CN106754546A - 一株溶解甲藻的盐单胞菌菌株及含有其的固定化菌剂 - Google Patents

一株溶解甲藻的盐单胞菌菌株及含有其的固定化菌剂 Download PDF

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Abstract

本发明从中国东海浙江沿海地区赤潮多发区分离获得一株对甲藻具有高效溶解作用的细菌菌株，其分类命名为盐单胞菌DH‑xbzhu（Halomona sp.DH‑xbzhu），保藏于中国典型培养物保藏中心，菌种保藏号为CCTCC NO:M 2014541。本发明还涉及了一种包含上述细菌的固定化菌剂及其制备方法，以及应用所述固定化菌剂抑制有毒甲藻的用途。本发明的盐单胞菌DH‑xbzhu固定化菌剂对藻细胞结构具有强烈的影响，显著改变藻细胞内部结构，破坏藻细胞膜完整性，从而达到溶藻作用。本发明为开发环保、低成本的赤潮治理方法提供了新思路。

Description

一株溶解甲藻的盐单胞菌菌株及含有其的固定化菌剂
技术领域
本发明涉及一种溶藻菌，具体涉及一种对甲藻具有高效溶解作用的盐单胞菌以及含有该菌种的固定化菌剂，以及制备固定化菌剂的方法。
背景技术
随着工业化和城市化进程的加快，环境恶化、资源短缺等问题日益明显，尤其是海洋资源污染问题越来越突出。近年来，赤潮爆发次数越来越频繁，规模越来越大，尤其是由有毒甲藻引起的赤潮频频发生，例如，东海原甲藻是发生在该海域的原甲藻赤潮的主要原因藻之一，在长江口附近、浙江近海以及福建沿岸海域经常性引发大规模赤潮。赤潮对经济的发展以及人类健康造成了巨大的危害，因此，寻找到环保、经济、有效的赤潮治理方法尤为重要。
目前的赤潮治理方法主要有物理法、化学法和生物法，但是由于物理法和化学法除藻具有费用高、二次污染等弊端，所以采用生物法防治赤潮引起了众多学者的关注，其中研究最多的就是利用溶藻细菌来治理赤潮。众多研究表明，细菌特别是溶藻菌在赤潮的治理中起着重要作用，因此溶藻细菌必然成为微生物防治赤潮的潜在资源库。相较于物理法和化学法治理赤潮，溶藻细菌具有特异性强、环境友好、成本低等优势。
目前已报道的溶藻细菌主要属于假交替单胞菌属(Pseudoalteromonas)、交替单胞菌属(Alteromonas)、噬纤维菌属(Cytophaga)、腐螺旋菌属(Saprospira)、黄杆菌属(Flavobacterium)、弧菌属(Vibrio)、希万氏菌属(Shewanella)、芽孢杆菌属(Bacillus)、Planomicrobium属和微球菌属(Micrococcus)等。同时，研究发现溶藻细菌溶解藻细胞主要有两种方式：一是直接溶藻，即菌株与藻细胞表面直接接触，或入侵藻细胞内，进而抑制藻细胞生长或导致藻细胞裂解；二是间接溶藻，即通过分泌胞外代谢物质实现溶藻，该方式是溶藻细菌的主要作用方式。利用海洋细菌的溶藻作用防治赤潮，可以避免物理法与化学法治理赤潮带来二次污染的缺陷，是保持海洋环境生态平衡的可靠方法之一。
但是，利用游离细菌来治理赤潮，存在有效浓度低、反应启动慢、菌体易流失、与环境竞争力弱、抗有毒污染能力差、对废水水质水量适应性较差等缺点，为了解决这些缺点和不足，人们开始将传统的生物方法与微生物固定化技术相结合。微生物固定化技术是通过利用物理或化学手段将游离微生物定位于限定的空间区域，并使其保持活性和可以反复使用的一种技术，固定化微生物技术具有微生物密度高、反应迅速、微生物流失少、产物易分离以及反应过程易控制等优点。
常用的微生物固定化方法有：吸附法、包埋法、交联法和共价结合法等，其中包埋法具有制备方法简单，反应条件温和，微生物不易泄漏，稳定性和重复利用性好，微生物活性高、细胞容量大、固定化效率高等优点，使用较为广泛。常用的包埋固定化材料有：琼脂、海藻酸钠、聚乙烯醇、明胶、聚丙烯酰胺等。
发明内容
针对现有技术中存在的问题，仍需不断寻找和分离具有高效溶藻作用的细菌菌种，本发明对溶藻菌进行了大量的筛选和研究工作，最终从中国东海浙江沿海地区赤潮多发区分离获得一株新的具有高效溶藻作用的细菌菌种。
因此，本发明的第一目的在于提供一种可高效抑制赤潮藻的细菌，为利用生物法治理赤潮提供新途径。
本发明提供的溶藻菌已于2014年11月2日保藏于中国典型培养物保藏中心(ChinaCenter for Type Culture Collection，CCTCC)，该菌种保藏号为CCTCC NO:M 2014541，保藏地址为中国武汉武汉大学，分类命名为盐单胞菌DH-xbzhu(Halomona sp.DH-xbzhu)。
针对利用游离溶藻菌治理赤潮的不足，本发明的第二目的在于提供一种固定化菌剂，所述固定化菌剂含有上述对甲藻具有溶解作用的细菌菌株。
作为对上述技术方案的进一步改进，所述固定化菌剂含有包埋剂海藻酸钠与聚乙烯醇。
作为对上述技术方案的进一步改进，所述固定化菌剂含有交联剂氯化钙和硼酸。
本发明的第三目的在于提供一种上述固定化菌剂的制备方法，具体包括以下步骤：
（1）细菌扩增及浓缩：将所述对甲藻具有溶解作用的细菌菌株扩大培养，浓缩，配置成浓缩液；
（2）包埋剂配制：将重量浓度为2～5%的海藻酸钠，重量浓度为4～8%的聚乙烯醇分别置于水中，在80～100℃条件下水浴溶解，灭菌后混合均匀，制得混合包埋剂；
（3）交联剂配制：将1 g氯化钙溶液溶解于饱和硼酸溶液，灭菌后混合均匀，制得交联剂，4℃保存备用；
（4）固定化菌剂制备：将步骤（1）所制得的浓缩液以1:20体积比与步骤（2）所制得的包埋剂混合均匀，逐滴加入步骤（3）所制得的交联剂，制成直径4mm的颗粒，在4℃下固定24 h；
（5）保存：将步骤（4）所制得的颗粒用无菌水清洗3～4次，置于无菌海水中，于4℃冰箱保存。
作为对上述技术方案的进一步改进，海藻酸钠的重量浓度为5%，聚乙烯醇的重量浓度为4%。
本发明的再一目的在于提供一种上述细菌菌株在溶解甲藻中的用途。
优选地，其中所述甲藻为东海原甲藻(Prorocentrumdonghaiense)、塔马亚历山大藻(Alexandrium tamarense)或米氏凯伦藻(Karenia mikimotoi Hansen)。
本发明的再一目的在于提供上述固定化菌剂在溶解甲藻中的用途。优选地，其中所述甲藻为东海原甲藻(Prorocentrumdonghaiense)、塔马亚历山大藻(Alexandriumtamarense)或米氏凯伦藻(Karenia mikimotoi Hansen)。
本发明的优点为：
1. 本发明的盐单胞菌DH-xbzhu通过间接作用抑制甲藻，当细菌培养滤液
的溶藻效果随着浓度的增加而随之增强，并且浓度比例在1.00%以上（含1.00%）时，溶藻率均达到90%以上。
2.将本发明的盐单胞菌DH-xbzhu固定化后的所得到的固定化菌剂仍保持良好的活性，易于储存备用，其机械强度、传质性能、密度、膨胀性都在良好水平。
3. 本发明的固定化菌剂成球方便容易，操作简单，所用材料经济易得，易于大范围推广。
4. 本发明溶藻菌固定包埋后仍具有良好的溶藻效果，并能储存、重复使用，固定化菌剂克服了利用游离菌治理赤潮的缺点，在流动水体中不易流失，回收简单。
5.本发明的菌株及含有该菌种的固定化菌剂对于我国海域的环境保护、水产养殖业发展以及人群健康保障等方面具有重要的科学意义与实用价值，将产生不可估量的经济效益、环境效益和社会效益。
附图说明
图1A、1B为本发明的Halomona sp.DH-xbzhu的扫描电镜照片。
图2为本发明的Halomona sp. DH-xbzhu的16s rRNA系统进化树。
图3为本发明的Halomona sp. DH-xbzhu的代谢产物抑制东海原甲藻(Prorocentrumdonghaiense)的抑制效果。
图4为本发明的Halomona sp. DH-xbzhu的代谢产物抑制塔马亚历山大藻(Alexandrium tamarense)的抑制效果。
图5为本发明的Halomona sp. DH-xbzhu的代谢产物抑制米氏凯伦藻(Kareniamikimotoi Hansen) 的抑制效果。
图6将Halomona sp. DH-xbzhu固定化制得的固定化菌剂的形态特征。
图7为不同海藻酸钠、聚乙烯醇浓度对固定化菌剂颗粒直径的影响。
图8为不同海藻酸钠、聚乙烯醇浓度对固定化菌剂机械强度的影响。
图9为固定化Halomona sp. DH-xbzhu菌剂与游离菌生长情况对比。
图10为固定化Halomona sp. DH-xbzhu菌剂对东海原甲藻的溶解效果。
图11为固定化Halomona sp. DH-xbzhu菌剂发酵后的无菌滤液的对东海原甲藻的溶解效果。
图12为固定化Halomona sp. DH-xbzhu菌剂的重复利用情况。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件中所述条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1：Halomona sp. DH-xbzhu的分离
从中国东海浙江沿海地区赤潮发生区取海水，用无菌水梯度稀释，然后将取每个稀释度100μL加入到LB培养基中，在28±2℃的条件下培养72小时。将不同形态的各个菌落进一步用LB培养基纯化。然后将纯化的各个菌株在LB培养基中在28±2℃，120rpm的条件下震荡培养24h达到指数生长期，培养10d以分泌代谢产物。各个菌株代谢产物在5000g下离心10min，收取培养液上清。将培养液上清用0.45μm的滤膜过滤，将10mL滤后的滤液加入到90mL东海原甲藻(Prorocentrumdonghaiense)（2200细胞/mL）、塔马亚历山大藻(Alexandrium tamarense) （2500细胞/mL）、米氏凯伦藻(Karenia mikimotoi Hansen)（2100细胞/mL）培养液中。离心后的菌体用无菌水洗涤两次，溶解在无菌海水中，菌体密度为6.0*106 cfu，将10mL各个菌液加入到东海原甲藻(Prorocentrumdonghaiense) （2200细胞/mL）、塔马亚历山大藻(Alexandrium tamarense) （2500细胞/mL）、米氏凯伦藻(Kareniamikimotoi Hansen) （2100细胞/mL）培养液中。且用10mL的无菌海水作为对照。为了研究各个菌株的溶藻活性，在用鲁哥氏碘液固定后，在显微镜下对藻类细胞进行计数。每个处理设三组平行。
实施例2：Halomona sp. DH-xbzhu的种属鉴定
将200μL于-80℃保存的菌株接种于100mL LB培养基中，培养8～12h，使菌活化至对数期，OD600值为1.2～1.6，培养条件为28±2℃，160rpm；对所分离到的有效溶解藻类的菌株进行了扫描电镜观察，以对该菌种进行形态鉴定，其结果如图1A和图1B所示。
对该菌株进行了生理生化鉴定，结果如表1。
表1
+为阳性，-为阴性
另外，提取了该菌株的DNA，然后设计了引物扩增16s rRNA基因，引物为细菌通用引物27F和1492R。对扩增出的16s rRNA进行测序，其序列长度为1444bp，在GenBank的登录号为KP144872。该菌株的16s rRNA系统进化树如图2所示。
通过形态特征、生理生化及16s rDNA测序分析鉴定该菌株属于盐单胞菌属。
实施例3：检测Halomona sp. DH-xbzhu的代谢产物对不同甲藻的溶解效果
将不同藻种接种于f/2-Si培养液中，放置光照培养箱中培养，温度为20 ± 1℃，光照强度为4000 lux，光暗比为12L：12D，取藻类密度为4000~5000个细胞/mL。
将所获得的Halomona sp. DH-xbzhu菌株接种到液体LB培养基中，28±2℃下进行培养5d，使培养基中的营养成分消耗殆尽，并大量分泌代谢物。将菌液于4000 rpm，15 min条件下离心收集上清，0.22 μm滤膜过滤得到无菌滤液，取细菌的上清液涂板检测上清液有无菌。将一系列浓度梯度的无菌滤液（0.5mL，0.25mL，0.1mL，0.05mL）加入到100mL的东海原甲藻(Prorocentrumdonghaiense) （2200细胞/mL）、塔马亚历山大藻(Alexandriumtamarense) （2500细胞/mL）、米氏凯伦藻(Karenia mikimotoi Hansen) （2100细胞/mL）培养液中。对照1为1mL的无菌海水加入到100mL的藻培养液中，对照2为1mL的LB培养基加入到100mL的藻培养液中。每2天计算藻密度，绘制生长曲线。结果如图3～5所示。可以看出Halomona sp. DH-xbzhu对于东海原甲藻(Prorocentrumdonghaiense) （2200细胞/mL）、塔马亚历山大藻(Alexandrium tamarense) （2500细胞/mL）、米氏凯伦藻(Kareniamikimotoi Hansen)（2100细胞/mL）具有明显的抑制作用。
实施例4：固定化菌剂的制备
（1）Halomona sp. DH-xbzhu浓缩液的配制：将活化后的溶藻菌置于离心管中，在4000rpm转速下离心15min，去除上清，菌体用无菌海水清洗后重悬，配置成OD600为1.8-2.1的浓缩液；
（2）包埋剂的配制：将海藻酸钠、聚乙烯醇分别置于水中，在80-100℃条件下水浴溶解，灭菌后混合均匀，制得混合包埋剂；其中，所述海藻酸钠与所述水的比例为（2～5）g：100mL，所述聚乙烯醇与所述水的比例为（3～8）g：100 mL；
（3）交联剂的配制：将1 g氯化钙溶液与饱和硼酸溶液灭菌后混合均匀，制得交联剂，4℃冰箱中备用；
（4）固定化溶藻菌制备：将步骤（1）所制的溶藻菌浓缩液以1:20体积与步骤（2）制得的包埋剂混合均匀，逐滴加入步骤（3）制得的交联剂中，制成直径为4 mm左右的颗粒，在4℃冰箱中固定24 h；
（5）保存：将制得的颗粒用无菌水清洗3-4次，置于无菌海水中，于4℃冰箱保存。
采用以上方法制得的固定化菌剂颗粒形态如图6所示，颗粒呈直径4mm左右的不透明、白色球体，具有一定的弹性和硬度。
实施例5：不同海藻酸钠、聚乙烯醇浓度对固定化菌剂颗粒的影响
海藻酸钠、聚乙烯醇浓度的选择：分别配制2%、3%、5%的海藻酸钠（SA）和4%、6%、8%的聚乙烯醇（PVA），按照实施例5中的步骤进行溶藻菌的固定化，考察不同浓度的海藻酸钠和聚乙烯醇对固定化颗粒的影响。图7和图8显示了不同海藻酸钠、聚乙烯醇浓度对固定化颗粒直径和机械强度的影响。如表2所示，海藻酸钠、聚乙烯醇浓度对固定化溶藻菌颗粒以及操作难易程度的影响较大，综合考虑成球质量情况、传质性能以及经济性，优化出合适的浓度为5%海藻酸钠和4%聚乙烯醇。
表2 ：海藻酸钠、聚乙烯醇对固定化溶藻菌颗粒的影响
海藻酸钠、聚乙烯醇浓度（%） 成型情况 制备难易程度 传质性能
2%SA+4%PVA 薄膜状 无法制备 -
2%SA+6%PVA 薄膜状 无法制备 -
2%SA+8%PVA 蝌蚪状，拖尾 容易 ++
3%SA+4%PVA 薄膜状 无法制备 -
3%SA+6%PVA 椭圆状 容易 ++
3%SA+8%PVA 椭圆状 容易 ++
5%SA+4%PVA 球状，均匀 容易 +++
5%SA+6%PVA 球状，均匀 较难 ++
5%SA+8%PVA 椭圆状 较难 +
注：传质性能，+差，++较好，+++好。
实施例6：固定化Halomonasp. DH-xbzhu菌剂的生长情况
将游离菌于等量固定化菌体接种于装有100mL LB 培养基的250mL 锥形瓶中，在28℃，160rpm条件下培养，定时取样，测定OD600，考察包埋固定化对溶藻菌Halomona sp. DH-xbzhu生长的影响，结果如图9所示。结果表明，海藻酸钠-聚乙烯醇包埋体系可以为溶藻菌Halomona sp. DH-xbzhu提供一个稳定的生活环境，使溶藻菌具有良好的活性，溶藻菌在经历6h左右的延迟期后进入对数增长期，后期与游离菌生长状况趋于一致。
实施例7：固定化Halomonasp. DH-xbzhu菌剂的抑藻实验
考察固定化溶藻菌对东海原甲藻的抑制作用，固定化溶藻菌按照如下方式添加到藻液中：
（1）将固定化溶藻菌在28℃，160 rpm条件下活化12～14 h，取出后用无菌海水清洗3遍，分别取1g、3g、5 g固定化溶藻菌置于100 mL藻液（初始藻细胞密度为2.0×105～2.5×105 细胞/mL）中，以不加固定化溶藻菌的藻液为对照，置于光照培养箱中，培养条件为20±1℃，光暗比为12 L：12 D，光照强度为4000 lux，每天摇动2～3次，利用细胞计数板定时进行藻细胞计数，并计算溶藻率，结果如图10所示。
将固定化溶藻菌置于LB 培养基中，在28℃，160 rpm条件下活化3d，经离心得到无菌滤液，按0.5%、1.0%、1.5%的体积比添加至100 mL藻液（初始藻细胞密度为2.0×105-2.5×105 细胞/mL）中，定时对藻细胞计数，计算溶藻率，结果如图11所示。
由图10可知，实验36 h后，固定化溶藻菌的溶藻率分别为38.9%（1 g）、55.6%（3g）、67.6%（5 g），随着作用时间的逐渐延长，在实验60 h后，固定化溶藻菌的溶藻率分别为87.1%（1 g）、100.0%（3 g）、100.0%（5 g），结合经济性原则，3g固定化溶藻菌的投加量最优。由图11可知，添加无菌滤液时在处理24h时就有良好的溶藻率，溶藻率分别为76.7%（0.5%）、78.8%（1.0%）、82.4%（1.5%），且随着添加浓度的增加和处理时间的增长，溶藻率越来越高，处理48h时的溶藻率分别为93.8%（0.5%）、100.0%（1.0%）、100.0%（1.5%）。
实施例8：固定化菌剂的重复利用率
将经过上述使用过的固定化溶藻菌取出，用无菌海水清洗3～4遍，重新置于装有100mL藻液（初始藻细胞密度为2.0×105～2.5×105 细胞/mL）的250 mL锥形瓶中，3天后用细胞计数板进行藻细胞计数，计算溶藻率，重复上述操作3～4遍，考察固定化溶藻菌的重复利用率，结果如图12所示。结果显示第1次、第2次使用时第三天的溶藻率均达到了100%，但是由于使用次数的增多，固定化溶藻菌膨胀，溶藻菌部分流失，使第三次使用的溶藻率为17.2%。

Claims (10)

1.一株对甲藻具有溶解作用的细菌菌株，其分类命名为盐单胞菌DH-xbzhu （Halomonasp.DH-xbzhu），保藏于中国典型培养物保藏中心，菌种保藏号为CCTCC NO: M 2014541。
2.一种固定化菌剂，其特征在于：所述固定化菌剂含有如权利要求1所述的对甲藻具有溶解作用的细菌菌株。
3.如权利要求2所述的固定化菌剂，其特征在于：所述固定化菌剂含有包埋剂海藻酸钠与聚乙烯醇。
4.如权利要求3所述的固定化菌剂，其特征在于：所述固定化菌剂含有交联剂氯化钙和硼酸。
5.一种如权利要求4所述的固定化菌剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）细菌扩增及浓缩：将所述对对甲藻具有溶解作用的细菌菌株扩大培养，浓缩，配置成浓缩液；
（2）包埋剂配制：将重量浓度为2～5%的海藻酸钠，重量浓度为4～8%的聚乙烯醇分别置于水中，在80～100℃条件下水浴溶解，灭菌后混合均匀，制得混合包埋剂；
（3）交联剂配制：将1 g氯化钙溶液溶解于饱和硼酸溶液，灭菌后混合均匀，制得交联剂，4℃保存备用；
（4）固定化菌剂制备：将步骤（1）所制得的浓缩液以1:20体积比与步骤（2）所制得的包埋剂混合均匀，逐滴加入步骤（3）所制得的交联剂，制成直径4mm的颗粒，在4℃下固定24 h；
（5）保存：将步骤（4）所制得的颗粒用无菌水清洗3～4次，置于无菌海水中，于4℃冰箱保存。
6.如权利要求5所述的固定化菌剂的制备方法，其特征在于，海藻酸钠的重量浓度为5%，聚乙烯醇的重量浓度为4%。
7.如权利要求1所述的细菌菌株在溶解甲藻中的用途。
8.如权利要求8所述的用途，其中所述甲藻为东海原甲藻(Prorocentrumdonghaiense)、塔马亚历山大藻(Alexandrium tamarense)或米氏凯伦藻(Kareniamikimotoi Hansen)。
9.如权利要求2～4任一项所述的固化剂菌剂在溶解甲藻中的用途。
10.如权利要求9所述的用途，其中所述甲藻为东海原甲藻(Prorocentrumdonghaiense)、塔马亚历山大藻(Alexandrium tamarense)或米氏凯伦藻(Kareniamikimotoi Hansen)。
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