CN106282304A - 一种微囊化活菌制剂含量的预处理方法及基于预处理方法的检测方法 - Google Patents

一种微囊化活菌制剂含量的预处理方法及基于预处理方法的检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及微生物检测技术领域，特别是一种微囊化活菌制剂含量的预处理方法及基于预处理方法的检测方法。包括如下步骤：在无菌条件下取待测试样，并与破囊液混合，混合后所述待测试样质量与所述破囊液的体积比例为0.99g:90ml～10.01g:90ml；将上述混合液置于摇床中振荡；向振荡后的混合液中加入酶，并混合均匀。本发明的有益效果在于测试简单、测试结果准确稳定。

Description

一种微囊化活菌制剂含量的预处理方法及基于预处理方法的 检测方法
技术领域
本发明涉及微生物检测技术领域，特别是一种微囊化活菌制剂含量的预处理方法及基于预处理方法的检测方法。
背景技术
饲用抗生素在促进动物生长、提高动物生产性能等方面效果显著，为集约化畜牧业的发展作出了重要贡献。但随着其广泛使用，甚至滥用而导致畜产品中药物残留及病原菌耐药性增强等问题给畜牧养殖、食品安全及人们健康带来了巨大的威胁。
目前，食品安全问题已引起人们的密切关注和强烈担忧，许多国家纷纷采取强制措施，对饲用抗生素的种类、使用方法、剂量和配伍等方面严加限制或禁止。因此，研发使用新型、安全、高效的饲料添加剂取代抗生素和化学合成药品已成为热点。
微生态制剂作为一种新型的无毒、无污染生物制品类饲料添加剂，在调节动物机体微生态平衡、预防疾病、提高饲料转化率、促进动物健康、改善畜产品品质和保护生态环境等方面有着其它添加剂不可替代的作用，越来越受到市场的青睐。但微生态制剂中某些抗逆性差的菌种，如乳酸菌的活菌制剂在加工、运输过程中易失活且这些活菌进入人或动物消化道后大多难以经受低pH值的胃酸、胆汁酸等的作用，难以有足够的数量达到肠道或定居于肠道而发挥作用，因此微生态制剂的饲用效果报道不一，大大限制了其广泛使用。
固定化细胞技术发展起来的微胶囊包被技术是减少微生物失活的一项重要且有效的解决途径，它是一种利用天然或合成的高分子材料对固体、液体或气体进行包封，粒径为5-1000um的中空胶囊，制备微胶囊的过程称为微胶囊化。其优势在于被包封的囊心与外界环境隔离，它的性质能毫无影响地被保留下来，在适当的条件下，包被材料又能将囊心释放出来。将有益微生物通过微囊化发酵生产得到一种稳定的高浓度的活菌细粉颗粒，便于运输、贮存和添加使用；由于微胶囊的保护，能够有效地防止失活，提高微生态制剂产品的稳定性。不足之处是由于微囊化发酵生产时，微生物个体细胞之间通过聚团提高了细胞的密度，随着培养时间的延长，微胶囊部被微生物细胞所占据，使得微生物活菌制剂产品含量很高。目前相关的专利有：
一种微囊化屎肠球菌活菌制剂及其制备方法(CN201310034466.9)
一种微生物发酵前包被微胶囊的制备方法(CN201310218324.8)
一种屎肠球菌微胶囊制剂及其制备方法(CN200810114912.6)
一种微生物微胶囊大量制备的方法(CN200810114913.0)
一种利用普通发酵罐制备微生物发酵前包被微胶囊的方法(CN201310218187.8)
一种微生物发酵前包被多层微胶囊的制备方法(CN201310121179.1)
对于微胶囊技术，在微生物检测的过程中遇到了困难。应用传统微生物检测方法进行样品处理和稀释时，因聚集成团的微生物细胞之间连接较为紧密，通过物理方式振荡难以完全打开菌团使其分散均匀，导致平板计数时每一个稀释梯度生长菌落数不平行，直接导致检测结果的不准确性。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种微囊化活菌制剂含量的预处理方法及基于预处理方法的检测方法，解决现有技术针对微囊化活菌制剂含量检测不准确的问题。
本发明的目的是提供一种微囊化活菌制剂含量检测的预处理方法，按如下步骤实现：
步骤1：在无菌条件下取待测试样，并与破囊液混合，混合后所述待测试样质量与所述破囊液的体积比例为0.99g:90ml～10.01g:90ml；
步骤2：将上述混合液置于摇床中振荡；
步骤3：向振荡后的混合液中加入酶，并混合均匀。
进一步的，所述振荡转数250r/min，振荡温度25℃，振荡时间10min
进一步的，所述破囊液采用0.06mol/L的柠檬酸三钠溶液。
进一步的，所述蛋白酶根据所述待测试样不同采用蛋白酶、果胶酶、淀粉酶、半纤维素酶中至少一种或其任意比例混合物。
进一步的，所述蛋白酶采用木瓜蛋白酶或中性蛋白酶。
进一步的，所述半纤维素酶采用甘露聚糖酶或葡聚糖酶。
进一步的，所述步骤2上实施过程中还在混合液中放置有助于破壁的硬质颗粒，所述硬质颗粒采用玻璃珠、磁子至少一种。
进一步的，所述活菌包括光合细菌、硝化细菌、反硝化细菌、酵母菌、乳酸菌或芽孢杆菌。
进一步的，在所述步骤3实施后，实施步骤4：将混合液置于摇床中进行振荡30min。
进一步的，本发明还公开了一种微囊化活菌制剂含量的检测方法，采用所述微囊化活菌制剂含量检测的预处理方法作为预处理步骤，其他检测步骤采用本领域现有的常规技术手段。
本发明的有益效果在于测试简单、测试结果准确稳定。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的具体实施方式作进一步描述，以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术实施例，而不能以此来限制本发明的保护范围。
A.1 原理
细菌或真菌在一定温度和pH条件下，可以在营养琼脂培养基上生长，计算菌落形成个数。样品经破囊、活化稀释处理后，均匀接种到该细菌或真菌专用琼脂培养基上，在适宜的温度和pH值的条件下，培养一定时间，观察在营养琼脂培养皿上形成的单个菌落，即为一个菌落形成单位，以CFU表示。
A.2 培养基、稀释液、破囊液
除非另有说明，在分析中仅使用确认为分析纯的试剂和符合GB/T 6682规定的二级水或相当纯度的水。
按本标准规定的方法配制培养基或购买商品化的产品。
A.2.1 培养基
A.2.1.1 成分及培养条件
乳酸菌——粪肠球菌专用培养基：
胰蛋白胨17.0g、牛肉浸膏3.0g、酵母浸膏5.0g、牛胆粉10.0g、氯化钠5.0g、1柠檬酸钠.0g、七叶苷1.0g、柠檬酸铁铵0.5g、叠氮化钠0.25g、琼脂13.5g、蒸馏水1L。调节pH 7.1±0.2。培养温度37℃，培养时间48-72小时。
酵母菌培养基：
蛋白胨5.0g、葡萄糖10.0g、磷酸氢二钾1.0g、无水硫酸镁0.5g、孟加拉红0.033g、氯霉素0.1g、琼脂20.0g、蒸馏水1L。调节pH7.2±0.2。培养温度28℃，培养时间48小时。
芽孢杆菌——凝结芽孢杆菌培养基：
质量分数如下：胰蛋白胨1％(OXOID牌TRYPTONE)，酵母浸粉0.5％(OXOID牌YEASTEXTRACT)，NaCl 1％，琼脂粉2％。培养温度37℃，培养时间16-24小时。
光合细菌——紫色非硫细菌培养基：
乙酸钠3g、氯化铵2g、氯化钠0.100g、磷酸二氢钾0.500g、硫酸镁0.200g、硫酸锰0.020g、三氯化铁0.002g、酵母膏0.100g、琼脂50g、水1L。调节pH7.0±0.2，适宜光照3000LX，培养温度在25-35℃，培养时间3-5天。
硝化细菌——硝化杆菌培养基：
亚硝酸钠1g、硫酸镁0.03g、硫酸锰0.01g、磷酸氢二钾0.75g、无水碳酸钠1g、磷酸二氢钠0.25g、琼脂粉50g、蒸馏水1L。调节pH7.5。培养温度在25-35℃，培养时间3-5天。
反脱化细菌——脱氮硫杆菌培养基：
氯化铵0.05％、六水氯化镁0.05％、磷酸二氢钾0.2％、五水硫代硫酸钠0.5％、硝酸钾0.4％、碳酸氢钠0.1％、七水硫酸亚铁0.001％、琼脂2％、无菌去离子水补齐。培养过程为厌氧，采用倾注法，培养温度25-30℃。
A.2.1.2 制法
根据所测菌种按A.2.1.1中的成分配好，加热使溶解，校正pH，121℃±1℃、15min灭菌，45℃～50℃保温，从保温到倾注平板时间不超过4h，倾注平板(每个培养皿约20mL)，保存备用。
注：叠氮化钠是热敏感药品而不能反复加热融化。
其中脱氮硫杆菌培养基制法为：先将七水硫酸亚铁溶于0.1mol/L HCl中，磷酸二氢钾和碳酸氢分别溶于双蒸去离子水中，分别高压灭菌锅灭菌；其他成分溶解在去离子水中，灭菌。灭菌完毕后混合，用0.01mol/L氢氧化钠调节pH至7左右，封口，置于超净台中用紫外灯再次灭菌、备用。
当培养基凝固后，放在37℃±1℃培养箱12h或过夜进行干燥；或将平板放在板放在超净工作台上，部分拿开盖子30min以去除平板上的水分。干燥后的平板必须检验无菌后方可使用。
A.2.2 破囊液的制备
配制0.06mol/L的柠檬酸三钠溶液：称取1.7646g柠檬酸三钠(294.1g/mol)溶于水中，定容至100mL，121℃灭菌20min。
A.2.3 稀释液(生理盐水)
A.2.3.1 成分
0.85～0.9％氯化钠溶液。
A.2.3.2 制法
0.85～0.9％生理盐水，并按照1％的比例加入10％吐温80溶液，混合均匀，每个250mL三角瓶分装100mL，每支试管分装9mL，灭菌备用。
A.3 仪器和设备
A.3.1 分析天平：感量0.0001g。
A.3.2 旋涡振荡器。
A.3.3 高压灭菌锅。
A.3.4 生化培养箱：温度应在37±1℃。
A.3.5 恒温摇床。
A.3.6 超净工作台。
A.3.7 移液枪。
A.3.8 涂布器和玻璃珠(直径为5mm左右)。
A.3.9 显微镜。
A.4 试样制备
按GB/T 14699.1的规定，采取有代表性的样品250g，按GB/T 20195进行试样制备。装入密封容器或样品袋中，防止试样成分变化。
A.5 测定步骤
A.5.1 预处理
称取10.0g±0.01g试样以无菌操作加入到90mL无菌破囊液中，在三角瓶中放入几粒玻璃珠，放入摇床中250r/min，25℃处理10min，使样品混合均匀，取10mL加入无菌试管中，并加蛋白酶(酶活10万U/g)0.05g，即蛋白酶浓度为500U/mL，在振荡器上震荡3-5min(用力不于50N)，使样品与酶充分接触混合，直至样品中微胶囊完全破开并溶解成菌液，之后在摇床中处理30min。
步骤1：在无菌条件下取10.0g±0.01g待测试样，加入到90mL无菌破囊液中混合，混合后加入玻璃珠；
步骤2：将上述混合液置于摇床中振荡，振荡转数250r/min，振荡温度25℃，振荡时间10min；
步骤3：向振荡后的混合液中加入蛋白酶，并混合均匀，(酶活10万U/g)0.05g，即蛋白酶浓度为500U/mL，在振荡器上震荡3-5min(用力不于50N)，使样品与酶充分接触混合，直至样品中微胶囊完全破开并溶解成菌液，之后在摇床中处理30min。
A.5.2 样品稀释
在超净工作台中无菌操作。
A.5.2.1 稀释
将处理后的试样充分摇匀，吸取三角瓶中层菌液1.00mL于1支试管中，用旋涡混合仪混合均匀，再从第1支试管吸取1.00mL菌液于第2支试管，依次进行至涂布前一个的稀释倍数。
A.5.2.2 待涂布试管准备
准确吸取步骤A.5.2.1中处理后的菌液1.00mL，置于9mL无菌生理盐水的试管中，充分混匀，用于涂布平板。
A.5.3 涂布/倾注培养
准确移取0.1mL处理后的菌液至每个平板中央(平行3个平板)，用涂布器将平板中的菌液扩展开(从中心往外，成辐射状扩展)，或倾注培养，在适宜和温度和条件下培养相应时间(详见A.2.1)。注：平板使用前应在37℃培养箱中培养两天，以保证平板干燥、无污染。
A.5.4 菌落计数
A.5.4.1 结果计算
每克样品的活菌数(CFU/g)＝菌落平均数×稀释倍数。
A.5.4.2 菌落计数办法
当只有一个稀释度，其菌落数在50～250之间时，则以该菌落数乘以稀释倍数。
若有两个稀释度，其菌落数均在50～250之间，应按两者菌落总数之比值来决定。若其比值小于2，计算两者的平均数乘以稀释倍数；若大于2则计数其中较小的菌落数乘以稀释倍数。
若三个稀释度的菌落数均大于250，则应按稀释度最高的菌落数乘以稀释倍数。
若三个稀释梯度的平均菌落数均小于50，则应按稀释度最低的菌落数乘以稀释倍数。
结果表示：每克样品中的活菌数，单位为CFU/g，保留两位有效数字。
实施例1
采用果胶酶测量乳酸菌-粪肠球菌体系：
实施例2
采用蛋白酶测量乳酸菌-粪肠球菌体系：
实施例3
采用复合酶测量乳酸菌-粪肠球菌体系：
实施例4
采用果胶酶测量酵母菌体系：
实施例5
采用果胶酶测量凝结芽孢杆菌体系：
实施例6
采用果胶酶测量紫色非硫细菌体系：
实施例7
采用蛋白酶测量硝化杆菌体系：
实施例8
采用蛋白酶测量脱氮硫杆菌体系：
以上所述仅是本发明的优先实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种微囊化活菌制剂含量检测的预处理方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤1：在无菌条件下取待测试样，并与破囊液混合，混合后所述待测试样质量与所述破囊液的体积比例为0.99g:90ml～10.01g:90ml；
步骤2：将上述混合液置于摇床中振荡；
步骤3：向振荡后的混合液中加入酶，并混合均匀。
2.如权利要求1所述的微囊化活菌制剂含量检测的预处理方法，其特征在于，振荡转数250r/min，振荡温度25℃，振荡时间10min。
3.如权利要求1所述的微囊化活菌制剂含量检测的预处理方法，其特征在于，所述破囊液采用0.06mol/L的柠檬酸三钠溶液。
4.如权利要求1所述的微囊化活菌制剂含量检测的预处理方法，其特征在于，所述酶根据所述待测试样不同采用蛋白酶、果胶酶、淀粉酶、半纤维素酶中至少一种或其任意比例混合物。
5.如权利要求4所述的微囊化活菌制剂含量检测的预处理方法，其特征在于，所述蛋白酶采用木瓜蛋白酶。
6.如权利要求4所述的微囊化活菌制剂含量检测的预处理方法，其特征在于，所述半纤维素酶采用甘露聚糖酶或葡聚糖酶。
7.如权利要求1所述的微囊化活菌制剂含量检测的预处理方法，其特征在于，所述步骤2上实施过程中还在混合液中放置有助于破壁的硬质颗粒，所述硬质颗粒采用玻璃珠、磁子中至少一种。
8.如权利要求1所述的微囊化活菌制剂含量检测的预处理方法，其特征在于，所述活菌包括光合细菌、硝化细菌、反硝化细菌、酵母菌、乳酸菌或芽孢杆菌。
9.如权利要求1所述的微囊化活菌制剂含量检测的预处理方法，其特征在于，还包括步骤4：将混合液置于摇床中进行振荡30min。
10.一种微囊化活菌制剂含量的检测方法，其特征在于，包括如权利要求1-9任意一项所述的微囊化活菌制剂含量检测的预处理方法。
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