CN103063631B - 一种溶剂提取-荧光测定微藻油脂含量的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种溶剂提取-荧光测定微藻油脂含量的方法，该方法属于微藻粗油脂测定的技术领域。针对现有技术中的荧光测定法直接使用尼罗红荧光染色法染色不够彻底，以及超声或者二甲基亚砜（DMSO）处理-尼罗红染色测荧光的方法测定时藻体叶绿素荧光峰的干扰等缺点，提出本发明的溶剂提取-荧光测定微藻油脂含量的方法。该方法的具体实验步骤是：用微藻配制标准藻液制备标准曲线，提取微藻油脂，然后用荧光测定微藻油脂的含量。在样品的测定过程中，无蒸发有机物的操作步骤，对环境污染较小；所提供的方法具有快速、简便、高效、灵敏、测定结果不受藻样保存期影响的特点。
Description
技术领域
本发明属于微藻粗油脂测定的技术领域，特别涉及一种溶剂提取-荧光测定微藻油脂含量的方法。
背景技术
随着经济的发展，人类对能源的要求越来越高，微藻被认为是制备生物柴油燃料的理想原料。藻类具有光合效率高、零净碳值、易培养、生长周期短、油烃含量高等优点，且不与农争地，不与人争粮，不影响全球能源分配，其作为生物能源，已引起各国政府和学者的高度关注。微藻制备生物柴油的研究工艺包括产油微藻的筛选、微藻培养系统、微藻的收集分离、藻油的提取、微藻油脂制取生物柴油等过程。其中微藻油脂含量的测定是研究和开发高产油微藻的关键环节。
测定微藻藻油的方法有多种，目前对微藻总油脂测定的方法主要包括有机溶剂提取法、索氏提取法、尼罗红荧光染料测定法、苏丹黑B染色法、傅里叶变换红外光谱法、磷酸香草醛法、铜试剂法、核磁共振法、超临界CO2提取法、离子液体提取法等和湿法提取-GCMS测定法等。
有机溶剂提取法虽然使用较普遍、易操作、成本低，但所需样品量大、所得总脂含量较低，微藻量比较少的时候提取不到油脂或提取的油脂无法进行称量，蒸除有机溶剂的时候容易挥发，挥发的溶剂有毒易污染环境、操作耗时费力；索氏提取法测定微藻总脂含量较准确，不足之处同样是所需试剂和样品量大，溶剂有毒易挥发并且污染环境，而且提取时间较长；荧光染料测定法、傅里叶变换红外光谱法、磷酸香草醛法、铜试剂法、苏丹黑染色法以及核磁共振法所需样品量少、所用时间短，但仍存在不足。其中，荧光染料测定法不需要提取油脂且灵敏度高，但其易受染色不彻底、叶绿素荧光峰等各种因子的影响；傅里叶变换红外光谱法和核磁共振法对样品无损伤，无需或仅需很少的预处理，后者重复性好，但成本较高；磷酸香草醛测定法较稳定，但需要用到强酸如硫酸，操作比较危险；铜试剂法成本低，但对其报道极少；苏丹黑染色法操作简单，不需要对藻细胞破碎及化学抽提，但不适于非均匀样品的测定，同时受藻细胞生长代谢影响，不能存放，若藻样不能使用，则该方法测定失效，另外测定技术不够成熟，目前多用于医疗上面的脂肪染色；超临界CO2提取法和离子液体提取法提取效率高，所得总脂含量比较大，但测定成本较高。
目前最常用的测定方法是荧光测定法，荧光测定法直接使用尼罗红荧光染色法染色不够彻底，而超声或者二甲基亚砜（DMSO）处理-尼罗红染色测荧光的方法虽然可以克服染色不够彻底的问题，但是超声或DMSO处理-荧光法测定的是藻体，当藻体培养到一定时间后就需要及时测定，不能长期存放，若是实验失败，就需要重新养藻；而提取的藻油可以存放，若实验测定失败，还可以再次配置测定。再者，当藻液浓度大时，直接用藻体测荧光容易受叶绿素荧光峰的干扰，同时不同的藻样的叶绿素含量不同，受叶绿素荧光峰的影响更大。因此，选择一个快速、简便、高效、灵敏的测定方法具有重要意义。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种溶剂提取-荧光测定微藻油脂含量的方法。
本发明的目的通过下述技术方案实现：一种溶剂提取-荧光测定微藻油脂含量的方法，包括如下步骤：
（1）标准曲线的制作：取微藻，离心后取沉淀，用PBS缓冲液清洗干净，然后用PBS缓冲液稀释成藻液，作为标准藻液；取5份19.8mL标准藻液，分别加入200μL异丙醇、180μL异丙醇+20μL三油精、160μL异丙醇+40μL三油精、140μL异丙醇+60μL三油精、120μL异丙醇+80μL三油精，配制不同浓度的三油精溶液；分别往三油精溶液中依次加入二甲基亚砜和尼罗红染色20分钟，测定各三油精溶液的荧光强度，以吸光度为纵坐标、三油精溶液浓度为横坐标，绘制标准曲线，计算回归方程；二甲基亚砜的体积浓度为20%，尼罗红的浓度为0.3μg/mL；
（2）微藻油脂的提取：取干燥的微藻，加入2mol/L KOH-CH3OH溶液，65℃～85℃水浴加热8～15min，冷却至室温后加入2mol/L HCl-CH3OH溶液，65℃～85℃水浴加热8～15min，冷却至室温后加入正己烷，静置，分层，取正己烷层，得到待测溶液；每克微藻加入4～8mL2mol/L的KOH-CH3OH溶液，每克微藻加入8～16mL2mol/L的HCl-CH3OH溶液，每克微藻加入4～8mL正己烷；
（3）荧光测定微藻油脂的含量：将0.2mL步骤（2）制备的待测溶液加入19.8mL步骤（1）制备的标准藻液中，得到样品藻液；将0.2mL正己烷加入19.8mL步骤（1）制备的标准藻液中，得到空白样品；分别往样品藻液、空白样品中依次加入二甲基亚砜和尼罗红染色20分钟，分别测定样品藻液、空白样品的荧光强度，样品藻液的荧光强度减去空白样品的荧光强度，得到待测溶液的荧光强度，由回归方程计算待测溶液中微藻油脂的浓度，计算微藻油脂的含量；
步骤（1）中：
所述的微藻优选为生长至对数末期的新鲜微藻；
所述的PBS缓冲液优选采用以下方法进行配制：将磷酸二氢钾（KH2PO4）0.27g、磷酸氢二钠（Na2HPO4）1.42g、氯化钠（NaCl）8g和氯化钾（KCl）0.2g加800mL去离子水中，充分搅拌溶解后加入浓盐酸调pH至7.4，最后定容到1L，高温高压灭菌后室温保存，得到PBS缓冲液；
所述的离心的条件4000～5000r/min，优选为4000r/min，离心5～10min；
所述的藻液的吸光度为0.200～1.000，优选为0.500；
所述的荧光强度的测定条件为激发波波长488nm、发散光范围400～700nm、狭缝宽度为10nm和电压值400V；
所述的二甲基亚砜的体积浓度是指二甲基亚砜的体积与（二甲基亚砜+三油精溶液）总体积的百分比；
步骤（2）中：
所述的2mol/L KOH-CH3OH溶液为含有2mol/L KOH的甲醇溶液；
所述的2mol/L HCl-CH3OH溶液为含有2mol/L HCl的甲醇溶液；
所述的静置的时间优选为10min；
步骤（3）中：
所述的二甲基亚砜的体积浓度是指二甲基亚砜的体积与（二甲基亚砜+三油精溶液）总体积的百分比；
所述的荧光强度的测定条件为激发波波长488nm、发散光范围400～700nm、狭缝宽度为10nm和电压值400V；
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
（1）本发明通过碱法皂化、酸法甲酯化处理微藻后采用溶剂提取微藻油脂，其破壁比较彻底，运用该法预处理微藻可以使得油脂染色较充分，避免了直接使用荧光尼罗红染色不够彻底的问题，得到的微藻油脂含量更接近真实值。溶液提取-荧光光谱法测定的是提取后的藻油，若测定实验失败，还可以再次配制样品，进行测定。当藻液浓度大时，直接用藻油测荧光可以减小或避免叶绿素荧光峰的干扰。
（2）本发明在样品的测定过程中，无蒸发有机物的操作步骤，对环境污染较小；所提供的方法具有快速、简便、高效、灵敏、测定结果不受藻样保存期影响的特点。
（3）本发明中碱法皂化、酸法甲酯化预处理方法不仅可以提取干藻体油脂，而且可以直接提取湿藻，不受湿藻中水分的影响，省去了干燥步骤。提取溶液中含有甲醇，藻体破坏掉之后由相似相容原理油脂溶于甲醇中，再加入正己烷提取中性油脂。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1
（1）标准曲线的制作：取生长至对数末期的新鲜微藻50mL，4000r/min离心10min，取沉淀，用PBS缓冲液清洗干净，然后用50mLPBS缓冲液稀释成藻液，作为标准藻液（标准藻液的吸光度为0.470）；取5个30mL棕色试剂瓶，标号1到5号，各加入标准藻液19.8mL，然后分别加入200μL异丙醇、180μL异丙醇+20μL三油精、160μL异丙醇+40μL三油精、140μL异丙醇+60μL三油精、120μL异丙醇+80μL三油精，配制不同浓度的三油精溶液；分别往三油精溶液中依次加入5ml二甲基亚砜和0.8mL10μgmL尼罗红染色20分钟，测定各三油精溶液的荧光强度（激发波波长488nm，发散光范围400～700nm，狭缝宽度为10nm，电压值400V），以三油精浓度为纵坐标、荧光度为横坐标，绘制标准曲线，计算回归方程，得到的回归方程为Y＝3.6088X-25.1202（R2=0.9661）；二甲基亚砜的体积浓度为20%，尼罗红的浓度为0.3μg/mL；
（2）微藻油脂的提取：取干燥的微藻10g，加入2mol/L KOH-CH3OH溶液60ml，75℃水浴加热皂化10min，冷却至室温后加入2mol/L HCl-CH3OH溶液120ml，75℃水浴加热甲酯化10min，冷却至室温后加入正己烷60ml，静置10min，分层，取正己烷层，得到待测溶液；
（3）荧光测定微藻油脂的含量：将0.2mL步骤（2）制备的待测溶液加入19.8mL步骤（1）制备的标准藻液中，得到样品藻液；将0.2mL正己烷加入19.8mL步骤（1）制备的标准藻液中，得到空白样品；分别往样品藻液、空白样品中依次加入5ml二甲基亚砜和0.8mL10μg/mL尼罗红染色20分钟，分别测定样品藻液、空白样品的荧光强度（激发波波长488nm，发散光范围400～700nm，狭缝宽度均为10nm，电压值400V），样品藻液的荧光强度减去空白样品的荧光强度，得到待测溶液的荧光强度，由回归方程计算待测溶液中微藻油脂的浓度，计算微藻油脂的含量；样品藻液荧光强度是55.750、空白样品的荧光强度是7.725，样品藻液荧光强度扣除空白样品的荧光强度后，代入回归方程计算得到荧光测定前溶液浓度为0.1482g/L，乘以稀释倍数25.8/0.2得到待测溶液中微藻油脂的浓度是19.116g/L，10g微藻中油脂的含量是1.147g。
实施例2
（1）标准曲线的制作：取生长至对数末期的新鲜微藻50mL，4000r/min离心10min，取沉淀，用PBS缓冲液清洗干净，然后用40mLPBS缓冲液稀释成藻液，作为标准藻液（标准藻液的吸光度为0.636）；取5个30mL棕色试剂瓶，标号1到5号，各加入标准藻液19.8mL，然后分别加入200μL异丙醇、180μL异丙醇+20μL三油精、160μL异丙醇+40μL三油精、140μL异丙醇+60μL三油精、120μL异丙醇+80μL三油精，配制不同浓度的三油精溶液；分别往三油精溶液中依次加入5ml二甲基亚砜和0.8mL10μgmL尼罗红染色20分钟，测定各三油精溶液的荧光强度（激发波波长488nm，发散光范围400～700nm，狭缝宽度为10nm，电压值400V），以三油精浓度为纵坐标、荧光度为横坐标，绘制标准曲线，计算回归方程，得到的回归方程为Y＝3.8329X-27.5316（R2=0.928）；二甲基亚砜的体积浓度为20%，尼罗红的浓度为0.3μg/mL；
（2）微藻油脂的提取：取干燥的微藻10g，加入2mol/L KOH-CH3OH溶液40ml，80℃水浴加热皂化5min，冷却至室温后加入2mol/L HCl-CH3OH溶液80ml，80℃水浴加热甲酯化5min，冷却至室温后加入正己烷40ml，静置10min，分层，取正己烷层，得到待测溶液；
（3）荧光测定微藻油脂的含量：将0.2mL步骤（2）制备的待测溶液加入19.8mL步骤（1）制备的标准藻液中，得到样品藻液；将0.2mL正己烷加入19.8mL步骤（1）制备的标准藻液中，得到空白样品；分别往样品藻液、空白样品中依次加入5ml二甲基亚砜和0.8mL10μgmL尼罗红染色20分钟，分别测定样品藻液、空白样品的荧光强度（激发波波长488nm，发散光范围400～700nm，狭缝宽度均为10nm，电压值400V），样品藻液的荧光强度减去空白样品的荧光强度，得到待测溶液的荧光强度，由回归方程计算待测溶液中微藻油脂的浓度，计算微藻油脂的含量；样品藻液荧光强度是58.460、空白样品的荧光强度是7.908，样品藻液荧光强度扣除空白样品的荧光强度后，代入回归方程计算得到荧光测定前溶液浓度为0.1662g/L，乘以稀释倍数25.8/0.2得到待测溶液中微藻油脂的浓度是21.443g/L，计算得到10g微藻中油脂的含量是0.858g。
实施例3
（1）标准曲线的制作：取生长至对数末期的新鲜微藻50mL，4000r/min离心10min，取沉淀，用PBS缓冲液清洗干净，然后用50mL PBS缓冲液稀释成藻液，作为标准藻液（标准藻液的吸光度为0.470）；取5个30mL棕色试剂瓶，标号1到5号，各加入标准藻液19.8mL，然后分别加入200μL异丙醇、180μL异丙醇+20μL三油精、160μL异丙醇+40μL三油精、140μL异丙醇+60μL三油精、120μL异丙醇+80μL三油精，配制不同浓度的三油精溶液；分别往三油精溶液中依次加入5ml二甲基亚砜和0.8mL10μgmL尼罗红染色20分钟，测定各三油精溶液的荧光强度（激发波波长488nm，发散光范围400～700nm，狭缝宽度为10nm，电压值400V），以三油精浓度为纵坐标、荧光度为横坐标，绘制标准曲线，计算回归方程，得到的回归方程为Y＝3.6088X-25.1202（R2=0.9661）；二甲基亚砜的体积浓度为20%，尼罗红的浓度为0.3μg/mL；
（2）微藻油脂的提取：取干燥的微藻10g，加入2mol/L KOH-CH3OH溶液80ml，75℃水浴加热皂化10min，冷却至室温后加入2mol/L HCl-CH3OH溶液160ml，75℃水浴加热甲酯化10min，冷却至室温后加入正己烷80ml，静置10min，分层，取正己烷层，得到待测溶液；
（3）荧光测定微藻油脂的含量：将0.2mL步骤（2）制备的待测溶液加入19.8mL步骤（1）制备的标准藻液中，得到样品藻液；将0.2mL正己烷加入19.8mL步骤（1）制备的标准藻液中，得到空白样品；分别往样品藻液、空白样品中依次加入5ml二甲基亚砜和0.8mL10μgmL尼罗红染色20分钟，分别测定样品藻液、空白样品的荧光强度（激发波波长488nm，发散光范围400～700nm，狭缝宽度均为10nm，电压值400V），样品藻液的荧光强度减去空白样品的荧光强度，得到待测溶液的荧光强度，由回归方程计算待测溶液中微藻油脂的浓度，计算微藻油脂的含量；样品藻液荧光强度是30.512、空白样品的荧光强度是7.706，样品藻液荧光强度扣除空白样品的荧光强度后，代入回归方程计算得到荧光测定前溶液浓度为0.0572g/L，乘以稀释倍数25.8/0.2得到待测溶液中微藻油脂的浓度是7.377g/L，10g微藻中油脂的含量是0.590g。
实施例4
（1）标准曲线的制作：取生长至对数末期的新鲜微藻50mL，4000r/min离心10min，取沉淀，用PBS缓冲液清洗干净，然后用50mL PBS缓冲液稀释成藻液，作为标准藻液（标准藻液的吸光度为0.470）；取5个30mL棕色试剂瓶，标号1到5号，各加入标准藻液19.8mL，然后分别加入200μL异丙醇、180μL异丙醇+20μL三油精、160μL异丙醇+40μL三油精、140μL异丙醇+60μL三油精、120μL异丙醇+80μL三油精，配制不同浓度的三油精溶液；分别往三油精溶液中依次加入5ml二甲基亚砜和0.8mL10μgmL尼罗红染色20分钟，测定各三油精溶液的荧光强度（激发波波长488nm，发散光范围400～700nm，狭缝宽度为10nm，电压值400V），以三油精浓度为纵坐标、荧光度为横坐标，绘制标准曲线，计算回归方程，得到的回归方程为Y＝3.6088X-25.1202（R2=0.9661）；二甲基亚砜的体积浓度为20%，尼罗红的浓度为0.3μg/mL；
（2）微藻油脂的提取：取干燥的微藻10g，加入2mol/L KOH-CH3OH溶液60ml，75℃水浴加热皂化10min，冷却至室温后加入2mol/L HCl-CH3OH溶液120ml，75℃水浴加热甲酯化10min，冷却至室温后加入正己烷120ml，静置10min，分层，取正己烷层，得到待测溶液；
（3）荧光测定微藻油脂的含量：将0.2mL步骤（2）制备的待测溶液加入19.8mL步骤（1）制备的标准藻液中，得到样品藻液；将0.2mL正己烷加入19.8mL步骤（1）制备的标准藻液中，得到空白样品；分别往样品藻液、空白样品中依次加入5ml二甲基亚砜和0.8mL10μgmL尼罗红染色20分钟，分别测定样品藻液、空白样品的荧光强度（激发波波长488nm，发散光范围400～700nm，狭缝宽度均为10nm，电压值400V），样品藻液的荧光强度减去空白样品的荧光强度，得到待测溶液的荧光强度，由回归方程计算待测溶液中微藻油脂的浓度，计算微藻油脂的含量；样品藻液荧光强度是24.105、空白样品的荧光强度是7.716，样品藻液荧光强度扣除空白样品的荧光强度后，代入回归方程计算得到荧光测定前溶液浓度为0.0340g/L，乘以稀释倍数25.8/0.2得到待测溶液中微藻油脂的浓度是4.389g/L，10g微藻中油脂的含量是0.527g。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (9)
1.一种溶剂提取-荧光测定微藻油脂含量的方法，其特征在于包括如下步骤：
(1)标准曲线的制作：取微藻，离心后取沉淀，用PBS缓冲液清洗干净，然后用PBS缓冲液稀释成藻液，作为标准藻液；取5份19.8mL标准藻液，分别加入200μL异丙醇、180μL异丙醇+20μL三油精、160μL异丙醇+40μL三油精、140μL异丙醇+60μL三油精、120μL异丙醇+80μL三油精，配制不同浓度的三油精溶液；分别往三油精溶液中依次加入二甲基亚砜和尼罗红染色20分钟，测定各三油精溶液的荧光强度，以吸光度为纵坐标、三油精溶液浓度为横坐标，绘制标准曲线，计算回归方程；二甲基亚砜的体积浓度为20％，尼罗红的浓度为0.3μg/mL；
(2)微藻油脂的提取：取干燥的微藻，加入2mol/L KOH-CH3OH溶液，65℃～85℃水浴加热8～15min，冷却至室温后加入2mol/L HCl-CH3OH溶液，65℃～85℃水浴加热8～15min，冷却至室温后加入正己烷，静置，分层，取正己烷层，得到待测溶液；每克微藻加入4～8mL 2mol/L的KOH-CH3OH溶液，每克微藻加入8～16mL 2mol/L的HCl-CH3OH溶液，每克微藻加入4～8mL正己烷；
(3)荧光测定微藻油脂的含量：将0.2mL步骤(2)制备的待测溶液加入19.8mL步骤(1)制备的标准藻液中，得到样品藻液；将0.2mL正己烷加入19.8mL步骤(1)制备的标准藻液中，得到空白样品；分别往样品藻液、空白样品中依次加入二甲基亚砜和尼罗红染色20分钟，分别测定样品藻液、空白样品的荧光强度，样品藻液的荧光强度减去空白样品的荧光强度，得到待测溶液的荧光强度，由回归方程计算待测溶液中微藻油脂的浓度，计算微藻油脂的含量；
步骤(1)和(3)中所述的荧光强度的测定条件为激发波波长488nm、发散光范围400～700nm、狭缝宽度为10nm和电压值400V。
2.根据权利要求1所述的溶剂提取-荧光测定微藻油脂含量的方法，其特征在于：步骤(1)中所述的微藻为生长至对数末期的新鲜微藻。
3.根据权利要求1所述的溶剂提取-荧光测定微藻油脂含量的方法，其特征在于：步骤(1)中所述的PBS缓冲液采用以下方法进行配制：将磷酸二氢钾(KH2PO4)0.27g、磷酸氢二钠(Na2HPO4)1.42g、氯化钠(NaCl)8g和氯化钾(KCl)0.2g加800mL去离子水中，充分搅拌溶解后加入浓盐酸调pH至7.4，最后定容到1L，高温高压灭菌后室温保存，得到PBS缓冲液。
4.根据权利要求1所述的溶剂提取-荧光测定微藻油脂含量的方法，其特征在于：步骤(1)中所述的离心的条件4000～5000r/min，离心5～10min。
5.根据权利要求1所述的溶剂提取-荧光测定微藻油脂含量的方法，其特征在于：步骤(1)中所述的藻液的吸光度为0.200～1.000。
6.根据权利要求1所述的溶剂提取-荧光测定微藻油脂含量的方法，其特征在于：步骤(1)中所述的二甲基亚砜的体积浓度是指二甲基亚砜的体积与(二甲基亚砜+三油精溶液)总体积的百分比。
7.根据权利要求1所述的溶剂提取-荧光测定微藻油脂含量的方法，其特征在于：步骤(2)中所述的2mol/L KOH-CH3OH溶液为含有2mol/L KOH的甲醇溶液；所述的2mol/L HCl-CH3OH溶液为含有2mol/L HCl的甲醇溶液。
8.根据权利要求1所述的溶剂提取-荧光测定微藻油脂含量的方法，其特征在于：步骤(2)中所述的静置的时间为10min。
9.根据权利要求1所述的溶剂提取-荧光测定微藻油脂含量的方法，其特征在于：步骤(3)中所述的二甲基亚砜的体积浓度是指二甲基亚砜的体积与(二甲基亚砜+三油精溶液)总体积的百分比。
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