CN111826292A

CN111826292A - 一种酵母菌ry-6及其应用

Info

Publication number: CN111826292A
Application number: CN202010657222.6A
Authority: CN
Inventors: 程辉彩; 习彦花; 张飞燕; 张丽萍; 刘洪伟; 何强
Original assignee: Institute of Biology of Hebei Academy of Sciences
Current assignee: Institute of Biology of Hebei Academy of Sciences
Priority date: 2020-07-09
Filing date: 2020-07-09
Publication date: 2020-10-27
Anticipated expiration: 2040-07-09
Also published as: CN111826292B

Abstract

本发明涉及一种既可高效聚磷，又具有良好除臭能力的酵母菌RY‑6（Rhodotorulakratochvilovae RY‑6），保藏编号为CGMCC No.20133，利用其同时进行聚磷和除臭，可应用于富营养化污染水体治理、堆肥及有机肥生产过程中。

Description

一种酵母菌RY-6及其应用

技术领域

本发明属于环境微生物技术领域，具体涉及一种酵母菌RY-6及其应用。

背景技术

近年来，由于工业化、农业现代化和城市化的快速发展，排放的营养物质随之增加，导致水体富营养化现象严重。水体富营养化是全球面临的水环境污染问题，同时也是水体保护最具挑战性的问题之一。

水体富营养化后会引起形成“绿色浮渣”，水下的藻类会因得不到阳光照射而呼吸水内氧气，不能进行光合作用。水内氧气会逐渐减少，水内生物也会因氧气不足而死亡。死去的藻类和生物又会在水内进行氧化作用，这时水体也会变得很臭，水资源也会被污染的不可再用。恶臭气体不仅对生态环境造成严重影响，而且对人体健康具有极大危害。

磷的过量排放被认为是造成水体富营养化问题的主要原因，因此对磷进行有效去除是亟待解决的问题，对净化水体具有重要的意义。

与化学除磷相比，生物除磷方法以投资成本低、无需投加化学药剂、污泥产量少、无二次污染等优势，成为目前应用最广泛的废水除磷方式。在生物除磷系统中，聚磷菌被认为起到了主要的作用。聚磷菌主要包括不动杆菌属、气单胞菌属、棒杆菌属、微丝菌等。

酵母菌是磷的地球化学循环过程中最重要的生物因子之一，作为一种极为宝贵的菌种资源，具有良好的耐渗透压、耐酸和代谢效率高等特点，体内具有良好的酶系，能适应各种特殊的环境。但因为酵母菌无论从数量或种类上在活性污泥占的比例都不如细菌多，在污水处理中应用酵母菌进行聚磷和除臭的研究长期以来被忽视。

发明内容

本发明的目的是提供一种既可高效聚磷，又具有良好除臭能力的酵母菌RY-6，利用其同时进行聚磷和除臭，可在富营养化污染水体治理、堆肥及有机肥生产过程中进行应用。

本发明采用如下技术方案：

一种酵母菌（Rhodotorula kratochvilovae）RY-6，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No. 20133，保藏日期为2020年6月23日。

该酵母菌RY-6具有聚磷能力。

该酵母菌RY-6具有除臭能力。

该酵母菌RY-6兼具聚磷能力和除臭能力。

一种酵母菌RY-6在去除水体中的磷中的应用。

一种酵母菌RY-6在堆肥或水体除臭中的应用。

一种酵母菌RY-6在处理黑臭富营养化水体中的应用。

酵母菌RY-6在用于处理黑臭富营养化水体时，接种量为黑臭富营养化水体体积的1～5 %（体积比），且酵母菌RY-6菌含量不低于10⁷个/mL。

本发明的有益效果在于：利用本发明的酵母菌RY-6，不仅可以提高有机废水除磷效率，有效减少恶臭污染，还可以为生物除磷、微生态除臭剂的开发提供优质的菌种资源，有着切实的经济、社会效益和广阔的应用前景。

附图说明

图1为本发明酵母菌RY-6的系统发育树。

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明做进一步的说明。本发明保护范围不限于实施例，本领域技术人员在权利要求限定的范围内做出任何改动也属于本发明保护的范围。

实施例1酵母菌RY-6分离和保藏

酵母菌RY-6是从河北省邯郸市临漳县试验田土壤样品中，通过富集培养、传代、蓝白斑初筛、异染颗粒染色复筛等分离获得。

具体方法是：于河北省邯郸市临漳县试验田采集深度为0~20cm的土壤样品，准确称取1 g加入100 mL富集培养基中，28 ℃ 180 r/min振荡培养2~3 d得到驯化菌液。连续传代5次稳定后，采用梯度稀释平板法获得不同形态单菌落，经多次划线纯化，转接到斜面于28 ℃条件下培养48 h，4℃冰箱保存备用。

采用蓝白斑筛选法对上述纯菌落进行聚磷菌的初筛。方法为：将在富集培养基平板上分离纯化得到的菌种点接到MOPS限磷、过磷平板中，28 ℃条件下培养2 d，观察蓝白斑生长情况。挑取在MOPS限磷、过磷平板上均显蓝色的菌落进行保存。

采用异染颗粒染色法对初筛得到的菌株进行复筛。异染颗粒采用Albert染色法染色，异染粒呈黑色，菌体其他部分呈绿色。

采用培养基：

富集培养基（/L）：乙酸钠5 g，牛肉膏3 g，蛋白胨 10 g，NaCl 5 g， KH₂PO₄ 0.02 g，pH7.0~7.2。

葡萄糖- MOPS培养基（10×）：MOPS 8.370 g，tricine 0.717 g，30 mL无菌水，10mol/LKOH调pH至7.4，定容到 44 mL；0.01 mol/L新鲜配置的FeSO₄ 1 mL；按下列顺序加溶液：NH₄Cl（1.9 mol/L）5 mL， K₂SO₄（0.276 mol/L）1 mL，CaCl₂·2H₂O（0.02 mol/L）0.025mL, MgCl₂·6H₂O（2.5 mol/L）0.21 mL，NaCl（5 mol/L）10 mL；微量元素混合液 0.02 mL，葡萄糖 0.1 g，微量thiamine 溶液1 mL，定容到 100 mL，用无菌滤器过滤后备用。

富磷培养基（/L）：乙酸钠0.5 g，牛肉膏 0.22 g， (NH₄) ₂SO₄ 0.2 g，K₂HPO₄0.0147 g，CaSO₄ 0.08 g，MgSO₄ 0.4 g，FeSO₄ 0.002 g，pH7.0~7.2。

该菌株RY-6，在富磷培养基上生长，菌落圆形、粉红色，2~3 mm，四周光滑，菌落边缘整齐，表面湿润、粘稠，易被挑起。菌体椭圆形，出芽生殖。

菌株RY-6的26S rDNA D1/D2序列测定：选取处于对数生长期的菌液，用天根公司酵母基因组DNA提取试剂盒提取菌株基因组DNA，以其为模板，进行PCR扩增。

扩增引物为：NL1（5'-GCA TAT CAA TAAGCG GAG GAA AAG-3'）和NL4（5'-GGT CCGTGT TTC AAG ACG G-3'）。

PCR反应程序：98℃预变性5 mim，循环95℃35 s，55℃35 s，72℃40 s，35个循环，延伸8 min。

由上海生工公司进行PCR产物测序，菌株RY-6的26S rDNA D1/D2序列如SEQ IDNo.1所示。测序完成之后用DNAMAN软件构建系统发育树（具体见图1）。根据菌株形态学和26S rDNA序列分析，菌株RY-6被鉴定为酵母菌（Rhodotorula kratochvilovae）RY-6。该酵母菌RY-6于2020年6月23日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心进行了保藏，保藏号为：CGMCC No. 20133。

实施例2 酵母菌RY-6不同初始磷浓度条件下生长及除磷特性

酵母菌RY-6活化后，将浓度统一调整为1×10⁹ CFU/mL，以体积比1%接种于初始磷质量浓度分别为2、5、8、10、15和20 mg/L的富磷液体培养基中，28℃180 r/min振荡培养48~72 h至菌液变浑浊。发酵液8000 r·min^-1离心10 min，取上清过0.22 μm滤膜测定培养前后培养液中磷质量浓度并计算各菌株的除磷率。

测定方法：

（1）菌浓测定：比浊法，采用分光光度计600 nm处吸光度值OD₆₀₀来表示菌体的细胞浓度。

（2）总磷：总磷采用GB 11893-1989《钼锑钪分光光度法测定》。

（3）除磷率：除磷率=（对照总磷量-上清总磷量）/对照总磷量×10。

试验结果具体见表1，随着初始磷浓度的提高，磷去除率呈下降趋势，但是，当初始磷浓度为2 mg/L时，磷去除率达95%以上，初始磷浓度为5 mg/L时，磷去除率达81.66%。

表1不同初始磷浓度对菌株RY-6生长及除磷效果的影晌

。

实施例3酵母菌RY-6除臭能力测定

取18 mL菌液于2 L大烧杯中，并加入500 mg/L的氨水2 mL；再往大烧杯中放入装有20mL0.005 N硫酸吸收液的50 mL小烧杯，盖上双层塑料薄膜密封。以等量的无菌水作为对照，重复3次，置于28 ℃培养箱中培养。24 h后，取出小烧杯检测氨的浓度。

氨的测定方法：纳氏试剂比色法。

氨去除率：氨去除率=（对照吸收液中氨浓度-处理吸收液中氨浓度）/对照吸收液中氨浓度×100%。结果发现，在24 h内，酵母菌RY-6的脱氨率达65%以上。

实施例4-6 酵母菌RY-6在人工合成废水中的除磷效果

菌株RY-6活化后，将浓度统一调整为1×10⁹CFU/mL，以体积比1~5%分别接种于废水合成培养基中，28 ℃ 180 r/min振荡培养48 h。取菌液适量，经8000 rpm离心10 min，过0.22μm滤膜，按总P测定法测定上清液的磷含量，并与未接菌的培养液的总值对照，计算P的去除率。

表2 人工合成废水配方

。

试验结果具体见表3。在含磷废水中，投加1%-5%的酵母菌RY-6，随着添加酵母菌量的增加，磷去除率呈增高趋势，但磷去除率均达80%以上。

表3酵母菌RY-6除磷效率测定

。

实施例7 酵母菌RY-6对黑臭富营养水体的模拟处理试验

菌种的扩大培养：菌株RY-6活化培养24 h后，取培养液离心，收集湿菌体，无菌水洗涤2次，制成菌浓为1×10⁹ CFU/mL的菌悬液。

室外大桶模拟处理试验：

取6个25 L的聚氯乙烯大桶，装入 20 L 试验水样，以不加菌为对照处理，每个处理三次平行。投加上述接种液后，接种量5%，动态监测水质指标变化情况（从水面下10 cm处取测试水样）。

表4 模拟富营养化黑臭水体水质指标处理前后比较

。

试验具体结果见表4，磷浓度由6.82mg/L降低至0.53 mg/L，去除率达92.23%，恶臭基本消除。

根据上述的实施例对本发明作了详细描述。需说明的是，以上的实施例仅仅为了举例说明发明而已。在不偏离本发明的精神和实质的前提下，本领域技术人员可以设计出本发明的多种替换方案和改进方案，其均应被理解为在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 河北省科学院生物研究所

<120> 一种酵母菌RY-6及其应用

<130> 2020

<160> 1

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 592

<212> DNA

<213> Rhodotorula kratochvilovae

<400> 1

cggaggaaaa gaaactaaca aggattcccc tagtagcggc gagcgaagcg ggaagagctc 60

aaatttataa tctggcacct tcggtgtccg agttgtaatc tctagaagtg ttttccgcgt 120

tggaccgcac acaagtctgt tggaatacag cggcacagtg gtgatacccc cgtacacggt 180

gcggacgccc agcgctttgt gatacacttt caatgagtcg agttgtttgg gaatgcagct 240

caaattgggt ggtaaattcc atctaaagct aaatattggc gagagaccga tagcgaacaa 300

gtaccgtgag ggaaagatga aaagcacttt ggaaagagag ttaacagtac gtgaaattgt 360

tggaagggaa acgcttgaag tcagacttgc ttgccggagc ttgcttcggt ttgcaggcca 420

gcatcagttt tccggggtgg ataatggtgg tttgaaggta gcagcctcgg ctgtgttata 480

gctttccact ggatacatcc tgggggactg aggaacgcag cgtgcttttt gcgaaggttt 540

cgaccttttc acgcttagga tgctggtgta atgactttaa acgacccgtc tt 592

Claims

1.一种酵母菌RY-6，其特征在于，保藏编号为CGMCC No. 20133。

2.根据权利要求1所述的一种酵母菌RY-6，其特征在于，其具有聚磷能力。

3.根据权利要求1所述的一种酵母菌RY-6，其特征在于，其具有除臭能力。

4.根据权利要求1所述的一种酵母菌RY-6，其特征在于，其兼具聚磷能力和除臭能力。

5.一种如权利要求1~4任一项所述的酵母菌RY-6在去除水体中的磷中的应用。

6.一种如权利要求1~4任一项所述的酵母菌RY-6在堆肥或水体除臭中的应用。

7.一种如权利要求1~4任一项所述的酵母菌RY-6在处理黑臭富营养化水体中的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，酵母菌RY-6的接种量为黑臭富营养化水体体积的1～5 %，且酵母菌RY-6菌含量不低于10⁷个/mL。