CN104561104A - 一种海洋盐单胞菌的分泌物及其提取方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种海洋盐单胞菌的分泌物及其提取方法与应用。将培养基按照酵母粉5g、胰蛋白胨10g和海水1L配制好后在121℃灭菌15-20min；然后将海洋盐单胞菌在无菌条件下接种到培养基中，于25-30℃恒温120-150转/min后转摇床上培养10-15天，再用0.22-0.45μm的膜过滤、除菌得到细菌分泌液上清；真空冷冻干燥滤液后，再用纯的乙酸提取、滤纸过滤脱盐；将得到的滤液挥干乙酸后即可获得海洋盐单胞菌分泌物的粗体物。本发明的分泌物可以用来治理赤潮，对赤潮甲藻塔玛亚历山大藻、东海原甲藻和米氏凯伦藻有抑制作用。本发明培养条件简单，产物无需进行提纯，只需过滤去菌体，且分泌物对赤潮甲藻抑制效果好。

Description

一种海洋盐单胞菌的分泌物及其提取方法与应用

技术领域

本发明涉及海洋盐单胞菌的分泌物及其提取方法与应用。

背景技术

近些年来海洋频繁地爆发甲藻藻花，而赤潮甲藻大多数产毒素，如溶血毒素(hemolysin)，麻痹性贝毒(Paralytic Shellfish Poisoning，PSP)，短裸甲藻毒素组毒素(Brevetoxin-group，BTX)，不仅赤潮本身对海洋生态环境产生严重的后果，而且藻类产生的这些毒素对海洋动物如鱼贝类都会产生巨大的危害，甚至威胁到人们的健康，因而受到沿海国家的高度重视。从现有条件看，一旦大面积赤潮出现后，还没有特别有效的方法加以制止，对于一些局部小范围防治赤潮的方法，虽实验过多种，但效果还不够理想。主要是利用化学药物(硫酸铜)杀灭赤潮生物，但效果欠佳，费用昂贵，经济效益和环境效益均不太好；有的采用网具捕捞赤潮生物，或采用隔离手段把养殖区保护起来等等。这些方法均在实验中，还未取得较大的突破，从发展趋势看，生物控制法，即分离出对赤潮藻类合适的控制生物，以调节海水中的富营养化环境将是较好的选择。但是在大海中，加抑藻物质抑制藻种，必须有瞬间的杀藻效果，如果作用的时间一长，由于海水的稀释作用，很快将其稀释掉，因此至今未能找到有效的抑制赤潮藻的物质。即便有些物质有此效果，但是由于其提取的过程繁琐，费用高，无法在实践中应用。

发明内容

本发明实施例所要解决的技术问题在于，提供一种海洋盐单胞菌的分泌物及其提取方法与应用，解决现有技术存在的问题。

为了实现上述的目的，采用如下的技术方案：一种海洋盐单胞菌的分泌物的提取方法，包括以下步骤：

步骤一，将培养基按照以下比例配制好：酵母粉5g、胰蛋白胨10g和海水1L；

步骤二，将配置好的培养基在121℃灭菌15-20min；

步骤三，将海洋盐单胞菌在无菌条件下接种到培养基中，于25-30℃恒温120-150转/min摇床上培养10-15天，细菌可充分的分泌代谢物；

步骤四，用0.22-0.45μm的膜过滤、除菌得到细菌分泌液上清；

步骤五，将得到的滤液真空冷冻干燥，再用纯的乙酸提取、滤纸过滤脱盐；

步骤六，将得到的滤液挥干乙酸后得到海洋盐单胞菌的分泌物的粗体物，用超纯水溶解得到粗提液。

进一步地，步骤四所述的细菌分泌液上清OD₂₆₇为1.4-1.6；步骤六所述的粗提液OD₂₆₇为1.4-1.6，浓度为7.0mg/mL。

一种海洋盐单胞菌的分泌物的应用，主要是用来治理赤潮，对赤潮甲藻塔玛亚历山大藻、东海原甲藻和米氏凯伦藻有明显的抑制作用，而对海洋中的一些无毒绿藻、硅藻和蓝藻并没有抑制作用。其中绿藻包括小球藻；硅藻包括三角褐指藻、纤细角毛藻、小新月菱形藻和中肋骨条藻；蓝藻包括拟柱胞藻和铜绿微囊藻。

进一步地，海洋盐单胞菌的分泌物对赤潮甲藻的最小抑制浓度MIC为1.4-3.5mg/100mL，并且随着分泌物浓度的增加，对赤潮甲藻的抑制效果越明显。

与现有技术相比，本发明的细菌的分泌物，可以对海洋中常见的赤潮甲藻塔玛亚历山大藻，东海原甲藻，米氏凯伦藻有明显的杀伤作用，而对海洋中的一些无毒硅藻，绿藻并没有抑制作用。因此可以在一些地区选择性的杀死有毒的赤潮甲藻，而对一些有益藻种生长也具有积极的影响。而且细菌的培养条件简单，产物无需进行提纯，只需过滤去菌体即可，代谢物的作用时间快速，瞬间抑制效果好，这种“以菌抑藻”方法对以后在赤潮藻预防治理中有明显应用前景。

附图说明

图1是一种海洋盐单胞菌的分泌物的提取方法流程图。

图2是海洋盐单胞菌的单菌落图。

图3是不同浓度的海洋盐单胞菌的分泌物的粗体物对是绿藻、硅藻和蓝藻抑制的情况。

图4是不同浓度的海洋盐单胞菌的分泌物的粗体物对赤潮甲藻塔玛亚历山大藻、东海原甲藻和米氏凯伦藻抑制的情况。

图5是进一步的研究海洋盐单胞菌的分泌物对塔玛亚历山大藻生长的影响。

图6是进一步的研究海洋盐单胞菌的分泌物对东海原甲藻生长的影响。

图7是进一步的研究海洋盐单胞菌的分泌物对米氏凯伦藻生长的影响。

图8是东海原甲藻放大40倍的图，其中图a为正常的东海原甲藻细胞，图b-e是代表加了海洋盐单胞菌的分泌液后细胞所呈现的畸变形态。

图9是塔玛亚历山大藻放大40倍的图，其中图f为正常的塔玛亚历山大藻，图g-j是代表加了海洋盐单胞菌的分泌液后细胞所呈现的畸变形态。

图10是米氏凯伦藻放大40倍的图，其中图k为正常的米氏凯伦藻，图l-o是代表加了海洋盐单胞菌的分泌液后细胞所呈现的畸变形态。

图11是海洋盐单胞菌对3种赤潮甲藻短期抑制的效果流程图。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作进一步地详细描述。

实施例1

本实施例中提取海洋盐单胞菌的分泌物的具体流程如图1所示。

步骤一，将培养基按照以下比例配制好：酵母粉5g、胰蛋白胨10g和海水1L；

步骤二，将配置好的培养基在121℃灭菌15min；

步骤三，将如图2所示海洋盐单胞菌在无菌条件下接种到培养基中，于30℃恒温120转/min摇床上培养10天，细菌可充分的分泌代谢物；

步骤四，用0.45μm的膜过滤、除菌得到细菌分泌液上清，OD₂₆₇为1.4；

步骤五，将得到的滤液真空冷冻干燥，再用纯的乙酸提取、滤纸过滤脱盐；

步骤六，将得到的滤液挥干乙酸后得到海洋盐单胞菌的分泌物的粗体物，用超纯水溶解得到粗提液，OD₂₆₇为1.4，浓度7.0mg/mL。

海洋盐单胞菌从中国东海分离筛选出。

实施例2

本实施例中提取海洋盐单胞菌的分泌物的具体流程如图1所示。

步骤一，将培养基按照以下比例配制好：酵母粉5g、胰蛋白胨10g和海水1L；

步骤二，将配置好的培养基在121℃灭菌20min；

步骤三，将如图2所示海洋盐单胞菌在无菌条件下接种到培养基中，于25℃恒温，150转/min摇床上培养15天，细菌可充分的分泌代谢物；

步骤四，用0.22μm的膜过滤、除菌得到细菌分泌液上清，OD₂₆₇为1.6；

步骤五，将得到的滤液真空冷冻干燥，再用纯的乙酸提取、滤纸过滤脱盐；

步骤六，将得到的滤液挥干乙酸后得到海洋盐单胞菌的分泌物的粗体物，用超纯水溶解得到粗提液，OD₂₆₇为1.6，浓度7.0mg/mL。

实施例3

粗提液与藻液按照1:50，1:100，1:200，1:500的比例混合培养，培养8天，得到浓度14.0mg/100mL，7.0mg/100mL，3.5mg/100mL，1.4mg/100mL海洋盐单胞菌的分泌物。用以研究不同浓度的分泌物的粗体物对不同的藻抑制的效果(空白对照)。

图3是不同浓度的海洋盐单胞菌的分泌物的粗体物对是绿藻、硅藻和蓝藻抑制的情况，其中绿藻包括小球藻，硅藻包括三角褐指藻，纤细角毛藻，小新月菱形藻和中肋骨条藻，蓝藻包括拟柱胞藻和铜绿微囊藻，他们的起始OD₆₈₀约为0.04(这些细胞相对很小，以吸光度作为藻细胞浓度的大小)；实验表明，培养8天后，分泌物对这些藻类并没有抑制作用，这些藻类都能在八天内达到赤潮的浓度。

图4是不同浓度的海洋盐单胞菌的分泌物的粗体物对赤潮甲藻抑制效果。赤潮甲藻包括东海原甲藻，塔玛亚历山大藻和米氏凯伦藻。实验表明：随着分泌物浓度的增加，对藻细胞的抑制效果越明显。

实施例4

浓度为0.7mg/100mL、1.4mg/100mL、3.5mg/100L 7.0mg/100L海洋盐单胞菌的分泌物不同培育时间对三种赤潮甲藻的进一步研究。

如图5、图6、图7所示，分泌物对三种赤潮甲藻的最小抑制浓度MIC在1.4-3.5mg/100mL。试验还表明，在3.5mg/100mL，7.0mg/100mL的浓度下，培养24h，显微镜下观察，发现塔玛亚历山大藻和米氏凯伦藻几乎没有运动的细胞。有些细胞已经出现细胞破裂的现象；东海原甲藻也有70％-80％的细胞已经停止运动，运动的细胞其活力也有明显的下降，细胞的分裂速度明显的被抑制。

图8中的a-e为东海原甲藻放大40倍的图，其中图a为正常的东海原甲藻细胞，图b-e是代表加了海洋盐单胞菌的分泌物后细胞所呈现的畸变形态。加入分泌液后藻细胞首先会逐渐停止游动，加的分泌液的量越多，细胞停止所用的时间越短。随着时间的推移发现停止运动的藻细胞的细胞壁和细胞质分离脱落，有的细胞内含物也在也在从细胞中逐渐的释放到细胞外。

图9中的f-j是塔玛亚历山大藻放大40倍的图，其中图f为正常的塔玛亚历山大藻，图g-j是代表加了海洋盐单胞菌的分泌液后细胞所呈现的畸变形态。加入分泌液后藻细胞首先会逐渐停止游动，加的分泌液的量越多，细胞停止所用的时间越短。随着时间的推移发现停止运动的藻细胞的细胞壁和细胞质分离脱落，有的细胞内含物也在也在从细胞中逐渐的释放到细胞外。

图10中的k-o为米氏凯伦藻放大40倍的图，其中图k为正常的米氏凯伦藻细胞，图l-o是代表加了海洋盐单胞菌的分泌物后米氏凯伦藻细胞所呈现的畸变形态。加入分泌物后藻细胞首先会逐渐停止游动，加的分泌液的量越多，细胞停止所用的时间越短。由于米氏凯伦藻为裸甲藻，随着时间的推移，藻细胞变成球形，然后细胞破裂，细胞内的内含物都会大量释放到胞外。

实施例5

进一步研究海洋盐单胞菌的分泌物对三种赤潮甲藻短期抑制的效果。

研究过程如图11所示流程，细菌分泌物的粗体物的水溶液(OD₂₆₇＝1.4左右)与三种甲藻溶液(东海原甲藻，塔玛亚历山大藻和米氏凯伦藻)按照一定比列1：10、1：20、1：40、1：80和1：100混合(藻种的浓度4000-5000cell/mL，混合后分泌物的含量分别为0.70mg/ml、0.350mg/ml、0.175mg/ml、0.088mg/ml和0.07mg/ml)培养5min。空白对照样则是将细菌新鲜培养液按照相同的比例共培养5min，显微镜下先计算空白组中静止的细胞N1，细胞固定液固定细胞计算总的细胞N，然后计算实验组静止细胞数S。分泌物对不同藻种的短期抑制率的计算公式如下：

表1是根据上述方法得到的海洋盐单胞菌的分泌物对不同藻种的短期抑制率，表中的10:1、20:1、40:1、80:1和100:1为藻液与分泌液的比例。从表中可以看出当分泌物的浓度达到0.35mg/ml时，作用5min后对塔玛亚历山大藻的抑制率已经达到了100％，东海原甲藻和米氏凯伦藻的抑制率也达到90％以上。当分泌物的浓度达到0.70mg/ml时，作用5min后对塔玛亚历山大藻、东海原甲藻和米氏凯伦藻的抑制率均达到100％。显微镜下观察，发现粗提物在刚加到藻液中时，视野里可观察到有藻细胞停止运动(10s左右)。说明细菌的分泌液对藻细胞有瞬间杀伤的效果。

表1是海洋盐单胞菌的分泌物对不同藻种的短期抑制率(％)

以上所揭露的仅为本发明一种较佳实施例而已，当然不能以此来限定本发明之权利范围，因此依本发明权利要求所作的等同变化，仍属本发明所涵盖的范围。

Claims (5)

1.一种海洋盐单胞菌的分泌物的提取方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤一，将培养基按照以下比例配制好：酵母粉5g、胰蛋白胨10g和海水1L；

步骤二，将配置好的培养基121℃,灭菌15-20min；

步骤三，将海洋盐单胞菌在无菌条件下接种到培养基中，于25-30℃恒温120-150转/min在摇床上培养10-15天，细菌可充分的分泌代谢物；

步骤四，用0.22-0.45μm的膜过滤、除菌得到细菌分泌液上清；

步骤五，将得到的滤液真空冷冻干燥，再用纯的乙酸提取、滤纸过滤脱盐；

步骤六，将得到的滤液挥干乙酸后即可获得海洋盐单胞菌分泌物的粗体物，用超纯水溶解得到粗提液。

2.按照权利要求1所述海洋盐单胞菌的分泌物的提取方法，其特征在于，步骤四所述的细菌分泌液上清OD₂₆₇为1.4-1.6；步骤六所述的粗提液OD₂₆₇为1.4-1.6，浓度为7.0mg/mL。

3.一种按照权利要求1或2所述方法提取的海洋盐单胞菌的分泌物。

4.按照权利要求3所述分泌物的应用，其特征在于，用于治理赤潮，对赤潮甲藻东海原甲，藻塔玛亚历山大藻和米氏凯伦藻有抑制作用。

5.按照权利要求4所述分泌物的应用，其特征在于，所述分泌物对所述赤潮甲藻的最小抑制浓度MIC为1.4-3.5mg/100mL。