CN104593349B

CN104593349B - 一种gy2b降解菌固定化小球及其制备方法与应用

Info

Publication number: CN104593349B
Application number: CN201510018796.8A
Authority: CN
Inventors: 吴平霄; 李跃武; 党志; 朱能武
Original assignee: South China University of Technology SCUT
Current assignee: South China University of Technology SCUT
Priority date: 2015-01-14
Filing date: 2015-01-14
Publication date: 2018-06-22
Anticipated expiration: 2035-01-14
Also published as: CN104593349A

Abstract

本发明属于微生物降解有机污染物技术领域，公开了一种GY2B降解菌固定化小球及其制备方法与应用。所述GY2B降解菌固定化小球是以聚乙烯醇、海藻酸钠和高岭土的交联聚合产物为载体，包埋GY2B降解菌而形成的凝胶小球。其制备方法包括步骤：(1)将聚乙烯醇和海藻酸钠依次加入水中并分别加热搅拌溶解，再加入高岭土，搅拌混合均匀，得到混合液；(2)将混合液于紫外光照射下冷却至室温，加入GY2B降解菌菌悬液，搅拌均匀得到菌体包埋液；(3)将菌体包埋液滴加入交联液中，交联固化凝结成球，得到GY2B降解菌固定化小球。所述GY2B降解菌固定化小球对苯酚的降解效果更彻底、快速、稳定；且可提供稳定降解环境，适应毒性环境。

Description

一种GY2B降解菌固定化小球及其制备方法与应用

技术领域

本发明属于微生物降解有机污染物技术领域，涉及一种GY2B降解菌固定化小球及其制备方法与应用。

背景技术

应经济社会的发展，苯酚是一种重要的有机原料，在医药、树脂、灭菌剂等多方面被广泛应用。但其腐蚀性、毒性、蓄积性使其对人体、环境中的大气和水体都会产生极大威胁。微生物处理有机污染物的方法以其低成本、二次污染小和降解彻底等特点被人们关注和使用。目前人们对于水体中包括苯酚在内的有机污染物，多采用直接向水体中投加微生态制剂的方法。但此方法微生物极易死亡，流失对降解处理造成麻烦，因此固定化微生物用于处理水污染问题被逐渐得到关注应用。

微生物的固定化大致分为两类，一为较简单的吸附固定法，此法吸附量有限，且易解析，并呈粉末状分散，也易流失，在实际应用中劣势明显；另一固定方法则是包埋固定的方法，此法制成的生物材料性质稳定，机械强度高并可在较长时间内反复使用，抗环境毒性能力也极强，对比游离菌和较简单的吸附固定法更具优势和特点，在实际水处理中也更具价值和应用前途。

包埋法的原理是将微生物截留于不溶性的凝胶聚合物空隙的网络空间，使微生物得以固定在凝胶聚合物整体中。凝胶体系的网络可防止微生物细胞的泄漏，同时可让基质渗入，令产物扩散，完成对污染物的降解过程。

GY2B降解菌属鞘氨醇单胞菌，GenBank登录号为DQ139343，保藏号为CCTMC NO：M206019。GY2B降解菌被筛选并证实对包括菲等多种多环芳烃具有较高或一定的降解能力。GY2B降解菌对多环芳烃污染物的降解通过细菌的摄入转化，能有效开环降解，使多种带苯环的有机污染物转化成简单无害或易处理的物质。除菲等芳烃化合物外，GY2B降解菌对苯酚也具有可观的降解能力。但是GY2B降解菌降解体系与普通菌株的降解进程并无二致，对其降解性能的提升也多涉及化学促进剂，营养物质之类。游离的GY2B降解菌在降解时流失易、菌体适应能力差的劣势也明显突出。因此，选择合适的载体包埋固定GY2B降解菌以优化其降解过程和性能，是极有意义且新颖的探索，并具有较大的经济效益。

发明内容

为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供一种GY2B降解菌固定化小球，所述GY2B降解菌固定化小球克服了游离GY2B降解菌在降解过程中的缺点以及引入实际应用中面临的困难，可显著优化GY2B降解菌降解效率和速率，并能适用于多种毒性较大的受污染环境；

本发明的另一目的在于提供上述GY2B降解菌固定化小球的制备方法；

本发明的再一目的在于提供上述GY2B降解菌固定化小球的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种GY2B降解菌固定化小球，所述GY2B降解菌固定化小球是以聚乙烯醇(PVA)、海藻酸钠(SA)和高岭土的交联聚合产物为载体，包埋GY2B降解菌而形成的凝胶小球。

在所述GY2B降解菌固定化小球中，聚乙烯醇优选为80～120重量份，海藻酸钠优选为1～5重量份，高岭土优选为5～25重量份，GY2B降解菌优选的含量为4.7～7重量份。

所述GY2B降解菌优选为经过活化并在含苯酚的富集培养液中扩大培养的GY2B降解菌。

上述GY2B降解菌固定化小球的制备方法，包括以下步骤：

(1)将聚乙烯醇和海藻酸钠依次加入水中并分别加热搅拌溶解，再加入高岭土，搅拌混合均匀，得到混合液；

(2)将所得混合液于紫外光照射下冷却至室温，加入GY2B降解菌菌悬液，搅拌混合均匀，得到菌体包埋液；

(3)将所得菌体包埋液滴加入交联液中，交联固化凝结成球，收集洗净得到所述GY2B降解菌固定化小球。

优选的，步骤(1)所述混合液中聚乙烯醇的质量百分比浓度为8％～12％，海藻酸钠的质量百分比浓度为0.1％～0.5％，高岭土的质量百分比浓度为0.5％～2.5％；

优选的，步骤(1)中聚乙烯醇加入水中于80～100℃下搅拌2～4小时至充分溶解完毕；

优选的，步骤(1)中海藻酸钠加入水中于70～90℃下搅拌1～3小时至充分溶解完毕；

优选的，步骤(1)中加入高岭土后搅拌15～30分钟至混合均匀；

优选的，步骤(2)所述GY2B降解菌菌悬液占所述菌体包埋液的体积百分比浓度为8％～12％；

优选的，所述GY2B降解菌菌悬液中GY2B降解菌的浓度为0.0588g/mL；

优选的，步骤(2)所述GY2B降解菌菌悬液为经过传代培养活化并在含苯酚的富集培养液中扩大培养的GY2B降解菌菌悬液；

优选的，步骤(2)所述GY2B降解菌菌悬液的制备方法为：将GY2B降解菌传代培养进行活化形成菌体，将菌体在含苯酚的富集培养液中扩大培养得到浓菌液，再用无菌生理盐水离心洗涤浓菌液得到菌体，之后将洗得的菌体悬于无菌生理盐水中得到GY2B降解菌菌悬液；

所述GY2B降解菌菌悬液的具体制备步骤为：于经传代培养3～5次完成活化的GY2B降解菌菌落挑取1～2环至含苯酚浓度50～200mg/L的富集培养液中培养8～16小时得到浓菌液，将浓菌液用无菌生理盐水离心洗涤2～5次，洗得的菌体悬于生理盐水中，调节菌液浓度得到GY2B降解菌菌悬液，所得GY2B降解菌菌悬液于2～10℃保存备用；所述离心洗涤的条件为：温度2～10℃，离心转速6000～12000r/min，离心时间10～20min；

富集培养液的配置方法为：将10g蛋白胨、5g牛肉膏及5gNaCl混溶于1L蒸馏水，调pH为7.0，进行灭菌处理，得到富集培养液；

优选的，步骤(3)所述交联液为硼酸与氯化钙加入水中混合配成的溶液，硼酸的质量浓度百分比含量为2％～4％，氯化钙的质量浓度百分比含量为3％～5％；

优选的，步骤(3)所述交联固化的时间为22～26小时；

交联固化对温度要求不能太高温度，优选置于25～35摄氏度的恒温培养箱中交联固化；

优选的，步骤(3)所得GY2B降解菌固定化小球于含苯酚的MSM培养液中培养进行活化后保存；所述活化的具体操作为：将GY2B降解菌固定化小球置于含苯酚浓度50～200mg/L的MSM培养液中，于25～35℃下恒温震荡培养箱中避光培养，恒温震荡培养箱转速120～180r/min，培养时间22～28小时；经活化的GY2B降解菌固定化小球以无菌生理盐水洗涤2～4次，于2～6℃下保存备用；

所述MSM培养液为常规培养液，包含以下浓度的成分：5.0mL/L磷酸盐缓冲液(8.5g/L KH₂PO₄，21.75g/L K₂HPO₄·H₂O，33.4g/L Na₂HPO₄·12H₂O，5.0g/LNH₄Cl)，3.0mL/LMgSO₄水溶液(22.5g/L)，1.0mL/L CaCl₂水溶液(36.4g/L)，1.0mL/L FeCl₃水溶液(0.25g/L)，1.0mL/L微量元素溶液(39.9mg/L MnSO₄·H₂O，42.8mg/L ZnSO₄·H₂O，34.7mg/L(NH₄)6Mo₇O₂₄·4H₂O)，pH调为7.2；

上述MSM培养液通过高温蒸汽灭菌后得到试验所需的无菌MSM培养液，其中ml/L是指已配好的组分液在最终混合液体积为1L时的投加量，例如5.0mL/L磷酸盐缓冲液是指最终混合液体积为1L时，缓冲液投加量为5mL。

上述GY2B降解菌固定化小球在处理含苯酚废水中的应用。

优选的，所述GY2B降解菌固定化小球在处理含苯酚废水时，当含苯酚废水中苯酚浓度为50～30mg/L，则每升含苯酚废水中加入2～4g所述GY2B降解菌固定化小球，震荡环境下避光降解处理。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

(1)本发明所述GY2B降解菌固定化小球对苯酚的降解效果相比游离菌的降解效果更彻底、快速、稳定。包埋固定制备的GY2B降解菌固定化小球，因投加材料对微生物的无害亲和性，可以较完整保留GY2B降解菌的降解、代谢活性。经活化后所述GY2B降解菌固定化小球具有更快速的降解效率，且因菌体被固定在小球中，可以避免水体流动造成的菌体流失脱落，也弥补了菌体降解过程易死亡的缺陷。

(2)本发明所述GY2B降解菌固定化小球可提供稳定降解环境，适应毒性环境。本发明采用聚乙烯醇、海藻酸钠、高岭土和GY2B降解菌按比例混合固定制成固定化微生物小球，机械强度大，经长时间使用也不变形或破坏。降解有机污染物的过程中，GY2B降解菌固定化小球作为载体，可以逸散部分细菌协同进行降解；且因固定化营造的稳定降解环境，能够适应高浓度、酸性、碱性等多种恶劣环境的毒害影响而保持上佳的降解效果。

(3)本发明所述GY2B降解菌固定化小球可长时间保存而不影响降解活性，并可多次反复使用。本发明所述GY2B降解菌固定化小球将GY2B降解菌固定化，使GY2B降解菌包埋处于中性平和的环境中，通过小球孔孔隙传输摄取环境中的苯酚加以利用降解。所述GY2B降解菌固定化小球具有极好的储存保质期，与游离菌约15天即要传代接种保持活性相比，本发明所述GY2B降解菌固定化小球可将此时间延长至3个月以上而不干扰降解的效果，并可长时间保持内部微生物的活性。此外，与游离菌相比，本发明所述GY2B降解菌固定化小球最显著的特点是可循环利用，连续使用16次以上而降解效果无明显降低。

(4)本发明所述制备方法材料简单廉价，所得GY2B降解菌固定化小球具有广阔的应用前景。本发明所述制备方法使用的材料包括PVA、SA、CaCl₂、高岭土等均是廉价常见的材料，制作成本低廉而效果明显。所得GY2B降解菌固定化小球可完美避免或减缓用单纯菌剂投加方法所存在的已死亡、易流失洗脱、

环境适应能力差等缺陷和限制。投加入废水中降解苯酚的过程与普通菌剂使用方法并无二致，简单可行，在实际应用中具有广阔前景。

附图说明

图1为无菌固定化小球对各浓度苯酚的吸附效果曲线图。

图2为游离的GY2B降解菌对各浓度苯酚的降解效果曲线图。

图3为本发明所述GY2B降解菌固定化小球对各浓度苯酚的降解效果曲线图。

图4为酸性条件下游离的GY2B降解菌与本发明所述GY2B降解菌固定化小球的降解效果对比曲线图。

图5为碱性条件下游离的GY2B降解菌与本发明所述GY2B降解菌固定化小球的降解效果对比曲线图。

图6为本发明所述GY2B降解菌固定化小球循环利用次数与降解效率关系图。

图7为本发明所述GY2B降解菌固定化小球储存时间与降解效率关系图。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1

一种GY2B降解菌固定化小球，其制备方法为：

(1)制备GY2B降解菌菌悬液：于经传代培养3～5次完成活化的GY2B降解菌菌落挑取一至两环至含苯酚浓度100mg/L的富集培养液中，恒温震荡培养箱中培养12小时，得到含大量菌体的浓菌液；，将浓菌液用无菌生理盐水离心洗涤3次，离心温度为4℃，离心转速8000r/min，离心时间15min；洗得的菌体悬于生理盐水中，于紫外分光光度计下600nm处调节菌液浓度，使其吸光度值为A＝1，此时所述GY2B降解菌菌悬液中GY2B降解菌的浓度约为0.0588g/mL，制得GY2B降解菌菌悬液，所得GY2B降解菌菌悬液于4℃冰箱保存备用；

所述富集培养液的配置：将10g蛋白胨、5g牛肉膏及5gNaCl混溶于1L蒸馏水，调pH为7.0。将富集培养液灭菌之后，将苯酚溶液过滤灭菌加入富集培养液中，使终浓度为100mg/L。

(2)制备菌体包埋液：将聚乙烯醇加入水中，于90℃水浴加热搅拌3小时使其充分溶解，然后将水浴温度降至80℃，加入海藻酸钠，搅拌2小时至充分溶解，再加入高岭土搅拌溶解1小时，将所得的混合溶液于无菌操作台紫外光灯照射下冷却至室温；冷却后，往混合溶液中注入步骤(1)所得的GY2B降解菌菌悬液，室温下搅拌20分钟使充分混合均匀得到菌体包埋液；

在混合溶液中，聚乙烯醇的重量百分比浓度为10％，海藻酸钠的重量百分比浓度为0.3％，高岭土的重量百分比浓度为1％；GY2B降解菌菌悬液占菌体包埋液的体积百分比为10％；

(3)交联制备GY2B降解菌固定化小球：将步骤(2)所得菌体包埋液以注射器缓慢均匀滴入由硼酸和氯化钙混合配成的交联液中，暗处交联24小时后得到固化小球，收集所得固化小球，用无菌蒸馏水洗涤3次，即得所述GY2B降解菌固定化小球；

交联液配置：将硼酸与氯化钙加入无菌蒸馏水中溶解，抽滤滤去混合液中杂质颗粒物，放于冰箱冷藏，待交联液温度降至4℃以下即可使用；在交联液中，硼酸的重量百分比浓度为3％，氯化钙的重量百分比浓度为4％。

将所得GY2B降解菌固定化小球进行活化，活化步骤为：将所得GY2B降解菌固定化小球置于经过滤灭菌的含苯酚浓度为100mg/L的MSM培养液中，放于30℃恒温振荡培养箱以150r/min的条件下避光培养24小时，然后滤出GY2B降解菌固定化小球，以无菌水洗涤3次后悬于无菌水中于4℃冰箱保存备用。

所述MSM培养液配制如下：5.0mL/L磷酸盐缓冲液(8.5g/L KH₂PO₄，21.75g/LK₂HPO₄·H₂O，33.4g/L Na₂HPO₄·12H₂O，5.0g/L NH₄Cl)，3.0ml/L MgSO₄水溶液(22.5g/L)，1.0ml/L CaCl₂水溶液(36.4g/L)，1.0ml/L FeCl₃水溶液(0.25g/L)，1.0ml/L微量元素溶液(39.9mg/L MnSO₄·H₂O，42.8mg/L ZnSO₄·H₂O，34.7mg/L(NH₄)6Mo₇O₂₄·4H₂O)，pH调为7.2。将一定量的苯酚加入MSM培养液中溶解得到含苯酚浓度为100mg/L的MSM培养液。

对比例1

一种无菌固定化小球，其制备方法与实施例1制备GY2B降解菌固定化小球基本相同，区别在于制备包埋液时没有添加菌液，具体如下：

(1)制备包埋液：将聚乙烯醇加入水中，于90℃水浴加热搅拌3小时使其充分溶解，然后将水浴温度降至80℃，加入海藻酸钠，搅拌2小时至充分溶解，再加入高岭土搅拌溶解1小时，将所得的混合溶液于无菌操作台紫外光灯照射下冷却至室温，即得包埋液；在混合溶液中，聚乙烯醇的重量百分比浓度为10％，海藻酸钠的重量百分比浓度为0.3％，高岭土的重量百分比浓度为1％；

(2)交联制备无菌固定化小球：将步骤(1)所得包埋液以注射器缓慢均匀滴入由硼酸和氯化钙混合配成的交联液中，暗处交联24小时后得到固化小球，收集所得固化小球，用无菌蒸馏水洗涤3次，即得所述无菌固定化小球。

性能分析：

1、测定对比例1所得无菌固定化小球对不同浓度苯酚的吸附效果，操作如下：

将MSM培养液于120℃高温蒸汽灭菌，然后分装至5只经灭菌的锥形瓶中，分别加入经过滤灭菌的苯酚溶液，使各锥形瓶培养液的苯酚浓度分别为100mg/L、150mg/L、200mg/L、250mg/L和300mg/L，各锥形瓶中溶液最终体积为100ml，然后分别往各锥形瓶溶液体系中投加制得的无菌固定化小球8.5g；将锥形瓶放入恒温震荡培养箱，于30℃、150r/min、避光条件下震荡进行吸附作用，每个样品做3次平行。

定时取样测定各锥形瓶溶液体系中苯酚的残余浓度，测量样品处理如下：4℃环境下10000r/min离心5分钟，取上清液稀释测定。测定在紫外分光光度计，270nm波长测定，由标准曲线计算得体系中苯酚浓度。无菌固定化小球随时间变化对不同浓度苯酚的吸附效果如图1所示。从图1可以看出，无菌固定化小球对体系中苯酚的吸附可以在短时间(30min)内达到平衡。各浓度下，都约有7～8％的吸附量，无菌固定化小球的吸附能力对于体系环境中苯酚的摄取降解具有重要意义。

2、测定游离的GY2B降解菌对不同浓度苯酚的吸附效果，操作如下：

将MSM培养液于120℃高温蒸汽灭菌，然后分装至4只经灭菌的锥形瓶中，分别加入经过滤灭菌的苯酚溶液，使各锥形瓶培养液的苯酚浓度分别为100mg/L、150mg/L、200mg/L和250mg/L；然后分别往各锥形瓶溶液体系按4％的投加量投加游离的GY2B降解菌，即锥形瓶中每100mL溶液投加4mL的GY2B降解菌菌悬液，GY2B降解菌菌悬液中GY2B降解菌的质量分数为0.0588g/mL；将锥形瓶放入恒温震荡培养箱，于30℃、150r/min、避光条件下震荡进行吸附作用，每个样品做3次平行。

定时取样测定各锥形瓶溶液体系中苯酚的残余浓度，待测样品处理如下：4℃环境下10000r/min离心5分钟，取上清液稀释测定。测定在紫外分光光度计，270nm波长测定，由标准曲线计算得体系中苯酚浓度。游离的GY2B降解菌随时间变化对不同浓度苯酚的降解效果如图2所示。从图2可以看出，游离的GY2B降解菌在较低浓度的苯酚含量下能够保持较好的降解作用，但苯酚浓度含量高的环境体系中，因苯酚的毒害左右对菌体产生的抑制，GY2B降解菌需要有较长的适应期且完成降解的时间极长。

3、测定实施例1所得GY2B降解菌固定化小球对不同浓度苯酚的吸附效果，操作如下：

如1所述于6个锥形瓶中配制苯酚浓度分别为50mg/L、100mg/L、150mg/L、200mg/L、250mg/L和300mg/L的六组试样，各锥形瓶中溶液最终体积为100ml。然后分别往各锥形瓶溶液体系中投加GY2B降解菌固定化小球8.5g；将锥形瓶放入恒温震荡培养箱，于30℃、150r/min、避光条件下震荡进行吸附作用，每个样品做3次平行。

定时取样测定各锥形瓶溶液体系中苯酚的残余浓度，待测样品处理如下：4℃环境下10000r/min离心5分钟，取上清液稀释测定。测定在紫外分光光度计，270nm波长测定，由标准曲线计算得体系中苯酚浓度。GY2B降解菌固定化小球随时间变化对不同浓度的苯酚的降解效果如图3所示。从图3可以看出，本发明所述GY2B降解菌固定化小球在较低浓度苯酚下就展现了其优势，在大大缩短降解时间的基础上，更将最终的降解效率提升10％左右；在高浓度的苯酚环境中，借助固定化这一作用保存了内部菌体的降解能力，因而能在高浓度苯酚含量下稳定降解，并在最终的降解效率上相比游离菌具有极大提升。

4、测定酸性条件下GY2B降解菌固定化小球的降解优化效果：

(1)分别量取90ml MSM培养液于两个锥形瓶中，以NaOH、HCl分别调节两个锥形瓶中MSM培养液的pH＝1与pH＝3；将这两个锥形瓶放入灭菌锅120℃高温蒸汽灭菌30min后取出放于无菌操作台紫外光下冷却至室温；然后将10ml已过滤灭菌、pH＝1、苯酚浓度为1g/L的苯酚母液加入MSM培养液pH＝1的锥形瓶中搅拌均匀，将10ml已过滤灭菌、pH＝3、苯酚浓度为1g/L的苯酚母液加入MSM培养液pH＝3的锥形瓶中搅拌均匀，分别得到pH＝1和pH＝3的苯酚体系；

(2)各取8.5g实施例1所得GY2B降解菌固定化小球分别投入pH＝1和pH＝3的苯酚体系，放入摇床30℃、150r/min避光培养24小时加以驯化适应，得到驯化后的GY2B降解菌固定化小球，用无菌水洗净；

(3)重新配制步骤(1)的pH＝1和pH＝3的苯酚体系，分别投加8.5g经驯化后的GY2B降解菌固定化小球，定时取样测定苯酚体系中苯酚的残留量。测量样品处理如下：4℃环境下10000r/min离心5分钟，取上清液稀释测定。测定在紫外分光光度计，270nm波长测定，由标准曲线计算得体系中苯酚浓度；

(4)重新配制步骤(1)的pH＝1和pH＝3的苯酚体系，分别按4％的投加量加入游离的GY2B降解菌，即锥形瓶中每100mL溶液投加4mL的GY2B降解菌菌悬液，GY2B降解菌菌悬液中GY2B降解菌的质量分数为0.0588g/mL，定时取样测定苯酚体系中苯酚的残留量。待测样品处理如下：4℃环境下10000r/min离心5分钟，取上清液稀释测定。测定在紫外分光光度计，270nm波长测定，由标准曲线计算得体系中苯酚浓度；

结果：GY2B降解菌固定化小球和游离的GY2B降解菌在酸性条件下对体系中苯酚的降解效果如图4所示，从图4可以看出，在酸性条件下，游离状态的GY2B降解菌因体系环境条件恶劣，活性大失，基本失去对苯酚的降解能力；而本发明所述GY2B降解菌固定化小球则因其包埋的保护机制使其拥有更强的适应能力，能在缓慢适应降解条件后对体系中苯酚进行稳定降解，并在最终的降解率上十分可观。

5、测定碱性条件下GY2B降解菌固定化小球的降解优化效果：

(1)分别量取90ml MSM培养液于两个锥形瓶中，以NaOH、HCl分别调节两个锥形瓶中MSM培养液的pH＝10与pH＝12；将这两个锥形瓶放入灭菌锅120℃高温蒸汽灭菌30min后取出放于无菌操作台紫外光下冷却至室温；然后将10ml已过滤灭菌、pH＝10、苯酚浓度为1g/L的苯酚母液加入MSM培养液pH＝10的锥形瓶中搅拌均匀，将10ml已过滤灭菌、pH＝12、苯酚浓度为1g/L的苯酚母液加入MSM培养液pH＝12的锥形瓶中搅拌均匀，分别得到pH＝10和pH＝12的苯酚体系；

(2)各取8.5g实施例1所得GY2B降解菌固定化小球分别投入pH＝10和pH＝12的苯酚体系，放入摇床30℃、150r/min避光培养24小时加以驯化适应，得到驯化后的GY2B降解菌固定化小球，用无菌水洗净；

(3)重新配制步骤(1)的pH＝10和pH＝12的苯酚体系，分别投加8.5g经驯化后的GY2B降解菌固定化小球，定时取样测定苯酚体系中苯酚的残留量。测量样品处理如下：4℃环境下10000r/min离心5分钟，取上清液稀释测定。测定在紫外分光光度计，270nm波长测定，由标准曲线计算得体系中苯酚浓度；

(4)重新配制步骤(1)的pH＝10和pH＝12的苯酚体系，分别按4％的投加量加入游离的GY2B降解菌，即锥形瓶中每100mL溶液投加4mL的GY2B降解菌菌悬液，GY2B降解菌菌悬液中GY2B降解菌的质量分数为0.0588g/mL，定时取样测定苯酚体系中苯酚的残留量。待测样品处理如下：4℃环境下10000r/min离心5分钟，取上清液稀释测定。测定在紫外分光光度计，270nm波长测定，由标准曲线计算得体系中苯酚浓度；

结果：GY2B降解菌固定化小球和游离的GY2B降解菌在碱性条件下对体系中苯酚的降解效果如图5所示，从图5可以看出，在酸性条件下，游离状态的GY2B降解菌仍能保持一定的降解性能，说明此菌体对碱性条件具有更好的适应性；相比之下，本发明所述GY2B降解菌固定化小球具有十分彻底的降解效果，能在游离菌降解效率上提升30％以上，且在完成降解的时间上有客观的提升。

6、测定本发明所述GY2B降解菌固定化小球的循环利用性能及其降解效果：

(1)取实施例1所得GY2B降解菌固定化小球，活化后储存备用；

(2)量取90ml MSM培养液于锥形瓶中，维持锥形瓶中MSM培养液pH为中性条件，将锥形瓶放入灭菌锅120℃高温蒸汽灭菌30min后取出放于无菌操作台紫外光下冷却至室温，加入10ml已过滤灭菌的苯酚浓度为1g/L的苯酚母液，使锥形瓶中最终体系的体积为100mL，苯酚浓度为100mg/L；然后加入8.5gGY2B降解菌固定化小球，将锥形瓶置于摇床30℃、150r/min下避光培养，定时取样测定锥形瓶体系中苯酚残留浓度；待测样品处理如下：4℃环境下10000r/min离心5分钟，取上清液稀释测定；测定在紫外分光光度计，270nm波长测定，由标准曲线计算得体系中苯酚浓度；

(3)完成降解后，将使用过的GY2B降解菌固定化小球滤出，以无菌水清洗3次，再次使用检测其降解效果，操作方式如步骤(2)一致；

(4)依上步骤重复多次检测GY2B降解菌固定化小球循环利用次数与降解效果的关系，结果如图6所示。

从图6可以看出，GY2B降解菌固定化小球在前两次使用时因驯化不完全导致降解率稍低，此后保持高效快速的降解特性，在15次再用之后降解效果才体现出轻微的减弱，因此，本发明GY2B降解菌固定化小球能高效重复利用至少16次以上，相比游离菌易流失且难以回收的劣势，是一个极大的降解优化方法。

7、测定储存时间对本发明所述GY2B降解菌固定化小球降解效率的影响：

(1)取实施例1所得GY2B降解菌固定化小球，活化后储存备用；

(3)每隔15天取步骤(1)储存备用的GY2B降解菌固定化小球进入与步骤(2)所述一致的苯酚降解检测；实验时间90天，进行7次降解实验，降解效果如图7所示。

从图7可以看出，本发明所述GY2B降解菌固定化小球因对GY2B降解菌进行固定化，大大优化了GY2B降解菌的降解性能。相比游离菌15～30天既要进行传代培养以保持其降解活性的局限性，本发明所述GY2B降解菌固定化小球能在90天以上的时间内保持极佳的降解效率。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种GY2B降解菌固定化小球，其特征在于：所述GY2B降解菌固定化小球是以聚乙烯醇、海藻酸钠和高岭土的交联聚合产物为载体，包埋GY2B降解菌而形成的凝胶小球；

所述GY2B降解菌固定化小球中，聚乙烯醇为80～120重量份，海藻酸钠为1～5重量份，高岭土为5～25重量份，GY2B降解菌的含量为4.7～7重量份；

所述的GY2B降解菌固定化小球的制备方法，包括如下步骤：

2.根据权利要求1所述的GY2B降解菌固定化小球，其特征在于：步骤(1)所述混合液中聚乙烯醇的质量百分比浓度为8％～12％，海藻酸钠的质量百分比浓度为0.1％～0.5％，高岭土的质量百分比浓度为0.5％～2.5％；步骤(2)所述GY2B降解菌菌悬液占所述菌体包埋液的体积百分比浓度为8％～12％；步骤(3)所述交联液为硼酸与氯化钙加入水中混合配成的溶液，硼酸的质量浓度百分比含量为2％～4％，氯化钙的质量浓度百分比含量为3％～5％。

3.根据权利要求1所述的GY2B降解菌固定化小球，其特征在于：步骤(1)中聚乙烯醇加入水中于80～100℃下搅拌2～4小时至充分溶解完毕；步骤(1)中海藻酸钠加入水中于70～90℃下搅拌1～3小时至充分溶解完毕；步骤(1)中加入高岭土后搅拌15～30分钟至混合均匀；步骤(3)所述交联固化的时间为22～26小时。

4.根据权利要求1所述的GY2B降解菌固定化小球，其特征在于：步骤(2)所述GY2B降解菌菌悬液中GY2B降解菌的浓度为0.0588g/mL；步骤(2)所述GY2B降解菌菌悬液为经过传代培养活化并在含苯酚的富集培养液中扩大培养的GY2B降解菌菌悬液。

5.根据权利要求1所述的GY2B降解菌固定化小球，其特征在于：步骤(2)所述GY2B降解菌菌悬液的具体制备步骤为：于经传代培养3～5次完成活化的GY2B降解菌菌落挑取1～2环至含苯酚浓度50～200mg/L的富集培养液中培养8～16小时得到浓菌液，将浓菌液用无菌生理盐水离心洗涤2～5次，洗得的菌体悬于生理盐水中，调节菌液浓度得到GY2B降解菌菌悬液，所得GY2B降解菌菌悬液于2～10℃保存备用；所述离心洗涤的条件为：温度2～10℃，离心转速6000～12000r/min，离心时间10～20min。

6.根据权利要求1～5任一项所述的GY2B降解菌固定化小球，其特征在于：步骤(3)所得GY2B降解菌固定化小球于含苯酚的MSM培养液中培养进行活化后保存。

7.根据权利要求1所述的GY2B降解菌固定化小球在处理含苯酚废水中的应用。

8.根据权利要求7所述的GY2B降解菌固定化小球在处理含苯酚废水中的应用，其特征在于：当含苯酚废水中苯酚浓度为50～30mg/L，则每升含苯酚废水中加入2～4g所述GY2B降解菌固定化小球，震荡环境下避光降解处理。