CN102757951B - 一种海洋双菌共固定化体系的构建和造纸废水处理的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种海洋双菌共固定化体系的构建和造纸废水处理的方法。采用两种海洋真菌－微紫青霉菌和内生拟盘多毛孢菌进行共固定化。双菌共固定化体系和用于造纸废水处理的步骤为：（1）海洋微紫青霉菌菌丝球的制备：将微紫青霉菌接种到培养基中进行培养，形成具有一定机械强度的菌丝球；（2）共固定化菌丝球的制备：以海洋微紫青霉菌菌丝球为载体在含有一定海洋内生拟盘多毛孢菌J63孢子浓度的固定化培养基中进行固定化；（3）共固定化菌丝球用于造纸废水处理：将制得的共固定化菌丝球直接放入造纸废水中进行处理，得到纯清度好、几乎无色的水。本发明所开发的双菌共固定化方法，具有简单、快速、高效等优点，而且不需要进行任何物理或化学处理。

Description

一种海洋双菌共固定化体系的构建和造纸废水处理的方法

技术领域

本发明涉及一种海洋双菌共固定化体系的构建和造纸废水处理的方法。

背景技术

20世纪70年代以后，固定化微生物技术直接从固定化酶技术发展而来，固定化微生物技术具有微生物密度高、反应迅速、微生物流失少、产物易分离以及反应过程易控制等优点，是一种高效低耗、运转管理容易和具有良好应用前途的新技术。它是通过物理或化学手段将微生物固定在载体上使其高度密集并保持其生物活性功能，在适宜的条件下还可以增殖以满足应用之需的一种生物技术。

固定化微生物技术作为一种新兴的废水处理技术与传统的悬浮生物处理工艺相比，具有处理效率高、运行稳定、可纯化和保持高效优势菌种、反应器生物量大、污泥产生量少以及易于固液分离等一系列优点。因此，该技术在废水处理，特别是特种工业废水或高浓度有机废水处理上有着广阔的前景。应用固定化微生物技术进行废水处理研究，是一项符合可持续发展战略的课题，但目前还存在着许多亟待解决的问题：（1）实际废水是一个十分复杂的混合体系，如果只用单一的菌株处理，一般难以达到净化水质和降解废弃物的目的；（2）由于载体的性能是固定化细胞技术能否投入实际应用的关键，而目前使用的固定化细胞的载体均为无机或高分子合成有机物，除了这些载体占有相当大的体积比例以外，固定化细胞的密度也很难达到很高，因此需要开发研制更理想的固定化载体；（3）目前的细胞固定化，基本上只能固定一种微生物，因此在其处理具有多成分的复杂体系时效果不好，譬如在废水处理中难以同时达到既净化水质，又去除或降解废水中的细微悬浮物质，所以迫切需要开发出能够固定化多种微生物的生物体系。

目前，传统的固定化载体大致可分为两类：有机类载体和无机类载体，其中有机类载体又可分为天然高分子载体和合成高分子载体。与传统的固定化载体相比，生物质载体菌丝球具有许多的优点：（1）由于菌丝球本身就是真菌菌丝所构成，所以它具有一定的亲疏水平衡值，球表面带有和微生物一样的电荷，表面的官能团或元素也有利于细菌等的粘附；（2）菌丝球是由菌丝体相互缠绕形成的球体，因此内部是空间网状结构，具有多孔以及比表面积大的特点；（3）菌丝球本身就是微生物，它在生长过程中可以产生体系所需要的酶或其它生物活性物质，因此，具有载体和产酶的双重功能；（4）菌丝球生长迅速、代时短、制备简单，因而生产成本非常低；（5）用菌丝球作为载体可减少环境二次污染，具有环境友好性。所以，将菌丝球作为一种新型的生物质载体将具有十分广阔的应用前景。 

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种海洋双菌共固定化体系的构建和造纸废水处理的方法。

海洋双菌共固定化体系的构建和造纸废水处理的方法的步骤如下：

1）海洋微紫青霉菌菌丝球的制备：

将保存于4 ℃的海洋微紫青霉菌固体斜面取出，用无菌水制成浓度为ｎ=10⁶～10⁹ mL^-1的孢子悬液，以3～5 %的接种量接入含100 mL菌丝球培养基的500 mL锥形瓶中，于160～180 rpm,26～30 ℃下摇床培养4～5天，然后用水将多余的菌丝体洗去，过滤收集菌丝球，放入冰箱备用，菌丝球培养基的组成为：葡萄糖 10～15 g/L，酒石酸铵 2～3 g/L，KH₂PO₄ 2～3 g/L，MgSO₄·5H₂O 0.5～1.0 g/L，酵母提取物 2～3 g/L，pH 4.0～5.0，海洋微紫青霉菌保藏在中国典型培养物保藏中心，地址为中国.武汉.武汉大学，保藏日为2012年1月11日，命名Penicillium janthinellum CP1，保藏号为CCTCC M 2012006；

2）固定化菌丝球制备：

首先，用100 mL预先灭过菌的蒸馏水制备浓度为1.0～3.0×10⁹ /mL的海洋内生拟盘多毛孢菌J63孢子悬浮液，用于接种；接着，取5～10 g海洋微紫青霉菌菌丝球，接种于含有固定化培养基的三角瓶中；然后，用移液管移取10 mL海洋内生拟盘多毛孢菌J63孢子悬浮液接种于上述已经接有海洋微紫青霉菌菌丝球的三角瓶中，使得海洋内生拟盘多毛孢菌J63孢子悬浮液的最终浓度为1.0～3.0×10⁸ /mL；最后，海洋内生拟盘多毛孢菌J63孢子和海洋微紫青霉菌菌丝球在含有固定化培养基的三角瓶中共固定化生长1～3天，培养结束后，用水将多余的菌丝体洗去，过滤收集菌丝球，放入冰箱备用，固定化培养基的组成为：葡萄糖 20～30 g/L，酒石酸铵 4～6 g/L，KH₂PO₄ 4～6 g/L，MgSO₄·5H₂O 0.5～1.0 g/L，酵母提取物 2～3 g/L，pH 4.0～5.0，海洋内生拟盘多毛孢菌J63已保藏于中国典型培养物保藏中心，地址为中国.武汉.武汉大学，保藏号为CCTCC M 2010300，保藏日为2010年11月13日； 

3）固定化菌丝球用于造纸废水的处理

称取2～5 g固定化菌丝球，加入到含有100 mL按1：4稀释的造纸废水的250 mL三角瓶中振荡处理6～10 h，转速140～160 rpm, 温度28-30 ℃，以不加固定化菌丝球的处理为空白对照，在相同的条件下处理，废水处理效果用生物降解率 Y%来表征，即：

其中，A₁为处理结束后空白对照测得的浊度；A₂为处理结束后样品测得的浊度，本发明结果表明，用固定化菌丝球对造纸废水进行6～10 h的振荡处理，生物降解率可达96-99%。

 [0007] 本发明与现有技术相比具有的有益效果：

1）所开发的共固定化方法，具有简单、快速、高效等优点，而且不需要任何的物理或化学前处理；

2）所采用的固定化载体---菌丝球，具有多孔结构，较大的比表面积，较好的机械强度和生物相容性，且价格低廉，易于制备，代时短，重要的是，它具有环境友好性，不会产生二次污染；

3）菌丝球本身就是微生物，它在生长过程中可以产生体系所需要的酶或其它生物活性物质，具有载体和产酶的双重功能；

4）应用此固定化菌丝球对造纸废水进行处理的条件极为粗放，处理过程中不需要进行任何的灭菌或保护措施，适合废水的实际工业应用。

具体实施方式

本发明采用本实验室自行从浙江东部沿海10-30 m深的海域中采集到的海泥样品中分离筛选得到的两株海洋真菌---内生拟盘多毛孢菌和微紫青霉菌，为高效优势微生物，首先进行了双真菌共固定化研究，继而将此共固定化体系用于废纸再生造纸废水的处理。经本实验室的已有实验表明，由本实验室分离筛选到的海洋真菌内生拟盘多毛孢菌（命名为Pestalotiopsissp. J63）在一定的培养条件下能够分泌产生较高的木质素降解酶---漆酶，漆酶是一种含有四个铜离子的多酚氧化酶，它作为一种木质素降解酶，具有非专一性，除能有效降解木质素外，还对环境中异生芳香化合物具有独特的降解作用，可用于染料废水、造纸废水以及含酚废水的处理等，应用面广，意义重大；海洋真菌微紫真霉菌（命名为Penicilliumjathinellum CP1）在一定的培养条件下不仅能分泌产生强大的纤维素降解酶系，而且更有意义的是，菌丝间由于相互缠绕能够形成具有一定机械强度、多孔网状、表面光滑均匀的球体结构---菌丝球。以往，菌丝球大多用在发酵生产工业上；近年来，人们发现菌丝球能吸附降解一些难处理的物质，又由于菌丝球自身独特的结构特点，这也为解决生物强化技术在废水处理系统中面临的关键问题---高效优势微生物流失，提供了全新的思路与方法。

将丝状真菌Penicilliumjathinellum CP1菌丝球作为固定化载体用于固定白腐真菌Pestalotiopsissp. J63菌丝，形成的固定化菌丝球既具有强大的纤维素降解活力，又具有强大的木质素降解和脱色能力，而且据文献报道Penicilliumjathinellum具有高抗重金属离子的特性，因此，这样的一个共固定化体系能有效地处理成分复杂的废水。

海洋双菌共固定化体系的构建和造纸废水处理的方法的步骤如下：

1）海洋微紫青霉菌菌丝球的制备：

将保存于4 ℃的海洋微紫青霉菌固体斜面取出，用无菌水制成浓度为ｎ=10⁶～10⁹ mL^-1的孢子悬液，以3～5 %的接种量接入含100 mL菌丝球培养基的500 mL锥形瓶中，于160～180 rpm,26～30 ℃下摇床培养4～5天，然后用水将多余的菌丝体洗去，过滤收集菌丝球，放入冰箱备用，菌丝球培养基的组成为：葡萄糖 10～15 g/L，酒石酸铵 2～3 g/L，KH₂PO₄ 2～3 g/L，MgSO₄·5H₂O 0.5～1.0 g/L，酵母提取物 2～3 g/L，pH 4.0～5.0，海洋微紫青霉菌保藏在中国典型培养物保藏中心，地址为中国.武汉.武汉大学，保藏日为2012年1月11日，命名Penicillium janthinellum CP1，保藏号为CCTCC M 2012006；

2）固定化菌丝球制备：

首先，用100 mL预先灭过菌的蒸馏水制备浓度为1.0～3.0×10⁹ /mL的海洋内生拟盘多毛孢菌J63孢子悬浮液，用于接种；接着，取5～10 g海洋微紫青霉菌菌丝球，接种于含有固定化培养基的三角瓶中；然后，用移液管移取10 mL海洋内生拟盘多毛孢菌J63孢子悬浮液接种于上述已经接有海洋微紫青霉菌菌丝球的三角瓶中，使得海洋内生拟盘多毛孢菌J63孢子悬浮液的最终浓度为1.0～3.0×10⁸ /mL；最后，海洋内生拟盘多毛孢菌J63孢子和海洋微紫青霉菌菌丝球在含有固定化培养基的三角瓶中共固定化生长1～3天，培养结束后，用水将多余的菌丝体洗去，过滤收集菌丝球，放入冰箱备用，固定化培养基的组成为：葡萄糖 20～30 g/L，酒石酸铵 4～6 g/L，KH₂PO₄ 4～6 g/L，MgSO₄·5H₂O 0.5～1.0 g/L，酵母提取物 2～3 g/L，pH 4.0～5.0，海洋内生拟盘多毛孢菌J63已保藏于中国典型培养物保藏中心，地址为中国.武汉.武汉大学，保藏号为CCTCC M 2010300，保藏日为2010年11月13日； 

3）固定化菌丝球用于造纸废水的处理

称取2～5 g固定化菌丝球，加入到含有100 mL按1：4稀释的造纸废水的250 mL三角瓶中振荡处理6～10 h，转速140～160 rpm, 温度28-30 ℃，以不加固定化菌丝球的处理为空白对照，在相同的条件下处理，废水处理效果用生物降解率 Y%来表征，即：

其中，A₁为处理结束后空白对照测得的浊度；A₂为处理结束后样品测得的浊度，本发明结果表明，用固定化菌丝球对造纸废水进行6～10 h的振荡处理，生物降解率可达96-99%。

以下通过实施例对本发明作进一步的描述：

实施例1

1）海洋微紫青霉菌菌丝球的制备；

将保存于4 ℃的海洋微紫青霉菌固体斜面取出，用无菌水制成浓度为ｎ=10⁶ mL^-1的孢子悬液，以3 %的接种量接入预先配制的、含100 mL菌丝球培养液的500 mL锥形瓶中，于转速160 rpm/min,温度26 ℃下摇床培养4天。然后用水将多余的菌丝体洗去，过滤收集菌丝球，放入冰箱备用。菌丝球的培养基的组成为：葡萄糖 10 g/L，酒石酸铵 2 g/L，KH₂PO₄ 2 g/L，MgSO₄·5H₂O 0.5 g/L，酵母提取物 2 g/L，pH 4.0；

2）固定化菌丝球制备；

首先，用100 mL预先灭过菌的蒸馏水制备浓度为1.0×10⁹ /mL的海洋内生拟盘多毛孢菌J63孢子悬浮液，用于接种；接着，取5 g海洋微紫青霉菌菌丝球，接种于含有固定化培养基的三角瓶中；然后，用移液管移取10 mL海洋内生拟盘多毛孢菌J63孢子悬浮液接种于上述已经接有海洋微紫青霉菌菌丝球的三角瓶中，使得海洋内生拟盘多毛孢菌J63孢子悬浮液的最终浓度为1.0×10⁸ /mL；最后，海洋内生拟盘多毛孢菌J63孢子和海洋微紫青霉菌菌丝球在含有固定化培养基的三角瓶中共固定化生长1天，培养结束后，用水将多余的菌丝体洗去，过滤收集菌丝球，放入冰箱备用，固定化培养基的组成为：葡萄糖 20 g/L，酒石酸铵 4 g/L，KH₂PO₄ 4 g/L，MgSO₄·5H₂O 0.5 g/L，酵母提取物 2 g/L，pH 4.0；

3）固定化菌丝球用于造纸废水的处理；

称取5 g固定化菌丝球接种于预先配制的、含100 mL 废水悬浮液的250 mL 锥形瓶中，于转速160 rpm/min, 温度28 ℃下摇床培养10 h，然后测定浊度变化，计算生物降解率。同时以不接入固定化菌丝球的废水，作为空白对照。废水悬浮液的组成（L^-1）：废水原液按1：4稀释，葡萄糖 5 g，酒石酸铵 1 g，pH自然。废水处理10 h后，生物降解率达到98.7%。

实施例2

1）海洋微紫青霉菌菌丝球的制备；

将保存于4 ℃的海洋微紫青霉菌固体斜面取出，用无菌水制成浓度为ｎ=10⁹ mL^-1的孢子悬液，以5 %的接种量接入预先配制的、含100 mL菌丝球培养液的500 mL锥形瓶中，于转速180 rpm/min,温度30 ℃下摇床培养5天。然后用水将多余的菌丝体洗去，过滤收集菌丝球，放入冰箱备用。用于制备菌丝球的培养基的组成为：葡萄糖15 g/L，酒石酸铵3 g/L，KH₂PO₄ 3 g/L，MgSO₄·5H₂O 1.0 g/L，酵母提取物3 g/L，pH 5.0；

2）固定化菌丝球制备；

首先，用100 mL预先灭过菌的蒸馏水制备浓度为3.0×10⁹ /mL的海洋内生拟盘多毛孢菌J63孢子悬浮液，用于接种；接着，取10 g海洋微紫青霉菌菌丝球，接种于含有固定化培养基的三角瓶中；然后，用移液管移取10 mL海洋内生拟盘多毛孢菌J63孢子悬浮液接种于上述已经接有海洋微紫青霉菌菌丝球的三角瓶中，使得海洋内生拟盘多毛孢菌J63孢子悬浮液的最终浓度为3.0×10⁸ /mL；最后，海洋内生拟盘多毛孢菌J63孢子和海洋微紫青霉菌菌丝球在含有固定化培养基的三角瓶中共固定化生长3天，培养结束后，用水将多余的菌丝体洗去，过滤收集菌丝球，放入冰箱备用，固定化培养基的组成为：葡萄糖 30 g/L，酒石酸铵 6 g/L，KH₂PO₄ 6 g/L，MgSO₄·5H₂O 1.0 g/L，酵母提取物 3 g/L，pH 5.0；

3）固定化菌丝球用于造纸废水的处理；

称取5 g固定化菌丝球接种于预先配制的、含100 mL 废水悬浮液的250 mL 锥形瓶中，于转速160 rpm/min, 温度28 ℃下摇床培养10 h，然后测定浊度变化，计算生物降解率。同时以不接入固定化菌丝球的废水，作为空白对照。废水悬浮液的组成（L^-1）：废水原液按1：4稀释，葡萄糖 5 g，酒石酸铵 1 g，pH自然。废水处理10 h后，生物降解率达到98.4%。

实施例3

1）海洋微紫青霉菌菌丝球的制备；

将保存于4 ℃的海洋微紫青霉菌固体斜面取出，用无菌水制成浓度为ｎ=10⁹ mL^-1的孢子悬液，以5 %的接种量接入预先配制的、含100 mL菌丝球培养液的500 mL锥形瓶中，于转速180 rpm/min,温度30 ℃下摇床培养4天。然后用水将多余的菌丝体洗去，过滤收集菌丝球，放入冰箱备用。用于制备菌丝球的培养基：葡萄糖 10 g/L，酒石酸铵 2 g/L，KH₂PO₄ 2 g/L，MgSO₄·5H₂O 0.5 g/L，酵母提取物 2 g/L，pH 5.0；

2）固定化菌丝球制备：

首先，用100 mL预先灭过菌的蒸馏水制备浓度为2.0×10⁹ /mL的海洋内生拟盘多毛孢菌J63孢子悬浮液，用于接种；接着，取10 g海洋微紫青霉菌菌丝球，接种于含有固定化培养基的三角瓶中；然后，用移液管移取10 mL海洋内生拟盘多毛孢菌J63孢子悬浮液接种于上述已经接有海洋微紫青霉菌菌丝球的三角瓶中，使得海洋内生拟盘多毛孢菌J63孢子悬浮液的最终浓度为2.0×10⁸ /mL；最后，海洋内生拟盘多毛孢菌J63孢子和海洋微紫青霉菌菌丝球在含有固定化培养基的三角瓶中共固定化生长2天，培养结束后，用水将多余的菌丝体洗去，过滤收集菌丝球，放入冰箱备用，固定化培养基的组成为：葡萄糖 20 g/L，酒石酸铵 4 g/L，KH₂PO₄ 4 g/L，MgSO₄·5H₂O 0.5 g/L，酵母提取物 2 g/L，pH 5.0.

3）固定化菌丝球用于造纸废水的处理；

称取5 g固定化菌丝球接种于预先配制的、含100 mL 废水悬浮液的250 mL 锥形瓶中，于转速160 rpm/min, 温度28 ℃下摇床培养10 h，然后测定浊度变化，计算生物降解率。同时以不接入固定化菌丝球的废水，作为空白对照。废水悬浮液的组成（L^-1）：废水原液按1：4稀释，葡萄糖 5 g，酒石酸铵 1 g，pH自然。废水处理10 h后，生物降解率达到96.4%。

实施例4

1）海洋微紫青霉菌菌丝球的制备

将保存于4 ℃的海洋微紫青霉菌固体斜面取出，用无菌水制成浓度为ｎ=10⁹ mL^-1的孢子悬液，以5 %的接种量接入预先配制的、含100 mL菌丝球培养液的500 mL锥形瓶中，于转速180 rpm/min,温度30 ℃下摇床培养4天。然后用水将多余的菌丝体洗去，过滤收集菌丝球，放入冰箱备用。用于制备菌丝球的培养基：葡萄糖 10 g/L，酒石酸铵 2 g/L，KH₂PO₄ 2 g/L，MgSO₄·5H₂O 0.5 g/L，酵母提取物 2 g/L，pH 5.0；

2）固定化菌丝球制备

首先，用100 mL预先灭过菌的蒸馏水制备浓度为3.0×10⁹ /mL的海洋内生拟盘多毛孢菌J63孢子悬浮液，用于接种；接着，取10 g海洋微紫青霉菌菌丝球，接种于含有固定化培养基的三角瓶中；然后，用移液管移取10 mL海洋内生拟盘多毛孢菌J63孢子悬浮液接种于上述已经接有海洋微紫青霉菌菌丝球的三角瓶中，使得海洋内生拟盘多毛孢菌J63孢子悬浮液的最终浓度为3.0×10⁸ /mL；最后，海洋内生拟盘多毛孢菌J63孢子和海洋微紫青霉菌菌丝球在含有固定化培养基的三角瓶中共固定化生长3天，培养结束后，用水将多余的菌丝体洗去，过滤收集菌丝球，放入冰箱备用，固定化培养基的组成为：葡萄糖 20 g/L，酒石酸铵 4 g/L，KH₂PO₄ 4 g/L，MgSO₄·5H₂O 0.5 g/L，酵母提取物 2 g/L，pH 5.0；

3）固定化菌丝球用于造纸废水的处理

称取5 g固定化菌丝球接种于预先配制的、含100 mL 废水悬浮液的250 mL 锥形瓶中，于转速160 rpm/min，温度28 ℃下摇床培养10 h，然后测定浊度变化，计算生物降解率。同时以不接入固定化菌丝球的废水，作为空白对照。废水悬浮液的组成（L^-1）：废水原液按1：4稀释，葡萄糖0 g、1 g、2.5  g、5 g、7.5 g和10 g，酒石酸铵 1 g，pH自然。废水处理10 h后，生物降解率达到0.33%、85.6%、99.7%、99%、96.3%和93.3%。

实施例5

1）海洋微紫青霉菌菌丝球的制备；

将保存于4 ℃的海洋微紫青霉菌固体斜面取出，用无菌水制成浓度为ｎ=10⁹ mL^-1的孢子悬液，以5 %的接种量接入预先配制的、含100 mL菌丝球培养液的500 mL锥形瓶中，于转速180 rpm/min,温度30 ℃下摇床培养4天。然后用水将多余的菌丝体洗去，过滤收集菌丝球，放入冰箱备用。用于制备菌丝球的培养基：葡萄糖 10 g/L，酒石酸铵 2 g/L，KH₂PO₄ 2 g/L，MgSO₄·5H₂O 0.5 g/L，酵母提取物 2 g/L，pH 5.0；

2）固定化菌丝球制备；

首先，用100 mL预先灭过菌的蒸馏水制备浓度为3.0×10⁹ /mL的海洋内生拟盘多毛孢菌J63孢子悬浮液，用于接种；接着，取10 g海洋微紫青霉菌菌丝球，接种于含有固定化培养基的三角瓶中；然后，用移液管移取10 mL海洋内生拟盘多毛孢菌J63孢子悬浮液接种于上述已经接有海洋微紫青霉菌菌丝球的三角瓶中，使得海洋内生拟盘多毛孢菌J63孢子悬浮液的最终浓度为3.0×10⁸ /mL；最后，海洋内生拟盘多毛孢菌J63孢子和海洋微紫青霉菌菌丝球在含有固定化培养基的三角瓶中共固定化生长3天，培养结束后，用水将多余的菌丝体洗去，过滤收集菌丝球，放入冰箱备用，固定化培养基的组成为：葡萄糖 20 g/L，酒石酸铵 4 g/L，KH₂PO₄ 4 g/L，MgSO₄·5H₂O 0.5 g/L，酵母提取物 2 g/L，pH 5.0；

3）固定化菌丝球用于造纸废水的处理；

称取5 g固定化菌丝球接种于预先配制的、含100 mL 废水悬浮液的250 mL 锥形瓶中，于转速160 rpm/min，温度28 ℃下摇床培养10 h，然后测定浊度变化，计算生物降解率。同时以不接入固定化菌丝球的废水，作为空白对照。废水悬浮液的组成（L^-1）：废水原液按1：4稀释，葡萄糖2.5 g，酒石酸铵0 g、0.1 g、0.5 g、1 g、2 g和3 g，pH自然。废水处理10 h后，生物降解率达到0.33%、85.6%、99.7%、99%、96.3%和93.3%。

实施例6

1）海洋微紫青霉菌菌丝球的制备；

将保存于4 ℃的海洋微紫青霉菌固体斜面取出，用无菌水制成浓度为ｎ=；10⁹ mL^-1的孢子悬液，以；5 %的接种量接入预先配制的、含100 mL菌丝球培养液的500 mL锥形瓶中，于转速；180 rpm/min,温度；30 ℃下摇床培养4天。然后用水将多余的菌丝体洗去，过滤收集菌丝球，放入冰箱备用。用于制备菌丝球的培养基：葡萄糖 10 g/L，酒石酸铵 2 g/L，KH₂PO₄ 2 g/L，MgSO₄·5H₂O 0.5 g/L，酵母提取物 2 g/L，pH 5.0；

2）固定化菌丝球制备；

首先，用100 mL预先灭过菌的蒸馏水制备浓度为3.0×10⁹ /mL的海洋内生拟盘多毛孢菌J63孢子悬浮液，用于接种；接着，取10 g海洋微紫青霉菌菌丝球，接种于含有固定化培养基的三角瓶中；然后，用移液管移取10 mL海洋内生拟盘多毛孢菌J63孢子悬浮液接种于上述已经接有海洋微紫青霉菌菌丝球的三角瓶中，使得海洋内生拟盘多毛孢菌J63孢子悬浮液的最终浓度为3.0×10⁸ /mL；最后，海洋内生拟盘多毛孢菌J63孢子和海洋微紫青霉菌菌丝球在含有固定化培养基的三角瓶中共固定化生长3天，培养结束后，用水将多余的菌丝体洗去，过滤收集菌丝球，放入冰箱备用，固定化培养基的组成为：葡萄糖 20 g/L，酒石酸铵 4 g/L，KH₂PO₄ 4 g/L，MgSO₄·5H₂O 0.5 g/L，酵母提取物 2 g/L，pH 5.0；

3）固定化菌丝球用于造纸废水的处理；

称取5 g固定化菌丝球接种于预先配制的、含100 mL 废水悬浮液的250 mL 锥形瓶中，于转速160 rpm/min, 温度分别为10 ℃、25 ℃ 、28 ℃、30 ℃和37 ℃下摇床培养10 h，然后测定浊度变化，计算生物降解率。同时以不接入固定化菌丝球的废水，作为空白对照。废水悬浮液的组成（L^-1）：废水原液按1：4稀释，葡萄糖 2.5 g，酒石酸铵 0.1 g，pH自然。废水处理10 h后，生物降解率分别达到27.7%、97.6%、98.3%、98.2%和77.8%。

实施例 7

1）海洋微紫青霉菌菌丝球的制备；

将保存于4 ℃的海洋微紫青霉菌固体斜面取出，用无菌水制成浓度为ｎ=10⁹ mL^-1的孢子悬液，以5 %的接种量接入预先配制的、含100 mL菌丝球培养液的500 mL锥形瓶中，于转速180 rpm/min,温度30 ℃下摇床培养4天。然后用水将多余的菌丝体洗去，过滤收集菌丝球，放入冰箱备用。用于制备菌丝球的培养基：葡萄糖 10 g/L，酒石酸铵 2 g/L，KH₂PO₄ 2 g/L，MgSO₄·5H₂O 0.5 g/L，酵母提取物 2 g/L，pH 5.0.

2）固定化菌丝球制备；

首先，用100 mL预先灭过菌的蒸馏水制备浓度为3.0×10⁹ /mL的海洋内生拟盘多毛孢菌J63孢子悬浮液，用于接种；接着，取10 g海洋微紫青霉菌菌丝球，接种于含有固定化培养基的三角瓶中；然后，用移液管移取10 mL海洋内生拟盘多毛孢菌J63孢子悬浮液接种于上述已经接有海洋微紫青霉菌菌丝球的三角瓶中，使得海洋内生拟盘多毛孢菌J63孢子悬浮液的最终浓度为3.0×10⁸ /mL；最后，海洋内生拟盘多毛孢菌J63孢子和海洋微紫青霉菌菌丝球在含有固定化培养基的三角瓶中共固定化生长3天，培养结束后，用水将多余的菌丝体洗去，过滤收集菌丝球，放入冰箱备用，固定化培养基的组成为：葡萄糖 20 g/L，酒石酸铵 4 g/L，KH₂PO₄ 4 g/L，MgSO₄·5H₂O 0.5 g/L，酵母提取物 2 g/L，pH 5.0；

3）固定化菌丝球用于造纸废水的处理；

称取5 g固定化菌丝球接种于预先配制的、含100 mL 废水悬浮液的250 mL 锥形瓶中，于转速160 rpm/min，温度28 ℃下摇床培养10 h，然后测定浊度变化，计算生物降解率。同时以不接入固定化菌丝球的废水，作为空白对照。废水悬浮液的组成（L^-1）：废水原液按1：4稀释，葡萄糖 2.5 g，酒石酸铵 0.1 g，pH分别为1.53、3.6、6.46、8.04、9.03、10.04和11.23。废水处理10 h后，生物降解率达到97.7%、99.4%、72.2%、37.7%、7.07%、6.54%和3.28%。

Claims (1)

1.一种海洋双菌共固定化体系的构建和造纸废水处理的方法，其特征在于它的步骤如下：

1）海洋微紫青霉菌菌丝球的制备： 

将保存于4 ℃的海洋微紫青霉菌（Penicillium janthinellum）CP1固体斜面取出，用无菌水制成浓度为ｎ=10⁶～10⁹个·mL^-1的孢子悬液，以3～5 %的接种量接入含100 mL菌丝球培养基的500 mL锥形瓶中，于160～180 rpm,26～30 ℃下摇床培养4～5天，然后用水将多余的菌丝体洗去，过滤收集菌丝球，放入冰箱备用，菌丝球培养基的组成为：葡萄糖 10～15 g/L，酒石酸铵 2～3 g/L，KH₂PO₄ 2～3 g/L，MgSO₄·5H₂O 0.5～1.0 g/L，酵母提取物 2～3 g/L，pH 4.0～5.0，海洋微紫青霉菌CP1保藏在中国典型培养物保藏中心，地址为中国.武汉.武汉大学，保藏日为2012年1月11日，命名Penicillium janthinellum CP1，保藏号为CCTCC M 2012006；

2）固定化菌丝球制备：

首先，用100 mL预先灭过菌的蒸馏水制备浓度为1.0～3.0×10⁹个/mL的海洋内生拟盘多毛孢菌J63孢子悬浮液，用于接种；接着，取5～10 g海洋微紫青霉菌CP1菌丝球，接种于含有固定化培养基的三角瓶中；然后，用移液管移取10 mL海洋内生拟盘多毛孢菌J63孢子悬浮液接种于上述已经接有海洋微紫青霉菌CP1菌丝球的三角瓶中，使得海洋内生拟盘多毛孢菌J63孢子悬浮液的最终浓度为1.0～3.0×10⁸个/mL；最后，海洋内生拟盘多毛孢菌J63孢子和海洋微紫青霉菌CP1菌丝球在含有固定化培养基的三角瓶中共固定化生长1～3天，培养结束后，用水将多余的菌丝体洗去，过滤收集菌丝球，放入冰箱备用，固定化培养基的组成为：葡萄糖 20～30 g/L，酒石酸铵 4～6 g/L，KH₂PO₄ 4～6 g/L，MgSO₄·5H₂O 0.5～1.0 g/L，酵母提取物 2～3 g/L，pH 4.0～5.0，海洋内生拟盘多毛孢菌J63已保藏于中国典型培养物保藏中心，地址为中国.武汉.武汉大学，保藏号为CCTCC M 2010300，保藏日为2010年11月13日； 

3）固定化菌丝球用于造纸废水的处理

称取2～5 g固定化菌丝球，加入到含有100 mL按1：4稀释的造纸废水的250 mL三角瓶中振荡处理6～10 h，转速140～160 rpm, 温度28-30 ℃，以不加固定化菌丝球的处理为空白对照，在相同的条件下处理，废水处理效果用生物降解率 Y%来表征，即：

其中，A₁为处理结束后空白对照测得的浊度；A₂为处理结束后样品测得的浊度，本发明结果表明，用固定化菌丝球对造纸废水进行6～10 h的振荡处理，生物降解率可达96-99%。