CN102288558B - 微量、快速测定微藻油脂含量的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种微量、快速测定微藻油脂含量的方法，其原理是微藻中的油脂同香兰素染色剂相互作用后生成具有颜色的物质，在波长为530nm条件下有最大吸收值，且油脂含量与吸光度成正比。该方法是将已知生物量浓度的微藻藻液与处理剂和染色剂反应后，测定其光吸收值，并根据标准曲线计算待测藻液中的油脂含量，从而完成微藻油脂的快速定量，具有快速、所需样品少、灵敏度高、易于实施及不需昂贵设备等优点。利用该方法可实现微藻样品油脂含量的快速检测、掌握微藻规模化培养油脂累积情况以及富油藻种的快速筛选。

Description

微量、快速测定微藻油脂含量的方法

技术领域

本发明涉及微藻生物能源领域，具体的说是一种微量、快速测定微藻中油脂含量的方法。该方法仅需微量微藻藻液即可快速完成所选藻种中油脂含量的测定，可避免冗长繁琐的油脂提取步骤，大大缩短油脂含量测定的时间；同时该方法操作简单，易于实现，无需昂贵的试剂及设备。利用该方法可快速完成富油微藻的筛选、含油微藻培养期间油脂含量的实时检测，从而为寻找、生产优质的生物柴油原料提供高效的途径。

背景技术

人类文明的进步很大程度上依赖于能源的发展，目前人类所使用的能源中以化石燃料为主，而文明经济的迅速增长导致人类对于能源的需求量迅速上升。当今世界能源危机加深，化石燃料的短缺及其带来的环境问题也日益凸显，因此寻找环境友好的可再生能源已成为世界各国所关注的问题。生物柴油作为一种可再生、环境友好型的新型能源已备受关注，其来源以微藻最受关注，原因在于微藻具有产油量高、生长速度快并且易于培养等优点，因此最适宜作为生物柴油的生产原料。基于此，微藻生物柴油已成为新能源领域中的研究热点，其发展对于减少化石燃料的使用及保证国家能源安全具有重要意义。

富油微藻的筛选、培养及其油脂含量的测定是获取高质量藻种的必经之路，在此过程中，往往需要针对较多的微藻样品进行频繁的油脂定量，而对于不同培养时期微藻油脂的跟踪测定也较为重要。传统的微藻油脂含量测定方法为有机溶剂提取法，即称取一定量干藻粉样品，使用醚类、正己烷或氯仿等有机溶剂进行回流提取，收集提取液待溶剂挥干后烘至恒重，根据最后所获得的油脂干重及藻粉质量计算油脂含量。该方法所需的样品多(一般为干藻粉2～5g)、有机溶剂消耗量大且操作步骤繁琐、所需时间冗长，易因外界因素干扰而产生误差，因此不利于系统操作。新兴的荧光分光光度法是使用荧光染料尼罗红配制成一定浓度的染液，并将该染液直接加入已知浓度的微藻藻液中，黑暗条件下孵育5～10min后测定其荧光强度(荧光条件：激发光波长480nm，发射光波长570～590nm)，再依据标准曲线公式及样品藻液染色的荧光强度计算油脂含量。该方法大大减少了样品消耗量与测定时间，简便易行，但昂贵的荧光染料及检测设备限制了该方法在生产中的应用，加之需要毒性较强的二甲基亚砜(DMSO)或丙酮作为染色液溶剂，不利于实际操作。因此，寻找样品消耗量低、操作快捷安全、成本低廉的油脂含量测定方法具有重要意义。

香兰素(vanillin)又称为香草醛、香茅醛，学名为3-甲氧基-4-羟基苯甲醛，分子式为C₈H₈O₃，分子量152.14。香兰素广泛用于化妆香精及饮料、食品的增香剂，同时也是抗癫痫、多动症药物。此外，香兰素在一定的条件下还可以同脂类起颜色反应，其原理为：香兰素的羟基与磷酸作用产生磷酸香酯，并且香兰素分子中的电子分配也发生改变，使醛基变成反应增强的醛基；而脂类中的不饱和成分与浓硫酸作用水解后生成碳鎓离子，碳鎓离子与磷酸香酯的羰基起反应，生成红色醌化物，混合物显示由黄色-粉红色-紫红色的变化情况，在波长为530nm处有最大吸收，其OD₅₃₀同脂类含量呈线性关系。因此根据生成物的颜色变化情况及其在530nm处的吸光度即可确定微藻样品中的脂类含量。该方法操作简单、所需微藻样品少、反应灵敏度高、成本低廉、几乎不受仪器使用的限制，可实现富油微藻的快速筛选及微藻培养过程中油脂含量的跟踪测定。

发明内容

本发明的目的在于提供一种微量、快捷、成本低廉的油脂测定方法。

为实现上述目的，本发明所采用的技术方法为：

1染色剂的配制

准确称取0.1～0.15g香兰素，溶于20ml蒸馏水中，之后以85％浓磷酸定容至100ml，即配制成染色剂。该染色剂需储存在棕色瓶中，室温下可放置1～2个月。

2标准曲线的绘制

取植物油脂或微藻油脂或三油精作为标准物，以氯仿为溶剂，配制成一定浓度的母液，备用。

按照一定的体积梯度分别取不同量植物油母液置于洁净的玻璃试管中，氮气流吹干溶剂后加入100μl的蒸馏水，之后加入1～2ml 98％浓硫酸，摇匀后沸水浴10～20min，水冷至室温。

徐徐加入3～5ml染色剂并轻轻震荡试管以确保其混匀，37℃水浴15～20min后，用分光光度计测定光吸收值OD₅₃₀。

3微藻藻液生物量浓度的测定

使用血球计数板计数法或分光光度法或干重定量法等常规方法测定微藻藻液样品的生物量浓度，分述如下：

1)血球板计数法：取少量藻液进行适当稀释，使用灭菌的滴管取稀释藻液滴入血球计数板中，于40倍物镜下进行计数，重复三次取其均值；

2)分光光度法：取少量藻液，离心，蒸馏水洗3次，使用蒸馏水悬浮藻体并混匀，于分光光度计中测定其吸光值，根据预先测定的标准曲线确定藻液浓度。

3)干重定量法：取20～50ml藻液，使用预先称重的滤膜过滤，之后将带有藻体的滤膜置于100℃烘箱中烘1h，冷却后称重，减去滤膜重量即为藻体干重。

4样品染色及测定

取已知生物量浓度的微藻藻液50-150μl置于洁净的玻璃试管，加入1～2ml 98％浓硫酸，摇匀后沸水浴10～20min，其余步骤同2)

5油脂含量的计算

根据标准曲线，将所测定的光吸收值OD₅₃₀的值代入标准曲线公式即可得出样品中油脂的质量，再依据微藻藻液的生物量浓度即可得出该样品中的油脂含量。

具体实施方式

以下实施例旨在说明本发明而非对本发明的进一步限定。

实施例1：富油微藻的筛选

第一步，准确称取0.1～0.15g香兰素，溶于20ml蒸馏水中，之后以85％浓磷酸定容至100ml，即配制成染色剂。该染色剂需储存在棕色瓶中，室温下可放置1～2个月。

第二步，标准曲线的拟定：准确称取100mg植物油脂或者微藻油脂或三油精，溶于100ml氯仿，配制成1mg/ml标准液。取10～100μl标准液置于洁净试管中，氮吹挥干氯仿后分别于试管中加入100μl蒸馏水，之后加入1～2ml浓硫酸，沸水浴10～20min，迅速水冷至室温后，加入香兰素染液并混匀，37℃下反应15～20min后，分别用分光光度计测定光吸收值OD₅₃₀，以标准物的浓度及其染色后光吸收值绘制标准曲线，得到标准曲线公式。

第三步，取已培养至稳定期后期的微藻藻液样品，并按照常规的显微计数法或分光光度法或干重法确定其生物量浓度。

第四步，取50～150μl上步已确定生物量浓度的微藻藻液置于洁净的玻璃试管中，加入浓硫酸1～2ml后混匀，并置于沸水浴中加热10～20min，取出水冷至室温。

第五步，向各试管中缓缓加入3～5ml香兰素染液，混匀后置于37℃水浴中15～20min，冷却至室温后，用分光光度计测定光吸收值OD₅₃₀。

第六步，根据所选微藻藻液的生物量浓度、藻液染色处理后所得的光吸收值OD₅₃₀，并结合标准曲线公式，计算待测微藻样品中的油脂含量，筛选其中油脂含量相对较高微藻藻种，及时保种，以备后续研究。

实施例2：快速监测微藻大规模培养过程中的油脂积累情况

微藻的大规模培养过程中，通常是以油脂累积情况及生物量的增长情况来确定其最佳采收期，据此，我们可利用该发明所述方法，掌握微藻在大规模培养过程中的油脂累积情况，及时确定采收时间。

第一步，在微藻大规模培养过程中，定时取培养池中的藻液样品进行生物量的测定，并采用本发明所述方法测定其油脂含量。

第二步，根据微藻在不同培养时期的生物量和油脂含量，计算微藻在大规模培养过程中油脂的积累情况，以此确定最佳采收时间。

Claims (1)

1.一种微量、快速、及时测定含油微藻培养期间微藻油脂含量的方法，其特征在于

包括如下步骤：

步骤1：富油微藻的筛选；

（1），准确称取0.1～0.15g香兰素，溶于20ml蒸馏水中，之后以85%浓磷酸定容至100ml，即配制成染色剂；该染色剂需储存在棕色瓶中，室温下可放置1～2个月；

（2），标准曲线的拟定：准确称取100mg植物油脂或者微藻油脂或三油精，溶于100ml氯仿，配制成1mg/ml标准液；取10～100μl标准液置于洁净试管中，氮吹挥干氯仿后分别于试管中加入100μl蒸馏水，之后加入1～2ml浓硫酸，沸水浴10～20min，迅速水冷至室温后，加入香兰素染液并混匀，37℃下反应15～20min后，分别用分光光度计测定光吸收值OD₅₃₀，以标准物的浓度及其染色后光吸收值绘制标准曲线，得到标准曲线公式；

（3），取已培养至稳定期后期的微藻藻液样品，并按照常规的显微计数法或分光光度法或干重法确定其生物量浓度；

（4），取50～150μl上步已确定生物量浓度的微藻藻液置于洁净的玻璃试管中，加入浓硫酸1～2ml后混匀，并置于沸水浴中加热10～20min，取出水冷至室温；

（5），向各试管中缓缓加入3～5ml香兰素染液，混匀后置于37℃水浴中15～20min，冷却至室温后，用分光光度计测定光吸收值OD₅₃₀；

（6），根据所选微藻藻液的生物量浓度、藻液染色处理后所得的光吸收值OD₅₃₀，并结合标准曲线公式，计算待测微藻样品中的油脂含量，筛选其中油脂含量相对较高微藻藻种，及时保种，以备后续研究；

步骤2：快速监测微藻大规模培养过程中的油脂积累情况；

1），在微藻大规模培养过程中，定时取培养池中的藻液样品进行生物量的测定，并采用步骤1中（1）-（6）方法测定其油脂含量；

2），根据微藻在不同培养时期的生物量和油脂含量，计算微藻在大规模培养过程中油脂的积累情况，以此确定最佳采收时间。