103468622A
Application number: CN2013104594841A
Authority: CN
Inventors: 郑天凌; 李祎; 林婧; 周赞虎; 郑伟
Original assignee: Xiamen University
Current assignee: Xiamen University
Priority date: 2013-09-27
Filing date: 2013-09-27
Publication date: 2013-12-25

Abstract

海藻酸钠-微孔淀粉固定抑藻菌DH46的方法，涉及一种海洋抑藻菌的固定方法。所述抑制有害藻华的海洋性细菌为Alteromonas addita DH46保藏编号为CCTCC NO：M2010177。将海藻酸钠溶于去离子水超声处理后与加有菌悬液的微孔淀粉混合，再加入预冷的CaCl₂形成固定化胶珠。胶珠里的网格结构便于抑藻菌DH46的吸附，抑藻菌DH46被包埋在稳定的海藻酸钠钙凝胶体系中，提高了杀藻率。采用可以相互结合并且十分稳定的几种物质相互结合成带有网状结构的化合物来包埋固定化抑藻菌DH46，使其在实际赤潮治理中的应用性能显著提高，有效地提高了杀藻率，使得细菌控制从理论走向应用。

Description

海藻酸钠-微孔淀粉固定抑藻菌DH46的方法

技术领域

本发明涉及一种海洋抑藻菌的固定方法，尤其是涉及一种海藻酸钠-微孔淀粉固定抑藻菌DH46的方法。

背景技术

有害赤潮已经成为当今全球性的海洋灾害，与沙尘暴并列为我国目前面临的、由于人类活动而造成的两大自然灾害之一。赤潮的频繁爆发已使我国滨海地区生态安全和沿海经济的可持续发展面临着极为严峻的挑战。近年研究表明，菌-藻关系在种群演替和有害藻华动力学中起着重要作用，而诸多抑/杀藻细菌的发现为微生物防治赤潮提供了可能的途径。

目前，国内外抑/杀藻细菌及其活性物质的研究虽然取得了一些进展，但是在实际的工作中仍存在除藻效能不高、有效细菌浓度不高等缺陷，因此，通过优化发酵条件和固定化技术，研发一种新型高效的生物除藻技术，以提高抑藻细菌的生物量和抑藻效果显然具有重要的现实意义。本申请人的实验组苏建强博士于2003年赤潮973项目MC2003-2航次从东海赤潮区采集到的海水样品中分离并筛选得到高效抑藻菌，前期研究表明该菌可通过间接抑藻方式，但是细菌抑藻过程中会受到很多外界因素的干扰，从而影响了杀藻率。通过固定化技术将细菌菌体固定在可吸附或者包埋的物质上，从而促进了细菌的生长并提高了杀藻率。

生物固定化技术（immobilized biotechnology）是从20世纪60年代开始迅速发展起来的一项新技术，它是通过利用物理或化学手段将游离细胞或酶定位于限定的空间区域，并使其保持活性和可以反复使用的一种基础技术。固定化微生物技术具有微生物密度高、反应迅速、微生物流失少、产物易分离以及反应过程易控制等优点。常见的手段有吸附法、包埋法、共价结合法、交联法四大类，其中以包埋法研究最多，应用最广。

包埋固定化法是将微生物细胞包埋在凝胶的微小空格内或埋于半透膜聚合物的超滤膜内（[6]曲洋,张培玉,郭沙沙,等.复合固定化法固定化微生物技术在污水生物处理中的研究应用[J].四川环境,2009,28(3):78-84；[7]沈耀良,黄勇,赵丹.固定化微生物污水处理技术[M].北京:化学工业出版社,2002.265-266）。根据载体材料和方法的不同，包埋法可分为凝胶包埋法和微胶囊法两种。此法简单，条件温和，稳定性好，包埋细胞容量高,是目前应用最广泛的固定化方法。但它也存在一些缺点，如载体存在限制扩散作用，许多载体形成凝胶后对高分子底物的通透性变差，机械强度往往也较低。徐新阳等利用改进的聚乙烯醇-海藻酸钠联合包埋法固定化微球菌Micrococcus sp.可以获得固定化效果，制得的粒子机械强度高,使用寿命长，且弹性好对污水处理效果理想（[8]徐新阳,张轶,李海波,等.污染地表水修复用微球菌的化学包埋法固定化工艺[J].东北大学学报,2006,27(10):1146—1148）。

海藻酸钠(ALG)是一种从海藻中提取的天然多糖聚合物，结构是直链型(1-4)链合的古罗糖醛酸与甘露糖醛的共聚物，是一种广泛应用的固定化介质，具有化学稳定性好、无毒、包埋效率高且价格低廉等优点，海藻酸钠易与二价阳离子Ca²⁺络合，形成“蛋格”结构，从而得到比较稳定的海藻酸钙凝胶体系（[9]Thu B,Bruheim P,Espevik T,et al.Alginate polycationmicrocapsules I:interaction between alginate and polyca-tion[J].Biomaterials,1996,17:1031-1040）。在海藻酸钠包埋法中，海藻酸钠的浓度、CaCl₂浓度、交联时间、凝胶小球的直径等各因素对细胞活性均有影响。

发明内容

本发明的第一个目的是提供抑制有害藻华的海洋性细菌。

本发明的第二个目的是提供一种海藻酸钠-微孔淀粉固定抑藻菌DH46的方法。

所述抑制有害藻华的海洋性细菌为Alteromonas addita DH46（以下简称为抑藻菌DH46），该菌已于2010年7月14日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M2010177，保藏中心地址为：中国武汉武汉大学，邮编430072。

所述海藻酸钠-微孔淀粉固定抑藻菌DH46的方法，其具体步骤如下：

将海藻酸钠溶于去离子水超声处理后与加有菌悬液的微孔淀粉混合，再加入预冷的CaCl₂形成固定化胶珠。胶珠里的网格结构便于抑藻菌DH46的吸附，抑藻菌DH46被包埋在稳定的海藻酸钠钙凝胶体系中，提高了杀藻率。

所述海藻酸钠的浓度可为20g/L；所述微孔淀粉的浓度可为20g/L；所述CaCl₂的浓度可为30g/L；所述胶珠为圆形、无粘连的紧实球状结构，白色不透明，粒径为3.20±0.08mm，具有一定的弹性和强度，通透性较佳。在实验室条件下对单细胞塔玛亚历山大藻（Alexandriumtamarense）生长有明显的抑制效果，5g的包埋固定化微球10d的抑藻率达85.7%，5g加有2216E的包埋固定化微球10d的抑藻率达91%，固定化微球活化后的无细胞滤液10d后的抑藻率达99.6%。

无菌操作条件下，称取一定量的微孔淀粉于烧杯中，加入菌悬液，冰上缓慢搅拌、静置，使菌体吸附完全，形成乳化液。按质量体积比，将一定量的海藻酸钠溶于去离子水，水浴中搅拌溶解，超声处理，形成均质、无气泡胶体溶液。将上述乳化液倒入冷却的海藻酸钠溶液中，缓慢搅拌均匀，用注射器将混合液挤入一定浓度、预先制冷的CaCl₂溶液中，形成大小均匀的固定化胶珠。固化一段时间后取出，用生理盐水清。海藻酸钠易与二价阳离子Ca²⁺络合，形成“蛋格”结构，从而得到比较稳定的海藻酸钙凝胶体系。并且海藻酸钠微球呈球状，增加其比表面积，也提高了其吸附能力。

本发明是基于固定化材料或者海藻酸钠、微孔淀粉及CaCl₂浓度及固定化时间选择不当而造成抑藻菌DH46固定化效果不好的缺陷，以及游离海洋细菌实际应用价值不高的难题，提供一种经优化改良的海藻酸钠钙凝胶体系为载体的，可有效持久使抑藻菌DH46表现高效杀藻活性的固定化制备方法。

本发明的有益效果是，采用可以相互结合并且十分稳定的几种物质相互结合成带有网状结构的化合物来包埋固定化抑藻菌DH46，使其在实际赤潮治理中的应用性能显著提高，有效地提高了杀藻率，使得细菌控制从理论走向应用。

附图说明

图1为抑藻菌DH46的电镜照片图。

图2为海藻酸钠-微孔淀粉包埋固定化凝胶小球。

图3为固定化微珠平均粒径与海藻酸钠浓度的关系。

图4为固定化微珠平均粒径与微孔淀粉浓度的关系。

图5为固定化微珠平均粒径与氯化钙浓度的关系。

图6为游离培养与包埋固定化对抑藻菌DH46生长的影响。

图7为包埋固定化凝胶微球的抑藻实验（对应空白小球作为对照）。

图8为包埋固定化凝胶微球的抑藻实验（补充1ml2216E培养基）。

图9为包埋固定化凝胶微球的抑藻实验（加入100ml目标藻）。

具体实施方式

实施例1：抑藻菌DH46的分离与活化

1、取东海赤潮区采集到的海水样品，溶解于高压灭菌的90mL2216E培养基，置于150～200rpm摇床震荡20～30min，使样品均匀分散；

2、10倍稀释法，涂布均匀分散的样品于2216E固体平板，置于28～37℃温度下培养3～5d；

3、挑取不同类型单菌落划线于2216E固体平板，置于28～30℃温度下培养3～5d，验证是否纯培养，重复该步骤直到得到纯培养；

4、接种分离出的纯培养物单菌落于4mL2216E液体培养基，置于28～37℃摇床，180～250rpm震荡培养3～5d，取培养液于10,000～12,000g的条件下离心10min，除去菌体沉淀，上清保存至4.5mL离心管；

5、将1mL上清加入到20mL指数期塔玛亚历山大藻培养液中，于20±1℃，12h光照，12h黑暗，50μmol photons m^-2s^-1光照强度条件下培养2天，2216E培养基为对照加入藻液中，分别设置3个平行；观察塔玛亚历山大藻藻细胞是否沉降，沉降代表菌体发酵培养物上清中含有抑藻活性物质，从而筛选出抑藻活性菌株。将抑藻菌株于-80℃保藏，待用。

6、将保藏菌株活化，接入已灭菌的培养基中，于28℃、150r/min震荡培养12～16h，经低温离心(8000r/min，10min)收集菌体，去除上清。加少量生理盐水制成菌悬液(10⁸cell/ml)，添加适量甘油作为保护剂，使之终浓度为10g/L。

抑藻菌DH46的电镜照片图参见图1。

实施例2：制备海藻酸钠钙凝胶颗粒

1、无菌操作条件下，称取一定量的微孔淀粉于烧杯中，加入菌悬液，冰上缓慢搅拌、静置15min使菌体吸附完全，包菌量为60/100(即每100mL包埋剂中含有相当于60mL菌液的菌量)。

2、按质量体积比，将一定量的海藻酸钠溶于去离子水，在90℃水浴中搅拌溶解，置于超声波清洗仪超声处理5min后取出降至室温，形成均质、无气泡胶体溶液。将上述乳化液倒入冷却的海藻酸钠溶液中，缓慢搅拌均匀，用注射器将混合液挤入一定浓度、预先制冷的CaCl₂溶液中，形成大小均匀的固定化胶珠。

3、固化一段时间后取出，用生理盐水清洗胶珠2～3次，去除CaCl₂残液；于4℃下在生理盐水悬浮保存备用。

4、采用该条件，利用挤压法制备出抑藻菌DH46的固定化胶珠，其形态如图所示，胶珠呈圆形、无粘连的紧实球状结构，白色不透明，粒径大小3.20±0.08mm，具有一定的弹性和强度，通透性较佳，海藻酸钠-微孔淀粉包埋固定化凝胶小球见图2。

实施例3：包埋固定化制备条件的确定

1、海藻酸钠制备浓度的确定

固定微孔淀粉MS浓度为20g/L及CaCl₂浓度为30g/L，配制不同浓度的海藻酸钠SA溶液，按上述方法制备固定化抑藻菌DH46的包埋胶球，考察不同浓度的SA对胶球粒径的影响。海藻酸钠浓度对固定化颗粒包埋效果的影响见表1，固定化微珠平均粒径与海藻酸钠浓度的关系见图3，由表1和图3可知，不同浓度的海藻酸钠，对于包埋效果影响很大。合适浓度的海藻酸钠易形成机械强度适宜的凝胶微珠，同时传质效果良好，胞外代谢产物易于从凝胶微孔扩散通过。综合考察，优化出合适的海藻酸钠浓度为20g/L。

表1海藻酸钠浓度对固定化颗粒包埋效果的影响

注：颗粒传质性能，+差，++较好，+++好。

2、微孔淀粉浓度的影响

选取SA浓度为20g/L及CaCl₂浓度为30g/L，改变胶球制备液中MS的浓度，考察其对胶球粒径的影响。结果显示，随着微孔淀粉浓度的增大，微球的粒径小幅度增加，机械强度则明显增强。提高芯材的质量分数，可有效增加吸附的菌体数量，但继续增大MS的量会使得底物运动扩散更加困难，降低细胞活力。固定化微珠平均粒径与微孔淀粉浓度的关系见图4，由图4可知，适宜的微孔淀粉的浓度在20～25g/L之间，以20g/L为宜。

3、CaCl₂溶液浓度影响

选取海藻酸钠SA溶液为20g/L及微孔淀粉MS浓度为20g/L，配制不同浓度的CaCl₂固化溶液，考察不同浓度的氯化钙对胶球粒径的影响。实验结果表明，当CaCl₂溶液浓度低于30g/L时，固定化胶珠较软、强度较差；大于50g/L时，胶珠弹性差且又部分聚积。考虑到钙盐的高渗透压作用可能对抑藻菌的生物活性造成不良影响，因此选择适宜的CaCl₂浓度为30g/L，固定化微珠平均粒径与氯化钙浓度的关系见图5。

实施例4：固定化细胞发酵

无菌条件下，将游离菌体与含等量的固定化胶珠接于装有50ml培养基的250ml三角瓶中，于28℃，150r/m恒温摇床中进行培养，隔时取样，测定发酵液的OD600值，考察固定化对抑藻菌生长的影响。表明SA-MS包埋体系能够维持抑藻菌DH46的正常生长，具有良好的生物相容性。固定化培养初期的菌体生长速度低于游离方式，在经历了一段较长的延滞期后菌体快速生长，进入稳定期后两种方式培养的细胞密度都维持在相近的范围内，游离培养与包埋固定化对抑藻菌DH46生长的影响见图6。

实施例5：固定化包埋小球抑藻实验

为考察包埋固定化小球对塔玛亚历山大藻的抑制效果，采取三种不同添加方式作用于目标藻：

1、选择优化条件制备固定化小球，分别取固定化小球1g，3g，5g直接加入100ml塔玛亚历山大藻液中，对应空白小球作为对照，隔时取样，观察抑藻效果并计算抑制率（见图7）；

2、取固定化小球1g，3g，5加入100ml塔玛亚历山大藻液中，同时补充1ml2216E培养基，隔时取样，观察抑藻效果并计算抑制率（见图8）；

3、称取1g包埋固定化小球，置于50ml2216E培养基中，28℃，150r/m条件下培养48h。取发酵液离心获得无细胞滤液，按0.5%，1%和2%（v/v）加入100ml目标藻中，观察抑藻效果并计算抑制率（见图9）。

由图7～9可知，图7显示，向藻体中直接投加1g，3g和5g的包埋固定化微球，作用10d后抑藻率分别为59.6%，76.7%和85.7%。随着投加的固定化微球数量的增加和作用时间的延长，抑藻效果呈逐渐增加的趋势。图8显示，投加1g，3g和5g的包埋固定化微球，作用10d后抑藻率分别为71.5%，78.8%及91%，较之图7中的抑藻率略有提高。图9的结果显示添加量较低，如0.5%和1%时，抑藻作用前期效果不明显，10d后抑藻率分别提高至96.5%和97.1%；添加量提高至2%后抑藻率在24h就达到了63.2%，随着作用时间的增加抑制效果持续增强，10d抑藻率达到了99.6%。综上，抑藻菌DH46的包埋固定化小球三种运行方式中，其发酵滤液最快表现出抑藻效应，直接投加固定化微球对塔玛亚历山大藻具有较好的抑制作用，在添加适量菌体培养液后抑藻率有所提升。

Claims

1.抑制有害藻华的海洋性细菌为Alteromonas addita DH46，该菌已于2010年7月14日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M2010177，保藏中心地址为：中国武汉武汉大学，邮编430072。

2.海藻酸钠-微孔淀粉固定抑藻菌DH46的方法，其特征在于其具体步骤如下：

将海藻酸钠溶于去离子水超声处理后与加有菌悬液的微孔淀粉混合，再加入预冷的CaCl₂形成固定化胶珠。

3.如权利要求2所述海藻酸钠-微孔淀粉固定抑藻菌DH46的方法，其特征在于所述海藻酸钠的浓度为20g/L。

4.如权利要求2所述海藻酸钠-微孔淀粉固定抑藻菌DH46的方法，其特征在于所述微孔淀粉的浓度为20g/L。

5.如权利要求2所述海藻酸钠-微孔淀粉固定抑藻菌DH46的方法，其特征在于所述CaCl₂的浓度为30g/L。

6.如权利要求2所述海藻酸钠-微孔淀粉固定抑藻菌DH46的方法，其特征在于所述胶珠为圆形、无粘连的紧实球状结构，白色不透明，粒径为3.20±0.08mm。