CN102033059A - 微藻油脂的检测方法 - Google Patents
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Abstract
微藻油脂的检测方法，它属于油脂检测领域。本发明解决了称重法所需样品大、耗费时间长的技术问题。本发明方法：一、将微藻培养液稀释，得到稀释液；二、测定稀释液染色后的荧光强度；三、将稀释液离心，取上清液测定染色后的荧光强度；四、取稀释液，测定未染色时的荧光强度；五、计算最大荧光强度差值，根据荧光强度-脂含量标准曲线，计算微藻油脂含量。本发明方法适用对小球藻、栅藻、螺旋藻、硅藻、甲藻、金藻、裸藻、轮藻等单细胞藻类进行检测，也可对细胞破碎预处理后的大型藻类进行检测。
Description
技术领域
本发明属于油脂检测领域。
背景技术
微藻能源是近年来兴起的一种新能源，其中利用微藻油脂生产生物柴油更是得到了人们的广泛关注。生物柴油具有“碳平衡”的特性，因此能够缓解全球温室效应，而且其污染物排放水平较石化柴油要低。近年来生物柴油的产量出现了大幅提高，然而生物柴油高昂的成本和不足的原料供应，阻碍了生物柴油的进一步推广应用。微藻油脂作为生物柴油的原料，已被提出并经过实验验证，不过受限于培养和收集等成本，还无法与石化能源等进行竞争。
降低微藻生物柴油成本的方法之一就是提高采收藻细胞的脂含量，从而降低后续油脂提取成本。由于藻细胞在不同的生长条件下或不同的生长阶段时，其细胞内的脂含量相差很大，为了优化藻细胞的培养条件，确定合理的采收时间，以得到具有最高脂含量的藻细胞，需要经常对藻细胞的脂含量进行检测。
称重法是最常用的微藻油脂测定方法，该方法一般是通过高速离心或过滤分离含微藻的溶液，得到微藻生物质后，将其冻干或烘干，然后再以有机溶剂将细胞所含的油脂提取出来，称重，并与微藻生物质的干重相除，以得到藻细胞的脂含量。该方法准确度高，但是所需样品量大，否则准确度会明显下降，并且整个测定过程所需时间较长，若采取烘干，则干藻粉的制备约需数小时，如果采取冻干，则干藻粉的制备需要数天，油脂的提取过程也需消耗数小时，测量成本也很高。因此目前迫切需要一种稳定可靠的微藻油脂快速检测方法。
发明内容
本发明要解决称重法所需样品大、耗费时间长的技术问题；而提供了微藻油脂的检测方法。
本发明微藻油脂的检测方法是按下述步骤进行的：一、将微藻培养液稀释至0.05g/L～0.5g/L，得到稀释液；二、取10mL步骤一的稀释液，然后加入100μL尼罗红溶液，避光下染色，选择400～600nm作为激发波长，测定在发射波长450～700nm之间的荧光强度，荧光强度记为X1；三、将步骤一稀释液在温度为4℃、转速为10000r/min的条件下离心10min，取上清液作为空白，取10mL上清液，然后加入100μL尼罗红溶液，避光下染色，选择400～600nm作为激发波长，测定在发射波长450～700nm之间的荧光强度，荧光强度记为X2；四、取步骤一的稀释液，选择400～600nm作为激发波长，测定在发射波长450～700nm之间的荧光强度，荧光强度记为X3；五、按公式X1-(X2+X3)计算出最大荧光强度差值，然后根据荧光强度-脂含量标准曲线计算微藻油脂含量；即完成了微藻油脂的检测。
本发明微藻油脂的检测方法还可以按下述步骤进行的：一、将微藻培养液预处理，然后稀释至0.05g/L～0.5g/L，得到稀释液；二、取10mL步骤一的稀释液，然后加入100μL尼罗红溶液，避光下染色，选择400～600nm作为激发波长，测定在发射波长450～700nm之间的荧光强度，荧光强度记为X1；三、将步骤一稀释液在温度为4℃、转速为10000r/min的条件下离心10min，取上清液作为空白，取10mL上清液，然后加入100μL尼罗红溶液，避光下染色，选择400～600nm作为激发波长，测定在发射波长450～700nm之间的荧光强度，荧光强度记为X2；四、取步骤一的稀释液，选择400～600nm作为激发波长，测定在发射波长450～700nm之间的荧光强度，荧光强度记为X3；五、按公式X1-(X2+X3)计算出最大荧光强度差值，然后根据荧光强度-脂含量标准曲线计算微藻油脂含量；即完成了微藻油脂的检测。
本发明利用尼罗红与脂类物质结合后能够发出荧光信号的特性，能够快速、敏感、可靠地检测藻类细胞内的脂含量。本发明减少了总消耗时间，降低了成本，所需样品少。本发明方法适用对小球藻、栅藻、螺旋藻、硅藻、甲藻、金藻、裸藻、轮藻等单细胞藻类进行检测，也可对细胞破碎预处理后的大型藻类进行检测。
附图说明
图1是具体实施方式二十五发射波长530nm～650nm之间的荧光强度，◇表示染色稀释液，□表示染色上清液；△表示稀释液；图2是具体实施方式二十五的荧光强度-脂含量标准曲线。
具体实施方式
具体实施方式一：本实施方式中微藻油脂的检测方法是按下述步骤进行的：一、将微藻培养液稀释至0.05g/L～0.5g/L，得到稀释液；二、取10mL步骤一的稀释液，然后加入100μL尼罗红溶液，避光下染色，选择400～600nm作为激发波长，测定在发射波长450～700nm之间的荧光强度，荧光强度记为X1；三、将步骤一稀释液在温度为4℃、转速为10000r/min的条件下离心10min，取上清液作为空白，取10mL上清液，然后加入100μL尼罗红溶液，避光下染色，选择400～600nm作为激发波长，测定在发射波长450～700nm之间的荧光强度，荧光强度记为X2；四、取步骤一的稀释液，选择400～600nm作为激发波长，测定在发射波长450～700nm之间的荧光强度，荧光强度记为X3；五、按公式X1-(X2+X3)计算出最大荧光强度差值，然后根据荧光强度-脂含量标准曲线计算微藻油脂含量；即完成了微藻油脂的检测。
具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一不同的是：步骤一中稀释含微藻的溶液用的溶剂为蒸馏水、自来水、去离子水、超净水或矿泉水。其它步骤和参数与具体实施方式一相同。
具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式一或二不同的是：步骤二所述尼罗红溶液的溶剂为丙酮、乙醇、丙醇、二氧六环、四氢呋喃或甲乙酮。其它步骤和参数与具体实施方式一或二相同。
具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式一至三之一不同的是：步骤二所述尼罗红溶液的浓度为0.001g/L～0.5g/L。其它步骤和参数与具体实施方式一至三之一相同。
具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式一至三之一不同的是：步骤二所述尼罗红溶液的浓度为0.01g/L～0.5g/L。其它步骤和参数与具体实施方式一至三之一相同。
具体实施方式六：本实施方式与具体实施方式一至三之一不同的是：步骤二所述尼罗红溶液的浓度为0.05g/L。其它步骤和参数与具体实施方式一至三之一相同。
具体实施方式七：本实施方式与具体实施方式一至六之一不同的是：步骤三所述尼罗红溶液的溶剂为丙酮、乙醇、丙醇、二氧六环、四氢呋喃或甲乙酮。其它步骤和参数与具体实施方式一至六之一相同。
具体实施方式八：本实施方式与具体实施方式一至七之一不同的是：步骤三所述尼罗红溶液的浓度为0.01g/L～0.5g/L。其它步骤和参数与具体实施方式一至七之一相同。
具体实施方式九：本实施方式与具体实施方式一至七之一不同的是：步骤三所述尼罗红溶液的浓度为0.01g/L～0.2g/L。其它步骤和参数与具体实施方式一至七之一相同。
具体实施方式十：本实施方式与具体实施方式一至七之一不同的是：步骤三所述尼罗红溶液的浓度为0.05g/L。其它步骤和参数与具体实施方式一至七之一相同。
具体实施方式十一：本实施方式与具体实施方式一至十一之一不同的是：步骤所述荧光强度-脂含量标准曲线测定方法如下：步骤a、从同一藻种的培养液中取处于不同生长阶段的培养液；步骤b、将所取的培养液在温度为4℃、转速为10000r/min的条件下离心10min，并用蒸馏水清洗3～5次后，取离心所得的微藻生物质，并在-70度条件下冻干获得干藻粉，取0.1g干藻粉，加入0.8mL蒸馏水，再加入1mL氯仿和2mL甲醇，振荡2min后，超声破碎1min，再加入1ml氯仿振荡1min，再加入1ml蒸馏水，再振荡1min，然后在4000r/min条件下离心5min，离心后，取氯仿相转移到另一试管，再向原管中加入2mL氯仿提取，重复三次，将得到的氯仿相氮吹干到质量恒定，称重计算得到微藻脂含量；步骤c、将所取的培养液稀释至0.05g/L～0.5g/L，得到稀释液，取10mL稀释液，然后加入100μL尼罗红溶液，避光下染色，选择400～600nm作为激发波长，测定在发射波长450～700nm之间的荧光强度，荧光强度记为X1，将步骤一稀释液在温度为4℃、转速为10000r/min的条件下离心10min，取上清液作为空白，取10mL上清液，然后加入100μL尼罗红溶液，避光下染色，选择400～600nm作为激发波长，测定在发射波长450～700nm之间的荧光强度，荧光强度记为X2，取稀释液，选择500nm作为激发波长，测定在发射波长450～700nm之间的荧光强度，荧光强度记为X3，按公式X1-(X2+X3)计算出最大荧光强度差值；步骤d、以步骤b所测得的微藻脂含量为坐标，以步骤c尼罗红染色的最大荧光强度差值为横坐标，绘制荧光强度-脂含量标准曲线。
具体实施方式十二：本实施方式中微藻油脂的检测方法是按下述步骤进行的：一、将微藻培养液预处理，然后稀释至0.05g/L～0.5g/L，得到稀释液；二、取10mL步骤一的稀释液，然后加入100μL尼罗红溶液，避光下染色，选择400～600nm作为激发波长，测定在发射波长450～700nm之间的荧光强度，荧光强度记为X1；三、将步骤一稀释液在温度为4℃、转速为10000r/min的条件下离心10min，取上清液作为空白，取10mL上清液，然后加入100μL尼罗红溶液，避光下染色，选择400～600nm作为激发波长，测定在发射波长450～700nm之间的荧光强度，荧光强度记为X2；四、取步骤一的稀释液，选择500nm作为激发波长，测定在发射波长450～700nm之间的荧光强度，荧光强度记为X3；五、按公式X1-(X2+X3)计算出最大荧光强度差值，然后根据荧光强度-脂含量标准曲线计算微藻油脂含量；即完成了微藻油脂的检测。
具体实施方式十三：本实施方式与具体实施方式十二不同的是：所述微藻培养液的预处理采用蒸馏水清洗预处理、二甲基亚砜预处理、超声预处理、冻融预处理、高温预处理或酸热预处理进行的。其它步骤和参数与具体实施方式十二相同。
具体实施方式十四：本实施方式与具体实施方式十三不同的是：蒸馏水清洗预处理是按下述步骤进行的：将微藻培养液离心，弃去上清液后，加入同等体积的蒸馏水(与弃去上清液的体积相等)，混匀后，再次离心，重复三次后，加入同等体积的蒸馏水后混匀。其它步骤和参数与具体实施方式十三相同。
具体实施方式十五：本实施方式与具体实施方式十三不同的是：二甲基亚砜预处理是按下述步骤进行的：取50mL微藻培养液，加入5mL二甲基亚砜溶液，振荡10min后，离心，加入50mL蒸馏水使其重新悬浮。其它步骤和参数与具体实施方式十三相同。
具体实施方式十六：本实施方式与具体实施方式十三不同的是是按下述步骤进行的：：超声预处理：微藻培养液用超声破碎10min。其它步骤和参数与具体实施方式十三相同。
具体实施方式十七：本实施方式与具体实施方式十三不同的是是按下述步骤进行的：：冻融预处理：将微藻培养液在-20℃冰冻后在煮沸5min，反复上述操作3次。
具体实施方式十八：本实施方式与具体实施方式十三不同的是：高温预处理是按下述步骤进行的：将微藻培养液在121℃条件下加热20min。其它步骤和参数与具体实施方式十三相同。
具体实施方式十九：本实施方式与具体实施方式十三不同的是：酸热预处理：取50mL小球藻培养液，高速离心后，向浓缩的培养液中加入10mL，4mol/L HCl，浸泡1h，离心后，加入50mL蒸馏水，煮沸5min。其它步骤和参数与具体实施方式十三相同。
具体实施方式二十：本实施方式与具体实施方式十二至十九之一不同的是所述尼罗红溶液的溶剂为丙酮、乙醇、丙醇、二氧六环、四氢呋喃或甲乙酮。其它步骤和参数与具体实施方式十二至十九之一相同。
具体实施方式二十一：本实施方式与具体实施方式十二至二十之一不同的是：所述尼罗红溶液的浓度为0.001g/L～0.5g/L。其它步骤和参数与具体实施方式十二至二十之一相同。
具体实施方式二十二：本实施方式与具体实施方式十二至二十之一不同的是：所述尼罗红溶液的浓度为0.01g/L～0.2g/L。其它步骤和参数与具体实施方式十二至二十之一相同。
具体实施方式二十三：本实施方式与具体实施十二至二十之一不同的是：所述尼罗红溶液的浓度为0.05g/L。其它步骤和参数与具体实施方式十二至二十之一相同。
具体实施方式二十四：本实施方式与具体实施方式十二至二十三之一不同的是：步骤五所述荧光强度-脂含量标准曲线测定方法如下：步骤a、从同一藻种的培养液中取处于不同生长阶段的培养液；步骤b、将所取的培养液在温度为4℃、转速为10000r/min的条件下离心10min，并用蒸馏水清洗3～5次后，取离心所得的微藻生物质，并在-70度条件下冻干获得干藻粉，取0.1g干藻粉，加入0.8mL蒸馏水，再加入1mL氯仿和2mL甲醇，振荡2min后，超声破碎1min，再加入1ml氯仿振荡1min，再加入1ml蒸馏水，再振荡1min，然后在4000r/min条件下离心5min，离心后，取氯仿相转移到另一试管，再向原管中加入2mL氯仿提取，重复三次。将得到的氯仿相氮吹干到质量恒定，称重计算得到微藻脂含量；步骤c、将所取的培养液稀释至0.05g/L～0.5g/L，得到稀释液，取10mL稀释液，然后加入100μL尼罗红溶液，避光下染色，选择400～600nm作为激发波长，测定在发射波长450～700nm之间的荧光强度，荧光强度记为X1，将步骤一稀释液在温度为4℃、转速为10000r/min的条件下离心10min，取上清液作为空白，取10mL上清液，然后加入100μL尼罗红溶液，避光下染色，选择400～600nm作为激发波长，测定在发射波长450～700nm之间的荧光强度，荧光强度记为X2，取稀释液，选择400～600nm作为激发波长，测定在发射波长450～700nm之间的荧光强度，荧光强度记为X3，按X1-(X2+X3)公式计算出最大荧光强度差值；步骤d、以步骤b所测得的微藻脂含量为坐标，以步骤c尼罗红染色的最大荧光强度差值为横坐标，绘制荧光强度-脂含量标准曲线。其它步骤和参数与具体实施方式十二至二十之一相同。
具体实施方式二十五：本实施方式中对小球藻(Chlorella vulgaris)中的油脂进行检测，具体方法的是按下述步骤进行的：
一、将含小球藻(Chlorella vulgaris)的溶液稀释至0.1g/L，得到稀释液；二、取10mL步骤一的稀释液，然后加入100μL浓度为0.05g/L的尼罗红溶液，避光，快速混匀10s，静置15min后，选择500nm作为激发波长，测定在发射波长530～650nm之间的荧光强度；三、将步骤一稀释后的含微藻的溶液在温度为4℃、转速为10000r/min的条件下离心10min，取上清液作为空白，然后用尼罗红染色，然后选择500nm作为激发波长，测定在发射波长530～650nm之间的荧光强度值；四、取步骤一的稀释液，选择500nm作为激发波长，测定在发射波长530nm～650nm之间的荧光强度(见图1)；五、计算尼罗红染色后的稀释液与染色后的上清液和未染色稀释液在发射波长530～650nm之间的最大荧光强度差值(56.5)，将上述最大荧光强度差值根据荧光强度-脂含量标准曲线(Y＝0.0927*X-0.5144，R2＝0.9964，Y-溶液脂含量，mg/L，X-荧光强度差值)，计算微藻油脂含量(4.7％)。
本实施方式中的标准曲线的测定：步骤a、从Chlorella vulgaris的纯培养物中取处于不同生长阶段的培养液；步骤b、将所取的培养液在温度为4℃、转速为10000r/min的条件下离心10min，并用蒸馏水清洗3～5次后，取离心所得的微藻生物质，并在-70度条件下冻干为干藻粉。取0.1g冻干藻粉，加入0.8mL蒸馏水，再加入1mL氯仿和2mL甲醇，振荡2min后，超声破碎1min，再加入1ml氯仿振荡1min，再加入1ml蒸馏水，再振荡1min，4000rpm离心5min，离心后，取氯仿相转移到另一试管，再向原管中加入2mL氯仿提取，重复三次。将得到的氯仿相氮吹干到质量恒定，称重计算得到微藻脂含量。步骤以c将所取的培养液稀释至0.05g/L～0.5g/L，得到稀释液，取10mL稀释液，然后加入100μL尼罗红溶液，避光下染色，选择500nm作为激发波长，测定在发射波长530～650nm之间的荧光强度，荧光强度记为X1，将步骤一稀释液在温度为4℃、转速为10000r/min的条件下离心10min，取上清液作为空白，取10mL上清液，然后加入100μL尼罗红溶液，避光下染色，选择500nm作为激发波长，测定在发射波长530～650nm之间的荧光强度，荧光强度记为X2，取稀释液，选择500nm作为激发波长，测定在发射波长530nm～650nm之间的荧光强度，荧光强度记为X3，按X1-(X2+X3)公式计算出最大荧光强度差值；步骤d、以步骤b所测得的微藻脂含量为坐标，以步骤c尼罗红染色的最大荧光强度差值为横坐标，绘制荧光强度-脂含量标准曲线(图2)
以丙酮作为溶剂，配制尼罗红染色液。通过对预处理方法、尼罗红浓度、染色时间等条件的优化，建立了微藻油脂含量的快速检测方法。与直接染色、冻融、高温等预处理方法相比，超声预处理进行染色培养液的荧光强度最大，灵敏度最高；当尼罗红浓度在0.05g/L～1.0g/L时，随着尼罗红浓度的增加，培养液的荧光强度有所下降，实验结果显示0.05g/L的尼罗红溶液效果最好。染色时间和光照的实验结果表明，在避光、染色时间15min时，培养液的荧光强度最大，灵敏度最高。该方法适于小球藻脂含量的快速检测，应用该方法测定藻细胞脂含量，可在1h内完成，并且所需样品量不超过40mL，可以直接用于藻类培养液脂含量的测定，与称重法、核磁共振法相比，由于省略了干燥步骤，因此减少了总消耗时间，降低了成本。而且尼罗红法所需样品量少，因此还适用于科研或小批量微藻油脂生产时的测定。尽管尼罗红法的脂含量测定范围与相对偏差与称重法和核磁共振法相比较差，但是已经可以满足生产过程中的需要。三种方法的具体性能比较见表1。
表1.不同油脂测定方法比较表
具体实施方式二十六：本实施方式中微藻油脂的检测方法是按下述步骤进行的：将含小球藻的培养液离心，取出上清液后，加入同等体积的蒸馏水(与弃去上清液的体积相等)，混匀后，再次离心，重复三次后，加入同等体积的蒸馏水后混匀，然后用尼罗红溶液在避光条件下染色，然后选择500nm作为激发波长，测定在发射波长530～650nm之间的荧光强度值，将最大荧光强度差值根据荧光强度-脂含量标准曲线(Y＝0.0927*X-0.5144，R2＝0.9964，Y-溶液脂含量，mg/L，X-荧光强度差值)，计算微藻油脂含量。
本实施方式方法测定时间为20min，总耗时1h，样品用量为0.002g，成本10元，脂含量范围：3％～100％，相对偏差±8％。
具体实施方式二十七：本实施方式中微藻油脂的检测方法是按下述步骤进行的：取50mL微藻培养液，加入5mL二甲基亚砜溶液，振荡10min后，离心，加入50mL蒸馏水使其重新悬浮；然后用尼罗红溶液在避光条件下染色，然后选择500nm作为激发波长，测定在发射波长530～650nm之间的荧光强度值，将最大荧光强度差值根据荧光强度-脂含量标准曲线(Y＝0.0927*X-0.5144，R2＝0.9964，Y-溶液脂含量，mg/L，X-荧光强度差值)，计算微藻油脂含量。
本实施方式方法测定时间为20min，总耗时1h，样品用量为0.005g，成本15元，脂含量范围：3％～100％，相对偏差±6％。
具体实施方式二十八：本实施方式中微藻油脂的检测方法是按下述步骤进行的：微藻培养液在冰水浴条件下超声破碎10min，然后用尼罗红溶液在避光条件下染色，然后选择500nm作为激发波长，测定在发射波长530～650nm之间的荧光强度值，将最大荧光强度差值根据荧光强度-脂含量标准曲线(Y＝0.0927*X-0.5144，R2＝0.9964，Y-溶液脂含量，mg/L，X-荧光强度差值)，计算微藻油脂含量。
本实施方式方法测定时间为20min，总耗时1h，样品用量为0.005g，成本20元，脂含量范围：1％～100％，相对偏差±5％。
具体实施方式二十九：本实施方式中微藻油脂的检测方法是按下述步骤进行的：将含微藻的溶液在-20℃冰冻后在煮沸5min，反复上述操作3次，然后用尼罗红溶液在避光条件下染色，然后选择500nm作为激发波长，测定在发射波长530～650nm之间的荧光强度值，将最大荧光强度差值根据荧光强度-脂含量标准曲线(Y＝0.0927*X-0.5144，R2＝0.9964，Y-溶液脂含量，mg/L，X-荧光强度差值)，计算微藻油脂含量。
本实施方式方法测定时间为20min，总耗时5.5h，样品用量为0.001g，成本50元，脂含量范围：1％～100％，相对偏差±5％。
具体实施方式三十：本实施方式中微藻油脂的检测方法是按下述步骤进行的：将微藻培养液在121℃条件下加热20min，；然后用尼罗红溶液在避光条件下染色，然后选择500nm作为激发波长，测定在发射波长530～650nm之间的荧光强度值，将最大荧光强度差值根据荧光强度-脂含量标准曲线(Y＝0.0927*X-0.5144，R2＝0.9964，Y-溶液脂含量，mg/L，X-荧光强度差值)，计算微藻油脂含量。
本实施方式方法测定时间为20min，总耗时3h，样品用量为0.002g，成本20元，脂含量范围：3％～100％，相对偏差±6％。
具体实施方式三十一：本实施方式中微藻油脂的检测方法是按下述步骤进行的：取50mL小球藻培养液，离心后，向浓缩的培养液中加入10mL，4mol/L HCl，浸泡1h，离心后，加入50mL蒸馏水，煮沸5min；然后用尼罗红溶液在避光条件下染色，然后选择500nm作为激发波长，测定在发射波长530～650nm之间的荧光强度值，将最大荧光强度差值根据荧光强度-脂含量标准曲线(Y＝0.0927*X-0.5144，R2＝0.9964，Y-溶液脂含量，mg/L，X-荧光强度差值)，计算微藻油脂含量。
本实施方式方法测定时间为20min，总耗时3h，样品用量为0.005g，成本30元，脂含量范围：1％～100％，相对偏差±8％。
具体实施方式三十二：本实施方式中微藻油脂的检测方法是按下述步骤进行的：将微藻培养液在121℃条件下加热20min，；然后用尼罗红溶液在避光条件下染色，然后选择500nm作为激发波长，测定在发射波长530～650nm之间的荧光强度值，将最大荧光强度差值根据荧光强度-脂含量标准曲线(Y＝0.0927*X-0.5144，R2＝0.9964，Y-溶液脂含量，mg/L，X-荧光强度差值)，计算微藻油脂含量。
本实施方式方法测定时间为20min，总耗时3h，样品用量为0.002g，成本20元，脂含量范围：3％～100％，相对偏差±6％。
Claims (10)
1.微藻油脂的检测方法，其特征在于微藻油脂的检测方法是按下述步骤进行的：一、将微藻培养液稀释至0.05g/L～0.5g/L，得到稀释液；二、取10mL步骤一的稀释液，然后加入100μL尼罗红溶液，避光下染色，选择400～600nm作为激发波长，测定在发射波长450～700nm之间的荧光强度，荧光强度记为X1；三、将步骤一稀释液在温度为4℃、转速为10000r/min的条件下离心10min，取上清液作为空白，取10mL上清液，然后加入100μL尼罗红溶液，避光下染色，选择400～600nm作为激发波长，测定在发射波长450～700nm之间的荧光强度，荧光强度记为X2；四、取步骤一的稀释液，选择400～600nm作为激发波长，测定在发射波长450～700nm之间的荧光强度，荧光强度记为X3；五、按X1-(X2+X3)公式计算出最大荧光强度差值，然后根据荧光强度-脂含量标准曲线计算微藻油脂含量；即完成了微藻油脂的检测。
2.根据权利要求1所述的微藻油脂的检测方法，其特征在于步骤一中稀释微藻培养液用的溶剂为蒸馏水、自来水、去离子水、超净水或矿泉水。
3.根据权利要求2所述的微藻油脂的检测方法，其特征在于步骤二所述尼罗红溶液的溶剂为丙酮、乙醇、丙醇、二氧六环、四氢呋喃或甲乙酮。
4.根据权利要求3所述的微藻油脂的检测方法，其特征在于步骤二所述尼罗红溶液的浓度为0.01g/L～0.5g/L。
5.根据权利要求3所述的微藻油脂的检测方法，其特征在于步骤二所述尼罗红溶液的浓度为0.05g/L。
6.根据权利要求1-5中任一项权利要求所述的微藻油脂的检测方法，其特征在于步骤五所述荧光强度-脂含量标准曲线测定方法如下：步骤a、从同一藻种的培养液中取处于不同生长阶段的培养液；步骤b、将所取的培养液在温度为4℃、转速为10000r/min的条件下离心10min，并用蒸馏水清洗3～5次后，取离心所得的微藻生物质，并在-70度条件下冻干获得干藻粉，取0.1g干藻粉，加入0.8mL蒸馏水，再加入1mL氯仿和2mL甲醇，振荡2min后，超声破碎1min，再加入1ml氯仿振荡1min，再加入1ml蒸馏水，再振荡1min，然后在4000r/min条件下离心5min，离心后，取氯仿相转移到另一试管，再向原管中加入2mL氯仿提取，重复三次，将得到的氯仿相氮吹干到质量恒定，称重计算得到微藻脂含量；步骤c、将所取的培养液稀释至0.05g/L～0.5g/L，得到稀释液，取10mL稀释液，然后加入100μL尼罗红溶液，避光下染色，选择400～600nm作为激发波长，测定在发射波长450～700nm之间的荧光强度，荧光强度记为X1，将步骤一稀释液在温度为4℃、转速为10000r/min的条件下离心10min，取上清液作为空白，取10mL上清液，然后加入100μL尼罗红溶液，避光下染色，选择400～600nm作为激发波长，测定在发射波长450～700nm之间的荧光强度，荧光强度记为X2，取稀释液，选择400～600nm作为激发波长，测定在发射波长450～700nm之间的荧光强度，荧光强度记为X3，按X1-(X2+X3)公式计算出最大荧光强度差值；步骤d、以步骤b所测得的微藻脂含量为坐标，以步骤c尼罗红染色的最大荧光强度差值为横坐标，绘制荧光强度-脂含量标准曲线。
7.微藻油脂的检测方法，其特征在于微藻油脂的检测方法是按下述步骤进行的：微藻油脂的检测方法是按下述步骤进行的：一、将微藻培养液预处理，然后稀释至0.05g/L～0.5g/L，得到稀释液；二、取10mL步骤一的稀释液，然后加入100μL尼罗红溶液，避光下染色，选择400～600nm作为激发波长，测定在发射波长450～700nm之间的荧光强度，荧光强度记为X1；三、将步骤一稀释液在温度为4℃、转速为10000r/min的条件下离心10min，取上清液作为空白，取10mL上清液，然后加入100μL尼罗红溶液，避光下染色，选择400～600nm作为激发波长，测定在发射波长450～700nm之间的荧光强度，荧光强度记为X2；四、取步骤一的稀释液，选择400～600nm作为激发波长，测定在发射波长450～700nm之间的荧光强度，荧光强度记为X3；五、按X1-(X2+X3)公式计算出最大荧光强度差值，然后根据荧光强度-脂含量标准曲线计算微藻油脂含量；即完成了微藻油脂的检测。
8.根据权利要求7所述的微藻油脂的检测方法，其特征在于所述微藻培养液的预处理采用蒸馏水清洗预处理、二甲基亚砜预处理、超声预处理、冻融预处理、高温预处理或酸热预处理进行的。
9.根据权利要求7或8所述的微藻油脂的检测方法，其特征在于所述尼罗红溶液的浓度为0.01g/L～0.5g/L。
10.根据权利要求9中任一项权利要求所述的微藻油脂的检测方法，其特征在于步骤五所述荧光强度-脂含量标准曲线测定方法如下：步骤a、从同一藻种的培养液中取处于不同生长阶段的培养液；步骤b、将所取的培养液在温度为4℃、转速为10000r/min的条件下离心10min，并用蒸馏水清洗3～5次后，取离心所得的微藻生物质，并在-70度条件下冻干获得干藻粉，取0.1g干藻粉，加入0.8mL蒸馏水，再加入1mL氯仿和2mL甲醇，振荡2min后，超声破碎1min，再加入1ml氯仿振荡1min，再加入1ml蒸馏水，再振荡1min，然后在4000r/min条件下离心5min，离心后，取氯仿相转移到另一试管，再向原管中加入2mL氯仿提取，重复三次，将得到的氯仿相氮吹干到质量恒定，称重计算得到微藻脂含量；步骤c、将所取的培养液稀释至0.05g/L～0.5g/L，得到稀释液，取10mL稀释液，然后加入100μL尼罗红溶液，避光下染色，选择400～600nm作为激发波长，测定在发射波长450～700nm之间的荧光强度，荧光强度记为X1，将步骤一稀释液在温度为4℃、转速为10000r/min的条件下离心10min，取上清液作为空白，取10mL上清液，然后加入100μL尼罗红溶液，避光下染色，选择400～600nm作为激发波长，测定在发射波长450～700nm之间的荧光强度，荧光强度记为X2，取稀释液，选择400～600nm作为激发波长，测定在发射波长450～700nm之间的荧光强度，荧光强度记为X3，按X1-(X2+X3)公式计算出最大荧光强度差值；步骤d、以步骤b所测得的微藻脂含量为坐标，以步骤c尼罗红染色的最大荧光强度差值为横坐标，绘制荧光强度-脂含量标准曲线。
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