CN114854817A - 一种活性酵母菌的检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种活性酵母菌的检测方法，属于微生物学检测领域。一种活性酵母菌的检测方法，包括以下步骤：(1)样品预处理：将样品用粉碎机粉碎成粉末状，称取10g粉末状样品，置于无菌均质袋内，加入37～40℃的PH7.2的磷酸盐缓冲液90g进行活化处理，用拍击式均质器拍打均匀5min，制成1:10的菌悬液；(2)培养：将上述菌悬液进行10倍梯度稀释，取合适浓度的稀释液进行接种混匀，恒温培养，于32.5℃培养48±2h，菌落计数，计算样品中的活性酵母菌。本发明的检测结果准确度较高，能满足不同类型原料活性酵母菌的检测需求。
Description
技术领域
本发明涉及微生物学检测领域，具体地说，涉及一种活性酵母菌的检测方法。
背景技术
随着活性酵母菌被广泛应用于动物饲料和宠物保健品中，为了有效地把控原料以及成品的菌含量，降低质量风险，研究开发活性酵母菌的检测方法迫在眉睫。目前，活性酵母菌的主要检测方法为血球板计数法，该方法需要使用显微镜和血球计数板进行肉眼计数，其准确度不高，计数法较为复杂。
不同厂家的活性酵母菌存在差异，同一厂家不同规格活性酵母菌也存在差异。如图1(a)-图1(c)所示，根据物理外观形状，活性酵母菌可以分为：
A.粉状：可溶于稀释液，但菌种不易释放于稀释液；
B.杆状；可溶于稀释液，且菌种容易释放于稀释液；
C.球状：菌种经过包埋处理，外层包裹特殊物质，其不溶于稀释液。
可以看出，粉状和球状的活性酵母菌不易释放于稀释液，血球板计数法对于这两种菌种的检测，准确性不高，根据产品特性，
如何采用合适、通用的检测方法，充分释放活菌，以确保检测结果的准确性，是急需解决的技术问题。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明提供一种活性酵母菌的检测方法，本发明通过选择合适的预处理方法、培养基、培养温度、培养时间等，来确保活性酵母菌检测结果的准确性，缩短检测时间，降低检测成本的同时也能满足不同物理形态的活性酵母菌的检测需求。
为解决上述技术方案，本发明采用如下技术方案：
一种活性酵母菌的检测方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)样品预处理：
将样品用粉碎机粉碎成粉末状(粒径为60-100目)，称取10g粉末状样品，置于无菌均质袋内，加入37～40℃的PH7.2的磷酸盐缓冲液90g进行活化处理，用拍击式均质器拍打均匀5min，制成1:10的菌悬液。
(2)培养：
将上述菌悬液进行10倍梯度稀释，取合适浓度的稀释液进行接种混匀，恒温培养，于32.5℃培养48±2h，菌落计数，计算样品中的活性酵母菌。
进一步的技术方案，所述的活性酵母菌为粉状活性酵母菌、杆状活性酵母菌、球状酵活性母菌中的一种。
进一步的技术方案，所述的培养使用的培养基为孟加拉红培养基或沙氏氯霉素琼脂培养基，优选日常检测常用的孟加拉红培养基。
进一步的技术方案，所述的10倍梯度稀释的具体方法为：
吸取1:10菌悬液1ml，沿管壁缓慢注入含有9ml 37～40℃磷酸盐缓冲液的无菌试管内(注意吸头尖端不要触及稀释液面)，振摇试管使其混合均匀，制成 1:100的菌悬液，依次稀释，分别得到10-3，10-4……10-9等浓度(每个稀释度必须更换无菌吸头)，直至得到合适浓度的稀释液。
进一步的技术方案，所述的合适浓度的稀释液是指该稀释液在平板上的菌落数为30～300CFU。
进一步的技术方案，所述的接种混匀的具体方法为：
在无菌超净工作台中，采用无菌操作，吸取1ml合适浓度的稀释液加入已灭菌的培养皿中，及时将15ml～20ml已灭菌并融化好的孟加拉红培养基或沙氏氯霉素琼脂培养基倒入上述培养皿中，旋转混匀，静置凝固。
进一步的技术方案，所述的恒温培养的具体方法为：
将接种好的培养皿放置在恒温培养箱，盖好皿盖，平皿倒置，于32.5℃培养 48±2h，然后对样品中的活性酵母菌进行检测。
进一步的技术方案，所述的样品包括动物饲料、宠物保健品。
有益效果
与现有技术相比，本发明具有如下显著优点
(1)本发明操作简单方便，无需掌握显微镜和血球计数板的使用方法。
(2)本发明的检测结果准确度较高，能满足不同类型原料活性酵母菌的检测需求。
(3)本发明选择孟加拉红培养基或沙氏氯霉素琼脂培养基可以满足成品活性酵母菌(同时含芽孢类菌或乳酸类菌等)的检测需求。
(4)本发明通过对样品预处理、培养温度、培养时间，缩短相应的检测时间，提高了检测效率，并降低了检测成本。
(5)本发明采用粉碎热激均质法对样品进行预处理，通过粉碎去除活性酵母菌外层包衣物质，然后使用37～40℃的稀释液对活菌酵母菌进行活化处理，最后使用拍打式均质器使活性酵母菌充分释放，满足检测需求，提高检测准确度。
附图说明
图1(a)为粉状活性酵母菌的示意图；
图1(b)为杆状活性酵母菌的示意图；
图1(c)为球状活性酵母菌的示意图；
图2(a)为实施例中MAG金典布拉迪酵母益生菌在孟加拉红培养基上的生长情况；
图2(b)为实施例中MAG金典布拉迪酵母益生菌在沙氏葡萄糖琼脂培养基上的生长情况；
图2(c)为实施例中MAG金典布拉迪酵母益生菌在沙氏氯霉素琼脂培养基上的生长情况；
图3(a)为实施例中枯草芽孢杆菌在孟加拉红培养基上的生长情况；
图3(b)为实施例中枯草芽孢杆菌在沙氏葡萄糖琼脂培养基上的生长情况；
图3(c)为实施例中枯草芽孢杆菌在沙氏氯霉素琼脂培养基上的生长情况；
图4为实施例中不同培养温度下活性酵母菌的检测结果
图5为实施例中不同培养时间活性酵母菌的检测结果；
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。
实施例1
如无特殊说明，本发明的实施例中所涉及的试剂均为市售产品，均可以通过商业渠道购买获得。
研究不同预处理方法对样品中活性酵母菌检测结果的影响，实验过程如下：
针对同一样品分别采用均质法、粉碎均质法、粉碎热激均质法的预处理方法，对粉状：法国拉曼酿酒酵母布拉迪20(200亿)、杆状：安琪酵母酿酒酵母Ⅰ型(200亿)、球状：法国拉曼布拉迪铁达10号(100亿)活性酵母菌进行检测，具体如下：
(1)均质法：称取10g样品，置于无菌均质袋内，加入PH7.2的磷酸盐缓冲液90g，用拍击式均质器拍打均匀5min，制成1:10的菌悬液。
(2)粉碎均质法：先将样品用粉碎机粉碎成粉末状，粒径为60-100目，再称取10g粉末状样品，置于无菌均质袋内，加入PH7.2的磷酸盐缓冲液90g，用拍击式均质器拍打均匀5min，制成1:10的菌悬液。
(3)粉碎热激均质法：先将样品用粉碎机粉碎成粉末状，粒径为60-100目，再称取10g粉末状样品，置于无菌均质袋内，加入40℃的PH7.2的磷酸盐缓冲液90g，用拍击式均质器拍打均匀5min，制成1:10的菌悬液。
取上述不同预处理的样品进行培养，计数，具体方法如下：
吸取1:10菌悬液1ml，沿管壁缓慢注入含有9ml 37～40℃磷酸盐缓冲液的无菌试管内(注意吸头尖端不要触及稀释液面)，振摇试管使其混合均匀，制成 1:100的菌悬液，依次稀释，分别得到10-3，10-4……10-9等浓度(每个稀释度必须更换无菌吸头)，直至得到合适浓度的稀释液(稀释液在平板上的菌落数为30～ 300CFU)。每个样品取2-3个连续适宜稀释度，每一个稀释度重复2-3次，同时加磷酸盐缓冲液作对照空白。
在无菌超净工作台中，采用无菌操作，吸取1ml合适浓度的稀释液加入已灭菌的培养皿中，及时将15ml～20ml已灭菌并融化好的孟加拉红培养基倒入上述培养皿中，旋转混匀，静置凝固。
恒温培养，于32.5℃培养48±2h，菌落计数，计算样品中的活性酵母菌。
样品检测结果如下表1：
表1
从上表可以看出，法国拉曼的布拉迪铁达10号球状活性酵母菌由于外层包裹了特殊物质，不溶于稀释液，需要先粉碎，去除外层特殊物质，然后进行后续处理。法国拉曼的酿酒酵母布拉迪20粉状活性酵母菌由于经过包埋处理，先粉碎再热激处理，粉碎热激均质法对杆状、球状、粉状这三种活性酵母菌均适用，检测效果更好，检测结果更精准，而均质法和粉碎均质法均存在缺陷，不适用于所有的活性酵母菌。
实施例2
研究不同热激温度，对样品中活性酵母菌检测结果的影响，实验过程如下：
粉碎热激均质法：先将样品用粉碎机粉碎成粉末状，粒径为60-100目，再称取10g粉末状样品，置于无菌均质袋内，分别加入10℃、20℃、25℃、30℃、 37℃、40℃、50℃的PH7.2的磷酸盐缓冲液90g，用拍击式均质器拍打均匀5min，制成1:10的菌悬液。
其他处理同实施例1，样品检测结果如下表2:
表2
从上表可以看出，热激温度在37～40℃对三种酵母菌均适用，检测结果更精准，而过低温度、室温以及过高温度处理，对检测结果有影响。
实施例3
研究不同培养基对样品中活性酵母菌检测结果的影响，实验过程如下：
采用实施例1中的粉碎热激均质法对样品进行预处理，分别采用孟加拉红培养基、沙氏葡萄糖琼脂培养基、沙氏氯霉素琼脂培养基进行培养，其他处理同实施例1，检测，结果如下表3
表3
通过上表可以看出，三种培养基的检测结果无明显差异，均可用于原料活性酵母菌的检测。
研究不同培养基对成品活性酵母菌(同时含芽孢类菌)检测结果的影响，选择MAG金典布拉迪酵母益生菌(实际出厂成分分析保证值：酿酒酵母≥5.0× 109CFU/g，枯草芽孢杆菌≥1.0×109CFU/g)作为样品，实验过程如下：
采用实施例1中的粉碎热激均质法对样品进行预处理，分别采用孟加拉红培养基、沙氏葡萄糖琼脂培养基、沙氏氯霉素琼脂培养基进行培养，其他处理同实施例1，检测，结果如图2(a)-图2(c)所示；
从检测结果可以看出，孟加拉红培养基和沙氏氯霉素琼脂培养基上面的菌落比较有规律，外观形态基本一致，而沙氏葡萄糖琼脂培养基上面的菌落杂乱无章，外观形态存在差异。因此，怀疑该平板上有芽孢类菌干扰检测结果。
故继续研究，选用枯草芽孢杆菌(厂家：江苏博立生物制品有限公司规格： 1000亿CFU/g)采用三种不同的培养基进行培养，结果如图3(a)-图3(c)所示；
从检测结果可以看出，枯草芽孢杆菌仅能在沙氏葡萄糖琼脂培养基上生长，因为本申请最终选择孟加拉红培养基或沙氏氯霉素琼脂培养基进行活菌酵母菌的检测。
孟加拉红培养基和沙氏氯霉素琼脂培养基的成分中都含有氯霉素。而氯霉素可以抑制细菌的生长繁殖。选用孟加拉红培养基和沙氏氯霉素琼脂培养基上只会有活性酵母菌生长繁殖，芽孢类菌会被抑制。
实施例4
研究不同培养温度对样品中活性酵母菌检测结果的影响，实验过程如下：
采用实施例1中的粉碎热激均质法对样品进行预处理，分别于22.5℃、28.0℃、30.0℃、32.5℃、36.0℃、40.0℃下培养48h，其他处理同实施例1，检测，结果如下表4和图4：
表4
通过上表和图4可以看出，从22.5℃开始，温度越高，活性酵母菌生长越好， 32.5℃生长最好，但是之后温度越高，生长会变差，因此，确定了培养温度—— 32.5℃。
实施例5
研究不同培养时间对样品中活性酵母菌检测结果的影响，实验过程如下：
采用实施例1中的粉碎热激均质法对样品进行预处理，采用孟加拉红培养基，于32.5℃下分别培养24h、48h、72h，其他处理同实施例1，检测，结果如下表5和图5：
表5
通过上表和图5可以看出，培养时间是24h，活性酵母数远低于标示量，培养时间48h时，活性酵母菌数与标示量吻合，而培养时间72h时，活性酵母菌低于标示量，可以看看出培养时间延长，活性酵母菌反而呈现衰退趋势，因此，确定了培养时间——48h。
Claims (9)
1.一种活性酵母菌的检测方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)样品预处理：
将样品用粉碎机粉碎成粉末状，称取10g粉末状样品，置于无菌均质袋内，加入37～40℃的PH7.2的磷酸盐缓冲液90g进行活化处理，用拍击式均质器拍打均匀5min，制成1:10的菌悬液；
(2)培养：
将上述菌悬液进行10倍梯度稀释，取合适浓度的稀释液进行接种混匀，恒温培养，于32.5℃培养48±2h，菌落计数，计算样品中的活性酵母菌。
2.根据权利要求1所述的活性酵母菌的检测方法，其特征在于：所述的活性酵母菌为粉状活性酵母菌、杆状活性酵母菌、球状活性酵母菌中的一种。
3.根据权利要求1所述的活性酵母菌的检测方法，其特征在于：所述的培养使用的培养基为孟加拉红培养基或沙氏氯霉素琼脂培养基。
4.根据权利要求1所述的活性酵母菌的检测方法，其特征在于：所述的10倍梯度稀释的具体方法为：
吸取1:10菌悬液1ml，沿管壁缓慢注入含有9ml 37～40℃磷酸盐缓冲液的无菌试管内，振摇试管使其混合均匀，制成1:100的菌悬液，依次稀释，分别得到10-3，10-4……10-9等浓度，直至得到合适浓度的稀释液。
5.根据权利要求1或4所述的活性酵母菌的检测方法，其特征在于：所述的合适浓度的稀释液是指该稀释液在平板上的菌落数为30～300CFU。
6.根据权利要求1所述的活性酵母菌的检测方法，其特征在于：所述的接种混匀的具体方法为：
在无菌超净工作台中，采用无菌操作，吸取1ml合适浓度的稀释液加入已灭菌的培养皿，并将15ml～20ml已灭菌并融化好的孟加拉红培养基或沙氏氯霉素琼脂培养基倒入上述培养皿中，旋转混匀，静置凝固。
7.根据权利要求1所述的活性酵母菌的检测方法，其特征在于：所述的恒温培养的具体方法为：
将接种好的培养皿放置在恒温培养箱，盖好皿盖，平皿倒置，于32.5℃培养48±2h，然后对样品中的活性酵母菌进行检测。
8.根据权利要求1所述的活性酵母菌的检测方法，其特征在于：所述的样品包括动物饲料、宠物保健品。
9.根据权利要求1所述的活性酵母菌的检测方法，其特征在于：所述的粉末状样品的粒径为60-100目。
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