JP2002065270A - 耐熱性フェニルアラニン脱水素酵素遺伝子、それを含有する組換えベクター、その組換えベクターを含有する形質転換体及びその形質転換体を用いた耐熱性フェニルアラニン脱水素酵素の製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 （修正有） 【課題】 フェニルアラニン測定等に使用可能な耐熱性
フェニルアラニン脱水素酵素を大量に生産するための遺
伝子材料及びそれによる上記酵素の製造方法の提供。 【解決手段】 好熱性細菌であるハロモナスパシフィカ
由来の特定のアミノ酸配列又は上記アミノ酸配列におい
て１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加
されたアミノ酸配列からなるフェニルアラニン脱水素酵
素をコードする遺伝子。上記遺伝子を含有する組換えベ
クター。上記組換えベクターを含む形質転換体。上記形
質転換体の培養による耐熱性フェニルアラニン脱水素酵
素の製造方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明はフェニルアラニンの
定量等に用いられる耐熱性フェニルアラニン脱水素酵素
をコードする遺伝子と、この遺伝子を含有する組換えベ
クター、組換えベクターによる形質転換体、並びにこの
形質転換体による耐熱性フェニルアラニン脱水素酵素の
製造方法に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】フェニルアラニン脱水素酵素は、フェニ
ルアラニンやフェニルピルビン酸の定量やL-α-アミノ
カルボン酸の製造に利用される酵素であり、産業上の利
用における観点からより安定な酵素が望まれている。今
日までに種々の微生物由来のフェニルアラニン脱水素酵
素が知られている。例えばブレビバクテリウム（Brevib
acterium）属由来の酵素（特開昭５９−１９８９７２
号）、ロドコッカス（Rhodococcus）属由来の酵素（特
開昭６１−１４６１８３号）、スポロサルシナ（Sporos
arcina）属由来の酵素（特公平６−３０５７２号）、バ
チルス（Bacillus)属由来の酵素（特公平６−５５１３
７号、特公平６−３０５７３号）、マイクロバクテリウ
ム（Microbacterium）属由来の酵素（Arch. Microbiol.
169, 220, 1998）およびサーモアクチノマイセス（The
rmoactinomyces)属由来の酵素（特公平８−２９０７９
号）があったが、その安定性は未だ満足の行くものでは
なかった（特開平６３−１５７９８６号）。

【０００３】この状況下、本発明者らは海洋砂から分離
したハロモナス パシフィカ（Halomona pacifica）Ｕ
ＴＢ２３０１（FERM P-17711）と同定した好熱性細菌が
従来の酵素より安定な耐熱性フェニルアラニン脱水素酵
素を産生することを見い出した（特願平２０００―３０
５１９号）。この発明により、産業利用上から望まれて
いるフェニルアラニン脱水粗酵素を入手することができ
た。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】しかし、このハロモナ
ス パシフィカ（Halomona pacifica）ＵＴＢ２３０１
（FERM P-17711）と同定した細菌による耐熱性フェニル
アラニン脱水素酵素の生産性は充分とはいえず、より効
果的な生産技術の開発が切望されていた。また、当該フ
ェニルアラニン脱水素酵素遺伝子のクローニングは未だ
報告されていない。

【０００５】本発明は、ハロモナス パシフィカ（Halo
mona pacifica）ＵＴＢ２３０１由来に耐熱性フェニル
アラニン脱水素酵素を遺伝子工学的に大量製造するため
の遺伝子操作材料と、この材料を用いた耐熱性フェニル
アラニン脱水素酵素の製造方法を提供することを目的と
している。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明者等は、このよう
な課題を解決するために鋭意研究を行なった結果、上記
のハロモナス パシフィカが産生する耐熱性フェニルア
ラニン脱水素酵素遺伝子を単離及び構造決定することに
成功し、さらに、耐熱性フェニルアラニン脱水素酵素を
コードする遺伝子をベクターＤＮＡに挿入した組換え体
ＤＮＡを得、この組換え体をエシェリシア属に属する菌
株などに含ませた該耐熱性フェニルアラニン脱水素酵素
生産能を有する菌株を培地で培養すると、効率よく該耐
熱性フェニルアラニン脱水素酵素が生産されること等を
見出し、本発明を完成した。

【０００７】すなわち、本発明の第一は、配列番号１で
示されるアミノ酸配列又は配列番号１で示されるアミノ
酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換
もしくは付加されたアミノ酸配列からなる耐熱性フェニ
ルアラニン脱水素酵素をコードする遺伝子を要旨とする
ものである。また、本発明の第二は、配列番号２で示さ
れる塩基配列又は配列番号２で示される塩基配列におい
て１もしくは数個の塩基が欠失、置換もしくは付加され
た塩基配列からなるＤＮＡを有し、かつ耐熱性フェニル
アラニン脱水素酵素をコードする遺伝子を要旨とするも
のである。さらに、本発明の第三は、第一又は第二の発
明の遺伝子を含有する組換えベクターを要旨とするもの
である。本発明の第四は、第三の発明の組換えベクター
を含む形質転換体を要旨とするものである。本発明の第
五は、第四の発明の形質転換体を培地中で培養し、培養
物から耐熱性フェニルアラニン脱水素酵素を採取するこ
とを特徴とする耐熱性フェニルアラニン脱水素酵素の製
造方法を要旨とするものである。

【０００８】

【発明の実施の形態】本発明に係る耐熱性フェニルアラ
ニン脱水素酵素は、配列番号１で示したアミノ酸配列、
又は該アミノ酸配列の１もしくは数個のアミノ酸が欠
失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を有するタン
パク質である。耐熱性フェニルアラニン脱水素酵素を失
わない限り、該アミノ酸配列中のアミノ酸の欠失置換又
は付加（以下、変異ということがある）は特に限定され
ない。本発明の遺伝子は上記アミノ酸配列をコードする
遺伝子であって、具体的には、配列番号２の塩基配列か
らなるＤＮＡに代表される遺伝子である。本遺伝子ｐＮ
Ｎ２３は、工業技術院生命工学工業技術研究所にＦＥＲ
Ｍ Ｐ−１７９９４として寄託されている。

【０００９】本発明の遺伝子によりコードされる耐熱性
フェニルアラニン脱水素酵素遺伝子（配列番号１）と従
来公知のフェニルアラニン脱水素酵素との相同性を比較
すると、B. Badiusの酵素とは７０．０％、B. sphericu
sの酵素とは６９．５％、S.ureaseの酵素とは６８．１
％、T. intermediusの酵素とは５２．５％の相同性を示
した。相同性の最も高いB. badiusの酵素は６０℃以上
の温度では非常に不安定なのに対し、本発明の耐熱性フ
ェニルアラニン脱水素酵素は７５℃１時間処理しても失
活しない。また、７０℃まで安定なT. intermedius由来
フェニルアラニン脱水素酵素との相同性は約５０％とBa
cillus属由来酵素より低かった。このように、本発明に
より得られる耐熱性フェニルアラニン脱水素酵素は、Ba
cillus属由来フェニルアラニン脱水素酵素との相同性が
高いにもかかわらず、耐熱性を有している。即ち本発明
の耐熱性フェニルアラニン脱水素酵素遺伝子は、従来の
ものと異なり、耐熱性を有する耐熱性フェニルアラニン
脱水素酵素をコードする新規な遺伝子である。従って、
本遺伝子と７１％以上相同性を有する耐熱性フェニルア
ラニン脱水素酵素遺伝子は本発明に含まれる。

【００１０】本発明の耐熱性フェニルアラニン脱水素酵
素遺伝子供与体微生物としては、海洋砂から分離したハ
ロモナス（Halomonus）属に属する微生物、例えばハロ
モナス パシフィカ（Halomonas pacifica） ＵＴＢ２
３０１（FTRM P-17711）が挙げられる。該微生物を培養
して得られた培養液から遠心分離により菌体を得ること
ができ、該菌体からの耐熱性フェニルアラニン脱水素酵
素遺伝子を含んだ染色体ＤＮＡの調製は、例えば、マー
マーの方法（Marmur, J. Mol. Biol. 3, 208,1961）や
斉藤と三浦の方法（Saito & Miura. Biochim. Biophys.
Acta, 72, 619, 1963）等で行うことができる。また、
耐熱性フェニルアラニン脱水素酵素遺伝子を含む染色体
ＤＮＡ断片の調製は、ショットガンクローニング法、ハ
イブリダイゼーション法やＰＣＲ法を用いて行うことが
できる。

【００１１】さて、ＵＴＢ２３０１株は、本出願人が既
に出願している（特願２０００−３０５１９号）如く、
菌学的性質からはハロモナス パシフィカ（Halomona p
acifica）に属する菌株と同定されたが、その後、表１
に示した１６Ｓ ｒＲＮＡ分析の結果バチルス（Bacilu
s）属細菌に非常に近いことが判明した。しかし、グラ
ム染色（−）、胞子形成能（−）などバチルス属とは言
い難い結果もあり、現在のところ結論に至っていないが
バチルス属に近いと推定される。したがって、学会等に
おける発表ではバチルス エスピー（Bacillus sp.）
ＵＴＢ２３０１としている場合があるが、これはハロモ
ナス パシフィカ（Halomona pacifica） ＵＴＢ２３０
１（FTRM P-17711）と同一である。

【００１２】

【表１】

【００１３】一方、ベクターとしては、宿主菌内で複製
維持可能であり、耐熱性フェニルアラニン脱水素酵素遺
伝子を発現させることができ、組み込まれた該遺伝子を
安定に保持できれば如何なるものも使用可能である。例
えば、大腸菌を宿主とする場合、例えばpET-3b（ノバジ
ェン社製）、pKK223-3（ファルマシア社製）、pUC19
（宝酒造社製）、pBluescriptKS(+)（ストラタジーン社
製）、pBR322（東洋紡社製）等のプラスミドＤＮＡがあ
げられる。

【００１４】かくしてクローニングされた染色体ＤＮＡ
断片と制限酵素で切断したベクターとの組換えが、ＤＮ
Ａリガーゼを用いて行われる。得られた組換え体ＤＮＡ
による宿主菌の形質転換は、コンピテント・セル法、プ
ロトプラスト法及びエレクトロポレーション等により行
うことができる。宿主菌としては、特に制限されない
が、バチルス（Bacillus）属（枯草菌）、ストレプトミ
セス（Streptomyces）属等のグラム陽性菌、エシェリシ
ア コリ（E. coli）等のグラム陰性菌、サッカロマイ
セス（Saccharomyces）属、アスペルギルス（Aspergill
us）属等の真菌類が挙げられる。

【００１５】このような遺伝子の単離及びこの遺伝子を
含有する組換えベクターの作成、組換えベクターによる
形質転換体の作成、並びに形質転換体の培養等は公知の
方法、例えばモレキュラー・クローニング（コールドス
プリングハーバー出版社、１９８９年）、カレント・プ
ロトコールス・イン・モレキュラー・バイオロジー（ウ
ィリー・インターサイエンス出版社、１９８９年）等に
記載されている方法を組み合わせて行なうことができ
る。

【００１６】このようにして製造した形質転換体を用い
て耐熱性フェニルアラニン脱水素酵素を製造する方法と
しては、まず、形質転換体をフェニルアラニン脱水素酵
素の生産に適し、かつそれぞれの宿主微生物の生育に適
した適当な炭素源、窒素源やミネラル等を含んだ培地
で、培養、集菌させる。形質転換体の培養温度は２０〜
４２℃が好ましく、更に好ましくは３０〜４０℃であ
る。次に、得られた形質転換体の菌体を超音波等で破砕
或いはリゾチーム等で溶菌し、遠心分離することによっ
て耐熱性フェニルアラニン脱水素酵素を製造することが
できる。さらに、遠心上清から市販のイオン交換樹脂、
疎水クロマト樹脂、アフィニティー樹脂等を用いて耐熱
性フェニルアラニン脱水素酵素を精製することができ
る。また、目的酵素が非常に熱に対して安定であること
から、破砕又は溶菌液、遠心上清等を６０〜７５℃、５
〜６０分程度加温することにより、宿主微生物の熱に不
安定な蛋白質を変性・不溶化させて容易に分離すること
もできる。

【００１７】なお、本耐熱性フェニルアラニン脱水素酵
素の活性は、１０ｍＭフェニルアラニン、１００ｍＭグ
リシン−ＫＯＨ、１．２５ｍＭ ＮＡＤ、ｐＨ１０．
６、５０℃の条件下で、生成するＮＡＤＨの増加率を３
４０ｎｍの吸光度変化として測定して求めた。本酵素活
性は、上記条件下で、1分間に１μモルのＮＡＤＨを生
成しうる酵素量を１単位（Ｕ）と定義した。

【００１８】

【実施例】次に、本発明を実施例及び比較例によって具
体的に説明する。 実施例１：ＰＣＲによる部分的クローニングとＤＮＡシ
ーケンス ハロモナス パシフィカ（Halomona pacifica） ＵＴＢ
２３０１株から特願２０００−３０５１９号の方法で耐
熱性フェニルアラニン脱水素酵素を精製した。精製酵素
をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した後、エレクトロブロッティ
ングによりＰＶＤＦ膜に転写した。転写した膜をＰｏｎ
ｃｅａｕ Ｓで染色し耐熱性フェニルアラニン脱水素酵
素のバンドを切り出した。これをＰＲＯＴＥＩＮ ＳＥ
ＱＵＥＮＣＥＲ ＰＰＳＱ−１０（島津製作所）により
分析した。その結果、Ｎ末端アミノ酸配列は配列番号３
の通り決定した。また、従来からアミノ酸配列の知られ
ているバチルス バディウス（Bacillus badius）、バ
チルス スフェリカス（B.sphericus）、サーモアクチ
ノマイセス インターメディウス（Thermoactinomyces
intermedius）、スポロサルシナ ウレアーゼ（Sporosa
rcina urease）から報告されているフェニルアラニン脱
水素酵素遺伝子のアミノ酸配列中の２箇所のホモロジー
ボックスの存在を確認した。Ｎ末端アミノ酸配列及びＣ
末端により近いホモロジーボックスのアミノ酸配列（配
列番号４）から配列番号５及び配列番号６に記載したＤ
ＮＡプライマーを作成した。

【００１９】一方、ハロモナス パシフィカ（Halomona
pacifica） ＵＴＢ２３０１株を０．５％ポリペプト
ン、０．５％酵母エキス、０．１％リン酸水素２カリウ
ム、０．０２％硫酸マグネシウム、１％塩化ナトリウム
の液体培地（pH７．５）に接種し振盪培養した。培養
後、菌体を遠心分離により集め、プロメガ社のWizard G
enomic DNA Purification kitを用いてゲノムＤＮＡを
調製した。

【００２０】次ぎに、ＰＣＲを行った。ＰＣＲ用緩衝液
１０μＬ、ｄＮＴＰ８μＬ、上流プライマー５μＬ
（０．１μＭ）（配列番号５）、下流プライマー５μＬ
（０．１μＭ）（配列番号６）、鋳型ＤＮＡ１μＬ（１
μｇ）、ＥｘＴａｑポリメラーゼ（宝酒造社製）１μＬ
（２．５Ｕ）及び滅菌脱イオン水を加え総量１００μＬ
とし、９４℃１分間の熱変成後、５５℃１分間、７２℃
２分間の条件でＤＮＡ増幅を行った。得られたＰＣＲ産
物（約０．９ｋｂ）は、アガロースゲルで分離した後、
そのバンドを切り出し、GENECLEAN II（フナコシ社製）
を用いて抽出精製した。このＤＮＡ断片はｐＧＥＭ−Ｔ
ベクター（ＢＩＯ １０１社製）にライゲーション（１
６℃、１夜）し組換えＤＮＡを得た。得られた組換えＤ
ＮＡを大腸菌ＪＭ１０９コンピテントセル（宝酒造社
製）に導入し形質転換した。形質転換株はＬＢプレート
（アンピシリン、Ｘ−Ｇａｌ、ＩＰＴＧ含有）上で白い
コロニーを形成することで選択した。この形質転換株か
らアルカリ−ＳＤＳ法によりプラスミドＤＮＡを調製
し、一部を制限酵素ＢｓｔＺＩで切断してインサートＤ
ＮＡを確認した。このようにして得られた形質転換株の
保持していたプラスミドをｐＮＭ０３と命名した。この
ｐＮＭ０３はＱＩＡｐｒｅｐ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用
いて調製し、アイシン・コスモ研究所で配列決定した
（配列番号７）。得られたＤＮＡ配列から推定されるア
ミノ酸配列は従来から知られているフェニルアラニン脱
水素酵素のものと高い相同性を示した。このことから得
られたＤＮＡは耐熱性フェニルアラニン脱水素酵素の一
部であることがわかった。

【００２１】実施例２：コロニーハイブリダイゼーショ
ンによる全構造遺伝子のクローニングとＤＮＡシーケン
ス ハイブリダイゼーション用プローブを作成した。ｐＮＭ
０３ ＤＮＡ１２μｇ、１０×バッファー１０μＬ、Ｅ
ｃｏＲＩ １００Ｕ、ＰｓｔＩ １００Ｕ及び滅菌脱イ
オン水を加え総量１００μＬとして３７℃で１夜反応さ
せた。制限酵素で切断されたＤＮＡ断片はアガロースゲ
ル電気泳動で分離した後、そのバンドを切り出し、GENE
CLEAN II（ＢＩＯ １０１社製）を用いて抽出精製し
た。ＤＩＧラベリング＆デテクションキット（ロシュ・
ダイアグノスティックス社製）を用いてＤＩＧ標識し
た。得られたＤＮＡ断片１μｇを１５μＬの滅菌脱イオ
ン水で溶解し１００℃１０分間処理した後、直ちに氷冷
した。このＤＮＡ１５μＬ（１μｇ）、ヘキサヌクレオ
チド混合液２μＬ、ｄＮＴＰ標識混合液２μＬ及びクレ
ノー酵素１μＬを混合して３７℃２０時間反応させてＤ
ＩＧ標識した。この反応液からエタノール沈殿によりＤ
ＩＧ標識プローブを回収し７８μＬのＴＥに溶解してＤ
ＩＧ標識プローブ溶液を作成した。また、ゲノムＤＮＡ
を制限酵素ＨｉｎｃＩＩで切断し、ＳｍａＩで切断した
ｐＵＣ１８にライゲーションし、大腸菌ＪＭ１０９コン
ピテントセル（宝酒造社製）に導入し形質転換した。Ｌ
Ｂプレート（アンピシリン含有）に播種した形質転換体
のコロニーをナイロンメンブランにレプリカした。この
ナイロンメンブランを乾燥、変性・中和後、２×ＳＳＰ
Ｅと０．４Ｎ水酸化ナトリウムで処理した。その後、３
×ＳＳＰＥ・０．１％ＳＤＳで６５℃１時間処理した。
次ぎにハイブリバックにナイロンメンブランを入れ、予
め加温したハイブリバッファーを加え６５℃１０分間以
上プレハイブリダイゼーションさせ、ハイブリバッファ
ーを除いた。一方、ＤＩＧ標識プローブ溶液２０μＬと
ハイブリバッファー１ｍＬを混合し、１００℃１０分間
処理した後、ハイブリバッファー９ｍＬを加えた溶液を
調製した。この溶液をプレハイブリダイゼーションした
ナイロンメンブランと接触させ６５℃１夜ハイブリダイ
ゼーションさせた。次ぎにハイブリバッファーを除き、
予め６５℃に加温した洗浄バッファーで３回ナイロンメ
ンブランを洗浄した。更にキットのマニュアルに従って
検出を行った。陽性コロニーを８株ピックアップしＬＢ
培地（アンピシリン含有）で培養し、プラスミドを調製
した。得られたプラスミドは制限酵素ＥｃｏＲＩとＰｓ
ｔＩで切断し、ｐＮＭ０３の場合と同じ長さの断片を生
じることを確認した。これらのうちの１つをｐＮＭ０４
と命名した。

【００２２】ｐＮＭ０４はＱＩＡＧＥＮ社のキットを用
いて調製した後、ＥｃｏＲＩで処理した断片をＥｃｏＲ
Ｉで切断後脱リン酸化したｐＵＣ１８にライゲーション
した。これで大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換し、プレー
ト上のブルーホワイトセレクションを行った。ホワイト
コロニーを８つピックアップしてアンピシリン含有ＬＢ
培地で培養した後、プラスミドを調製した。調製したプ
ラスミドはＤＩＧ標識プローブを用いたサザンハイブリ
ダイゼーションにより選別した。得られたプラスミドは
ｐＮＭ０６と命名した。同様にｐＮＭ０４を制限酵素Ｐ
ｓｔＩで処理し、同様の工程で得られたプラスミドｐＮ
Ｍ０７と命名した。なお、ｐＮＭ０４とｐＮＭ０６及び
ｐＮＭ０７のそれぞれの挿入ＤＮＡ部分の関係を図１に
示した。ＱＩＡＧＥＮ社のキットを用いて調製したｐＮ
Ｍ０６とｐＮＭ０７はアイシン・コスモ研究所でインサ
ート部分の配列を決定した。その結果、耐熱性フェニル
アラン脱水素酵素の全遺伝子配列が得られた（配列番号
２）。このハロモナス パシフィカ（Halomona pacific
a） ＵＴＢ２３０１株由来の耐熱性フェニルアラニン脱
水素酵素のアミノ酸配列はバチルス バディウス（B. b
adius）の酵素とは７０．０％、バチルス スフェリカ
ス（B. sphericus）の酵素とは６９．５％、スポロサル
シナ ウレアーゼ（S. urease）の酵素とは６８．１
％、サーモアクチノマイセス インターメディウス（T.
intermedius）の酵素とは５２．５％の相同性を示し
た。

【００２３】実施例３：発現用ベクターの調製 発現用ベクタープラスミドの調製概略は図２に示してい
る。ｐＮＭ０６を制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＰｓｔＩで同
時に処理し、得られた０．５ｋｂ断片をアガロースゲル
電気泳動で分離後上述の方法で回収した。ｐＮＭ０７を
制限酵素ＰｓｔＩとＨｉｎｄＩＩＩで同時に処理し、得
られた１．０ｋｂ断片を同様に分離回収した。ｐＵＣ１
８を制限酵素ＥｃｏＲＩとＨｉｎｄＩＩＩで同時に切断
し、脱リン酸化処理した。以上３種のＤＮＡ断片をライ
ゲーションし、大腸菌ＪＭ１０９を形質転換した。形質
転換体はブルーホワイトコロニーで選択し、８個のコロ
ニーをアンピシリン含有ＬＢ培地で培養し、プラスミド
を調製した。調製したプラスミドは、制限酵素Ｈｉｎｄ
ＩＩＩ、ＥｃｏＲＩ及びＰｓｔＩで同時に切断し０．５
及び１．０ｋｂの断片を生じることを確認した。得られ
たプラスミドをｐＮＮ２３と命名し、工業技術院生命工
学工業技術研究所にＦＥＲＭ Ｐ−１７９９４として寄
託された。

【００２４】実施例４：組換え体による耐熱性フェニル
アラニン脱水素酵素の生産 ｐＮＮ２３で形質転換された大腸菌ＪＭ１０９（pNN23/
JM109）をアンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ培地
３ｍＬに接種し、３７℃１夜振盪培養した。この培養液
をアンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ培地１００ｍ
Ｌに接種し、３７℃で振盪培養した。培養液の６６０ｎ
ｍの吸光度が０．８となった時にＩＰＴＧを０．２ｍＭ
となるように添加し更に４時間培養を継続した後に集菌
した。得られた菌体全てを１０％グリセロール、１ｍＭ
ＥＤＴＡ、０．１ｍＭ ＤＴＴを含む１０ｍＭリン酸
カリウム緩衝液ｐＨ７．２に懸濁し、超音波により破砕
した。破砕液は、遠心分離により菌体残渣を除き粗酵素
液を得た。粗酵素液のフェニルアラニン脱水素酵素活性
と蛋白質濃度を測定した。耐熱性フェニルアラニン脱水
素酵素の総量は４５５．４Ｕであった。これは、比較例
１から計算して野生株の１００倍以上の生産性であっ
た。次ぎに粗酵素液を７５℃３０分間熱処理し、不溶物
を遠心分離で除去した。この熱処理溶液のフェニルアラ
ニン脱水素酵素活性と蛋白質濃度を測定した。実施例
４、比較例１及び２の結果を表２にまとめた。

【００２５】

【表２】

【００２６】粗酵素液の比活性は、組換え生産により約
３０倍アップし、熱処理後では約１４０倍アップしてい
ることがわかった。なお、ハロモナス パシフィカ（Ha
lomonas pacifica） ＵＴＢ２３０１をここではバチル
ス エスピー（Bacillus sp.）と示している。

【００２７】実施例５：組換え耐熱性フェニルアラニン
脱水素酵素の性質測定 また、熱処理溶液を用いてフェニルアラニン脱水素酵素
の至適ｐＨ、ｐＨ１０．６おける至適温度、フェニルア
ラニン及びＮＡＤに対するＫｍ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによ
るサブユニット分子量を測定した。その結果、至適ｐＨ
１０．８、至適温度６０℃、フェニルアラニンに対する
Ｋｍは０．５２ｍＭ、ＮＡＤに対するＫｍは０．０９ｍ
Ｍ、サブユニット分子量４４ｋＤａであり、ハロモナス
パシフィカ（Halomona pacifica） ＵＴＢ２３０１株
から精製した酵素と同じであった。

【００２８】比較例１：ハロモナス パシフィカ（Halo
mona pacifica） ＵＴＢ２３０１での耐熱性フェニルア
ラニン脱水素酵素の生産 比較として、ハロモナス パシフィカ（Halomona pacif
ica） ＵＴＢ２３０１株を０．５％ポリペプトン、０．
５％酵母エキス、０．１％リン酸水素２カリウム、０．
０２％硫酸マグネシウム、１％塩化ナトリウムの培地
（ｐＨ７．５）５ｍＬに接種し、６０℃で１２時間好気
的に振とう培養した。次に、この培養液を上記液体培地
９５ｍＬに接種し、６０℃で３時間好気的に振とう培養
し、菌体を集菌した。得られた菌体全てを実施例４と同
じバッファーで懸濁後、超音波で破砕、遠心分離しフェ
ニルアラニン脱水素酵素活性と蛋白質濃度を測定した。
耐熱性フェニルアラニン脱水素酵素の総量は３．２Ｕで
あった。

【００２９】比較例２：耐熱性フェニルアラニン脱水素
酵素遺伝子を持たない大腸菌の培養 実施例４と同様に、ｐＵＣ１８で形質転換された大腸菌
ＪＭ１０９（pUC18/JM109）をアンピシリン５０μｇ／
ｍＬを含むＬＢ培地３ｍＬに接種し、３７℃１夜振盪培
養した。この培養液をアンピシリン５０μｇ／ｍＬを含
むＬＢ培地１００ｍＬに接種し、３７℃で振盪培養し
た。培養液の６６０ｎｍの吸光度が０．８となった時に
ＩＰＴＧを０．２ｍＭとなるように添加し更に４時間培
養を継続した後に集菌した。得られた菌体全てを１０％
グリセロール、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１ｍＭ ＤＴＴ
を含む１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液ｐＨ７．２に懸濁
し、超音波により破砕した。破砕液は、遠心分離により
菌体残渣を除き粗酵素液を得た。粗酵素液のフェニルア
ラニン脱水素酵素活性と蛋白質濃度を測定した。耐熱性
フェニルアラニン脱水素酵素活性は検出されなかった。

【００３０】

【発明の効果】本発明の耐熱性フェニルアラニン脱水素
酵素遺伝子を用いて、フェニルアラニン測定等に使用可
能な耐熱性フェニルアラニン脱水素酵素を大量に生産す
ることが可能である。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明におけるプラスミドｐＮＭ０４中の６ｋ
ｂｐ挿入ＤＮＡ断片の制限酵素地図とデリーションプラ
スミドの挿入ＤＮＡ断片を示す。

【図２】本発明における耐熱性フェニルアラニン脱水素
酵素発現プラスミドｐＮＮ２３の作成方法を示す。

【配列表】 <110> UNITIKA LTD. <120> GENE FOR THERMOSTABLE PHENYLALANINE DEHYDROGENASE,VECTOR AND TRANS FORMANT THEREOF,AND METHOD FOR PRODUSING THEMOSTABLE PHENYLALANINE DEHYD ROGENASE THEREWITH <130> 00PPP305 <160> 7 <210> 1 <211> 369 <212> PRT <213> Halomonas pacifica UTB2301 <400>1 Met Asp Ile Phe Thr Lys Ala Tyr Glu His Glu Gln Ile Val Phe Cys 1 5 10 15 Asn Asp Pro Asp Ser Gly Leu Arg Ala Ile Ile Ala Ile His Asn Thr 20 25 30 Thr Leu Gly Pro Ala Leu Gly Gly Cys Arg Met Leu Pro Tyr Ala Ser 35 40 45 Thr Glu Glu Ala Leu Glu Asp Val Leu Arg Leu Ser Lys Gly Met Thr 50 55 60 Tyr Lys Cys Ala Ala Ala Asp Val Asp Phe Gly Gly Gly Lys Ser Val 65 70 75 80 Ile Ile Gly Asp Pro Asn Lys Asp Arg Ser Pro Gln Leu Phe Arg Ala 85 90 95 Phe Gly Gln Phe Val Glu Ser Leu Asn Gly Arg Phe Tyr Thr Gly Thr 100 105 110 Asp Met Gly Thr Thr Pro Glu Asp Phe Val His Ala Ala Lys Glu Thr 115 120 125 Asn Cys Ile Val Gly Ile Pro Glu Glu Tyr Gly Gly Ser Gly Asp Ser 130 135 140 Ser Val Pro Thr Ala Leu Gly Val Ile Tyr Gly Ile Lys Ala Ser Asn 145 150 155 160 Lys Val Ala Phe Gly Asp Glu Lys Leu Glu Gly Lys Thr Tyr Ser Ile 165 170 175 Gln Gly Leu Gly Lys Val Gly Phe Lys Val Ala Thr Gln Leu Leu Glu 180 185 190 Asn Gly Ala Asn Leu Tyr Val Thr Asp Ile Asn Glu Lys Ala Ile Gln 195 200 205 Asp Leu Val Glu Leu Ser Lys Gln Tyr Asp Gly Thr Val Lys Val Val 210 215 220 Ser Ser Asp Glu Ile Tyr Ser Val Asp Ala Asp Val Phe Val Pro Cys 225 230 235 240 Ala Leu Gly Ala Ile Ile Asn Asp Asp Thr Ile Gln Gln Leu Lys Val 245 250 255 Lys Ala Ile Ala Gly Ser Ala Asn Asn Gln Leu Leu Asn Glu Glu Arg 260 265 270 His Gly Gln Glu Leu Tyr Glu Lys Gly Ile Leu Tyr Ala Pro Asp Tyr 275 280 285 Ile Val Asn Ala Gly Gly Leu Ile Gln Val Ala Asp Glu Leu Tyr Gly 290 295 300 Pro Asn Lys Asn Arg Val Leu Lys Lys Thr Glu Ala Ile Tyr Ser Ser 305 310 315 320 Leu Leu Glu Val Tyr Lys Tyr Ser Glu Ser Glu Lys Ile Pro Thr Tyr 325 330 335 Lys Ala Ala Asn Leu Phe Val Glu Lys Arg Ile Glu Glu Arg Lys Lys 340 345 350 Arg Asn Ser Phe Phe Thr His His Lys Arg Pro Lys Trp Asp Ile Lys 355 360 365 Lys <210> 2 <211> 1110 <212> DNA <213> Halomonas pacifica UTB2301 <400> 2 atg gat att ttt aca aaa gct tat gaa cat gaa caa ata gta ttt tgc 48 Met Asp Ile Phe Thr Lys Ala Tyr Glu His Glu Gln Ile Val Phe Cys 1 5 10 15 aat gat cca gac agt gga tta aga gct att att gca ata cat aat aca 96 Asn Asp Pro Asp Ser Gly Leu Arg Ala Ile Ile Ala Ile His Asn Thr 20 25 30 aca ctt gga ccg gca ctt ggc gga tgc cgt atg ctc cct tat gct tcc 144 Thr Leu Gly Pro Ala Leu Gly Gly Cys Arg Met Leu Pro Tyr Ala Ser 35 40 45 aca gaa gaa gcg cta gaa gat gta tta cgt tta tca aaa ggg atg aca 192 Thr Glu Glu Ala Leu Glu Asp Val Leu Arg Leu Ser Lys Gly Met Thr 50 55 60 tac aaa tgt gct gca gct gat gtt gat ttt ggt gga gga aag tct gta 240 Tyr Lys Cys Ala Ala Ala Asp Val Asp Phe Gly Gly Gly Lys Ser Val 65 70 75 80 att att ggt gat cca aat aaa gat cgt tcc cca cag cta ttt cgt gcg 288 Ile Ile Gly Asp Pro Asn Lys Asp Arg Ser Pro Gln Leu Phe Arg Ala 85 90 95 ttt ggc caa ttc gta gaa tca ttg aat gga aga ttt tat aca ggt acc 336 Phe Gly Gln Phe Val Glu Ser Leu Asn Gly Arg Phe Tyr Thr Gly Thr 100 105 110 gat atg gga aca aca cca gaa gat ttt gtc cat gct gcg aaa gag act 384 Asp Met Gly Thr Thr Pro Glu Asp Phe Val His Ala Ala Lys Glu Thr 115 120 125 aat tgt att gtt ggt ata cct gaa gaa tat ggc ggt agt gga gat tca 432 Asn Cys Ile Val Gly Ile Pro Glu Glu Tyr Gly Gly Ser Gly Asp Ser 130 135 140 tct gtt cca act gca tta gga gtc att tat gga ata aaa gca tca aat 480 Ser Val Pro Thr Ala Leu Gly Val Ile Tyr Gly Ile Lys Ala Ser Asn 145 150 155 160 aaa gtt gct ttt gga gac gaa aaa tta gag ggg aaa act tat tcc atc 528 Lys Val Ala Phe Gly Asp Glu Lys Leu Glu Gly Lys Thr Tyr Ser Ile 165 170 175 cag ggt tta gga aaa gtt gga ttt aaa gtt gct act caa tta tta gaa 576 Gln Gly Leu Gly Lys Val Gly Phe Lys Val Ala Thr Gln Leu Leu Glu 180 185 190 aat gga gca aat ctt tac gta aca gac att aat gaa aaa gca att caa 624 Asn Gly Ala Asn Leu Tyr Val Thr Asp Ile Asn Glu Lys Ala Ile Gln 195 200 205 gat ctc gtt gaa tta agt aaa caa tac gat ggc aca gta aaa gtt gtt 672 Asp Leu Val Glu Leu Ser Lys Gln Tyr Asp Gly Thr Val Lys Val Val 210 215 220 tct agt gat gag att tat agc gtt gat gcc gat gta ttc gta cct tgt 720 Ser Ser Asp Glu Ile Tyr Ser Val Asp Ala Asp Val Phe Val Pro Cys 225 230 235 240 gcc tta ggt gcc atc att aat gat gat acg att caa caa ttg aaa gtg 768 Ala Leu Gly Ala Ile Ile Asn Asp Asp Thr Ile Gln Gln Leu Lys Val 245 250 255 aaa gca att gcc gga agt gct aat aat cag cta tta aat gaa gaa aga 816 Lys Ala Ile Ala Gly Ser Ala Asn Asn Gln Leu Leu Asn Glu Glu Arg 260 265 270 cat ggt caa gaa tta tac gaa aaa gga att ctt tat gcg cct gac tat 864 His Gly Gln Glu Leu Tyr Glu Lys Gly Ile Leu Tyr Ala Pro Asp Tyr 275 280 285 att gta aat gca ggt gga tta atc caa gta gca gat gaa ttg tac ggt 912 Ile Val Asn Ala Gly Gly Leu Ile Gln Val Ala Asp Glu Leu Tyr Gly 290 295 300 cca aat aaa aat cgt gtt cta aag aaa acg gaa gcg att tac tct tct 960 Pro Asn Lys Asn Arg Val Leu Lys Lys Thr Glu Ala Ile Tyr Ser Ser 305 310 315 320 tta cta gag gtc tat aaa tat tct gaa agt gaa aaa att cca acc tat 1008 Leu Leu Glu Val Tyr Lys Tyr Ser Glu Ser Glu Lys Ile Pro Thr Tyr 325 330 335 aaa gca gca aac cta ttt gta gaa aaa cga att gaa gaa cgt aag aag 1056 Lys Ala Ala Asn Leu Phe Val Glu Lys Arg Ile Glu Glu Arg Lys Lys 340 345 350 aga aat agc ttt ttc aca cat cat aaa cgt ccg aaa tgg gac ata aaa 1104 Arg Asn Ser Phe Phe Thr His His Lys Arg Pro Lys Trp Asp Ile Lys 355 360 365 aaa taa 1110 Lys <210> 3 <211> 15 <212> PRT <213> Halomonas pacifica UTB2301 <400> 3 Met Asp Ile Phe Thr Lys Ala Tyr Glu His Glu Gln Ile Val Phe 1 5 10 15 <210> 4 <211> 7 <212> PRT <213> Bacillus badius, Bacillus sphericus, Sporosarcina ureae, Thermoact inomyses intermedius <400> 4 Ile Gln Val Ala Asp Glu Leu 1 5 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 5 atggayatht tyacnaargc 20 <210> 6 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 6 arytcrtcng cnacytgdat 20 <210> 7 <211> 905 <212> DNA <213> Halomonas pacifica UTB2301 <400> 7 atg gat att ttt aca aaa gct tat gaa cat gaa caa ata gta ttt tgc 48 Met Asp Ile Phe Thr Lys Ala Tyr Glu His Glu Gln Ile Val Phe Cys 1 5 10 15 aat gat cca gac agt gga tta aga gct att att gca ata cat aat aca 96 Asn Asp Pro Asp Ser Gly Leu Arg Ala Ile Ile Ala Ile His Asn Thr 20 25 30 aca ctt gga ccg gca ctt ggc gga tgc cgt atg ctc cct tat gct tcc 144 Thr Leu Gly Pro Ala Leu Gly Gly Cys Arg Met Leu Pro Tyr Ala Ser 35 40 45 aca gaa gaa gcg cta gaa gat gta tta cgt tta tca aaa ggg atg aca 192 Thr Glu Glu Ala Leu Glu Asp Val Leu Arg Leu Ser Lys Gly Met Thr 50 55 60 tac aaa tgt gct gca gct gat gtt gat ttt ggt gga gga aag tct gta 240 Tyr Lys Cys Ala Ala Ala Asp Val Asp Phe Gly Gly Gly Lys Ser Val 65 70 75 80 att att ggt gat cca aat aaa gat cgt tcc cca cag cta ttt cgt gcg 288 Ile Ile Gly Asp Pro Asn Lys Asp Arg Ser Pro Gln Leu Phe Arg Ala 85 90 95 ttt ggc caa ttc gta gaa tca ttg aat gga aga ttt tat aca ggt acc 336 Phe Gly Gln Phe Val Glu Ser Leu Asn Gly Arg Phe Tyr Thr Gly Thr 100 105 110 gat atg gga aca aca cca gaa gat ttt gtc cat gct gcg aaa gag act 384 Asp Met Gly Thr Thr Pro Glu Asp Phe Val His Ala Ala Lys Glu Thr 115 120 125 aat tgt att gtt ggt ata cct gaa gaa tat ggc ggt agt gga gat tca 432 Asn Cys Ile Val Gly Ile Pro Glu Glu Tyr Gly Gly Ser Gly Asp Ser 130 135 140 tct gtt cca act gca tta gga gtc att tat gga ata aaa gca tca aat 480 Ser Val Pro Thr Ala Leu Gly Val Ile Tyr Gly Ile Lys Ala Ser Asn 145 150 155 160 aaa gtt gct ttt gga gac gaa aaa tta gag ggg aaa act tat tcc atc 528 Lys Val Ala Phe Gly Asp Glu Lys Leu Glu Gly Lys Thr Tyr Ser Ile 165 170 175 cag ggt tta gga aaa gtt gga ttt aaa gtt gct act caa tta tta gaa 576 Gln Gly Leu Gly Lys Val Gly Phe Lys Val Ala Thr Gln Leu Leu Glu 180 185 190 aat gga gca aat ctt tac gta aca gac att aat gaa aaa gca att caa 624 Asn Gly Ala Asn Leu Tyr Val Thr Asp Ile Asn Glu Lys Ala Ile Gln 195 200 205 gat ctc gtt gaa tta agt aaa caa tac gat ggc aca gta aaa gtt gtt 672 Asp Leu Val Glu Leu Ser Lys Gln Tyr Asp Gly Thr Val Lys Val Val 210 215 220 tct agt gat gag att tat 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───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 9/06 (Ｃ１２Ｎ 9/06 Ｂ //(Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:19） Ｃ１２Ｒ 1:01） Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (Ｃ１２Ｎ 9/06 5/00 Ａ Ｃ１２Ｒ 1:19） Ｃ１２Ｒ 1:01） (72)発明者 公庄 千寿 徳島市吉野本町６−１ アベニュー森ｓｔ ３ 502号 (72)発明者 櫻庭 春彦 徳島市新浜町２−４−20 新浜住宅3202 (72)発明者 大島 敏久 徳島市新浜町２−３−75 新浜住宅155 Ｆターム(参考） 4B024 AA03 AA05 BA08 CA03 DA06 EA04 GA11 4B050 CC03 DD02 LL05 4B065 AA01X AA01Y AA26X AA57X AA87X AB01 AC14 BA02 CA28 CA41 CA60 (54)【発明の名称】 耐熱性フェニルアラニン脱水素酵素遺伝子、それを含有する組換えベクター、その組換えベクタ ーを含有する形質転換体及びその形質転換体を用いた耐熱性フェニルアラニン脱水素酵素の製造 方法

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 配列番号１で示されるアミノ酸配列又は
   配列番号１で示されるアミノ酸配列において１もしくは
   数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ
   酸配列からなる耐熱性フェニルアラニン脱水素酵素をコ
   ードする遺伝子。
2. 【請求項２】 配列番号２で示される塩基配列又は配列
   番号２で示される塩基配列において１もしくは数個の塩
   基が欠失、置換もしくは付加された塩基配列からなるＤ
   ＮＡを有し、かつ耐熱性フェニルアラニン脱水素酵素を
   コードする遺伝子。
3. 【請求項３】 請求項１または２の遺伝子を含有する組
   換えベクター。
4. 【請求項４】 請求項３記載の組換えベクターを含む形
   質転換体。
5. 【請求項５】 請求項４記載の形質転換体を培地中で培
   養し、培養物から耐熱性フェニルアラニン脱水素酵素を
   採取することを特徴とする耐熱性フェニルアラニン脱水
   素酵素の製造方法。