CN102297842B - 一种苏丹黑b用于快速检测微藻油脂含量的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种苏丹黑B用于快速检测微藻油脂含量的方法，属于微藻油脂含量的快速检测技术领域。采用染色效果好、成本低的苏丹黑B，通过建立适宜的染色程序和检测方法，达到能快速、方便检测微藻油脂含量的效果。具体实施过程为：用苏丹黑B染色微藻细胞，确定出染色后的微藻细胞最大光吸收波长，在此波长下微藻细胞油脂含量与吸光值呈线性关系。通过建立染色后吸光值和微藻细胞油脂含量的关系方程式，对于待检测的微藻样品，先测定染色后的微藻细胞在645nm波长的吸光值，然后通过相关方程式的计算，可以快速、准确检测出微藻样品的油脂含量。本发明的方法具有快速准确、简便易行、成本低的优点，是值得采用的检测微藻油脂含量的好方法。

Description

一种苏丹黑B用于快速检测微藻油脂含量的方法

技术领域

本发明涉及一种适宜检测微型藻类油脂含量的技术方法，具体是属于微藻油脂含量的快速检测技术领域。

背景技术

微藻是体积微小、结构简单、生长繁殖快的单细胞藻类，目前已知的微藻种类达10多万种，各种不同类型的微藻具有特定的生物学和生态学特性，它们能通过细胞内发生的各种生物化学反应和代谢途径，合成许多具有独特结构和特异功能的高价值细胞活性物，例如肽类物，蛋白质，脂肪酸，多糖，天然色素，维生素等，因此，微藻被广泛开发应用在食品、医药、化妆品，基因工程、生物质燃料，水产养殖，环境保护等行业领域，具有良好的开发应用前景。

自20世纪70年代爆发了石油危机后，人类开始寻找可再生能源。在化石燃料日益枯竭、环境污染逐渐威胁人类生存的今天，清洁的可再生能源的开发已成为各国研发的战略方向和重点。微藻具有生物量大、生长周期短、易培养、油脂含量高等优点。通过调控扩增培养微藻并采收生物量，提取微藻油脂成分，再进一步通过转酯化反应，可制备出具有良好燃性和环保特性的生物燃油，因此，微藻是产生可再生性绿色清洁能源的良好生物质材料。

微藻细胞个体小，通常细胞壁较厚实，提取油脂成分较困难，需要采用特殊有效的翠取方法才能达到翠取高的效果。传统上，生物样品的油脂提取方法采用的是索氏提取法、有机溶剂法、酸热法等。虽然这些方法简便易行，但分析测试耗时长，例如索氏提取法往往需数小时。由于微藻细胞个体小，通常细胞壁较厚实，提取油脂成分困难，通常需要采用其它形式的特殊处理方法，例如进行细胞破壁，加压加温等，操作过程往往需要十几小时才能翠取较完全。而且这些传统的油脂提取方法存在一个要害问题，即翠取过程中要耗用大量有毒害作用的有机溶剂，这不仅造成分析成本高，而且有机溶剂容易造成损害人体健康并产生环境污染等问题。超临界CO₂萃取法(SCF-CO₂)目前也有用于提取生物样品的油脂，但该法亦须用到有机溶剂，而且需要具备昂贵的仪器设备才能完成样品分析。

利用微藻制备生物燃油，首先应提取微藻的油脂成分，然后进一步采用相关的程序，制备出目标产物，因此，寻求操作快速简便、成本低、准确检测微藻油脂含量的技术方法，是开发利用微藻油脂成分的一个关键环节。苏丹黑B是一种高效价廉的染色剂，它能有效地与微藻细胞中的油脂成分结合并对某一波长的光具有吸收峯值，通过建立微藻细胞苏丹黑B染色后的吸光值与对应的油脂含量的关系，得出相应的线性回归方程，则可由测出的样品液吸光值，通过回归方程计算获知样品的油脂含量，因此，苏丹黑B非常适用于微藻油脂含量的分析检测。采用本发明提出的苏丹黑B染色法处理微藻样品，无需昂贵的仪器设备、快速简便(仅需数十分钟就可测定一个样品)，就可达到检测微藻样品的油脂含量。尤其是适用于较大量样品的微藻油脂含量检测分析，而且没有毒害作用和造成环境环境污染等问题。

发明内容

本发明所要解决的技术问题就是针对上面所述的背景技术，建立操作快速简便、成本低、能准确检测微藻油脂含量的技术方法。即采用高效价廉的染色剂苏丹黑B，对微藻细胞进行适宜的染色处理过程，并通过染色后微藻细胞的吸光值和微藻细胞油脂含量的关系方程式，建立适宜的染色程序和检测方法，达到能快速、方便检测微藻油脂含量的效果。迄今为止，尚无采用染色剂苏丹黑B快速分析检测微藻油脂含量的相关报道。

本发明采用的材料和方法：

微藻细胞在适宜的培养条件下培养，采收藻细胞，藻液离心浓缩，称取经离心底部沉淀的-定重量的藻湿重，重复用蒸馏水洗涤、离心数次后，配制成不同浓度的藻溶液，藻溶液中的藻细胞再经苏丹黑B染色和相关的后续处理过程，得到对645nm波长光有最大吸收峯的藻溶液。通过测定不同浓度藻溶液在645nm波长光的吸光值以及相应浓度藻溶液藻细胞的油脂含量值，建立染色后微藻细胞的吸光值和微藻细胞油脂含量的关系方程式，相应浓度的藻溶液微藻细胞的油脂含量是通过采用酸热萃取法获得。一旦建立了染色后微藻细胞的吸光值和微藻细胞油脂含量的关系方程式后，对于任一待检微藻样品，只要测定其经苏丹黑B染色后的645nm波长光的吸光值，代入关系方程式，就可方便地获知微藻样品的油脂含量。本发明解决上述技术问题所采用的技术方法具体为：

苏丹黑B染色液配制：称取0.3-0.5g苏丹黑B粉末，溶于100-200ml 70％乙醇，室温下放置4-6d，期间经常摇动，让其充分溶解后过滤，4℃保存备用。

微藻细胞去除盐分：微藻细胞在适宜的培养条件下培养，采收藻细胞，藻液离心浓缩，重复用蒸馏水洗涤、离心数次，以便去除微藻细胞的盐分。

建立染色后微藻细胞的吸光值和微藻细胞油脂含量的关系方程式：称取0.5-1.0g经脱盐分的湿藻样，加入50-100ml蒸馏水，充分混合均匀，然后稀释成5个藻浓度(1/2，1/3，1/4，1/5，1/10)。每个浓度分别取2支试管，各加入5-10mL藻液和5-10ml 1mol的HCl，充分混合后，一管加入0.4-0.8ml的苏丹黑B染色液，另一管加入0.4-0.8ml 70％乙醇(对照管)，充分混匀，沸水浴煮2-10min(不时摇动，使加热均匀)，冷却后8000-12,000rpm离心5-10min，取沉淀，50％乙醇洗涤2-4次后，用5-10ml 70％乙醇混匀微藻细胞，在645nm波长光测定其吸光值，通过测得的吸光值及所对应的微藻细胞油脂含量(毫克/克藻湿重)，获得染色后微藻细胞的吸光值和微藻细胞油脂含量的回归关系方程式。为获得回归关系方程式时，染色后微藻细胞的吸光值所对应的微藻细胞油脂含量的确定是通过采用酸热萃取法，即称取一定量的相应微藻细胞湿重，按每克湿藻体加入10-20mL 4mol盐酸的比例混和均匀，室温下静置处理20-30小时，然后沸水浴处理20-40min，冷却后加入等体积的氯仿、甲醇，混匀摇动、充分萃取，离心后取上层液，旋转蒸发器上挥发除去溶剂后得到微藻油脂，称取微藻油脂重量。

一旦建立了染色后微藻细胞的吸光值和微藻细胞油脂含量的回归关系方程式后，对于任一待检微藻样品，只要测定其经苏丹黑B染色后的645nm波长光的吸光值，代入关系方程式，就可方便地获知微藻样品的油脂含量。

采用本发明的技术方法得到的结果如下：

表一、微藻细胞染色后藻液吸光值A₆₄₅、微藻细胞油脂含量及相关回归分析结果

对所考察的7种微藻类，经采用苏丹黑B染色程序处理后，微藻细胞的吸光值和油脂含量回归分析结果均表明了很好的线性关系，相关系数r值介于0.9941-0.9999，表明两者呈显著的正相关性，而分析得到的判别系数R²值介于0.9883-0.9998，表明由两者相关性得到的回归方程具有高度的拟合优度。对所有的微藻数据合并处理分析，同样表明微藻细胞的吸光值和油脂含量两者呈显著的正相关性(相关系数r＝0.9939＞r_0.01，4(6)＝0.917)，由两者相关性得到的回归方程同样具有高度的拟合优度(判别系数R²＝0.9879)，因而通过测定微藻细胞染色后的吸光值，然后采用相关的线性回归方程式，可以准确计算出微藻细胞的油脂含量，表明采用本发明的技术方法检测微藻细胞的油脂含量是适宜的，整个程序步骤简单，方便快捷，所需藻样量少，检测成本低，没有毒害作用和造成环境环境污染等问题，并且不需要通过物理或化学方法破碎细胞壁以及进行常规繁琐的溶剂抽提过程，就可方便地知道各种微藻细胞的油脂含量的情况，这对于高脂含量的微藻筛选和取舍也具有重要意义。因此，采用苏丹黑B染色法可以达到快速分析检测微藻油脂含量效果，并且同样适用于较大量样品的微藻油脂含量检测分析，是一种行之有效的方法。

本发明的优点是：

无需昂贵的仪器设备、成本低、所需样品量少，简便快速达到检测微藻样品的油脂含量。尤其是适用于较大量样品的微藻油脂含量检测分析，而且没有毒害作用和造成环境环境污染等问题。

本发明的目的是：

为了寻求和建立适用于快速检测微藻样品油脂含量的技术方法，通过建立微藻细胞经苏丹黑B染色处理后的吸光值和微藻油脂含量的回归关系式，达到快速分析检测微藻样品油脂含量的效果。

进一步具体实施例证

通过采用苏丹黑B染色程序处理方法，已建立了具有显著意义的微藻细胞吸光值和油脂含量相关性的回归方程，为了验证所得到的回归方程的有效性，进一步实施下列微藻样品的分析检测，对照比较由回归方程式计算的微藻油脂含量和采用酸热萃取法得到的微藻油脂含量实际数值，考察两种数据结果的差异性。

对照实施例证1、称取一定量藻湿重的小球藻细胞，按前述的苏丹黑B染色处理程序，测得的经染色后的小球藻细胞吸光值为0.687，按相应的回归方程式计算得到的小球藻细胞油脂含量为40.05毫克/克藻湿重；按总的回归方程式计算得到的小球藻细胞油脂含量为40.46毫克/克藻湿重，与采用酸热萃取法得到的小球藻油脂含量实际数值为37.23毫克/克藻湿重相比较，绝对误差分别为2.82和3.23，相对误差分别为7.57％和8.68％.

对照实施例证2、称取一定量藻湿重的扁藻细胞，按前述的苏丹黑B染色处理程序，测得的经染色后的扁藻细胞吸光值为0.571，按相应的回归方程式计算得到的扁藻细胞油脂含量为35.47毫克/克藻湿重；按总的回归方程式计算得到的扁藻细胞油脂含量为33.67毫克/克藻湿重，与采用酸热萃取法得到的扁藻油脂含量实际数值为32.67毫克/克藻湿重相比较，绝对误差分别为2.80和1.00，相对误差分别为8.58％和3.05％.

对照实施例证3、称取一定量藻湿重的褐指藻细胞，按前述的苏丹黑B染色处理程序，测得的经染色后的褐指藻细胞吸光值为0.502，按相应的回归方程式计算得到的褐指藻细胞油脂含量为29.69毫克/克藻湿重；按总的回归方程式计算得到的褐指藻细胞油脂含量为29.62毫克/克藻湿重，与采用酸热萃取法得到的褐指藻油脂含量实际数值为28.75毫克/克藻湿重相比较，绝对误差分别为0.94和0.87，相对误差分别为3.26％和3.03％.

对照实施例证4、称取一定量藻湿重的等鞭金藻细胞，按前述的苏丹黑B染色处理程序，测得的经染色后的等鞭金藻细胞吸光值为0.411，按相应的回归方程式计算得到的等鞭金藻细胞油脂含量为23.52毫克/克藻湿重；按总的回归方程式计算得到的等鞭金藻细胞油脂含量为24.29毫克/克藻湿重，与采用酸热萃取法得到的等鞭金藻油脂含量实际数值为25.68毫克/克藻湿重相比较，绝对误差分别为2.16和1.39，相对误差分别为8.42％和5.42％.

对照实施例证5、称取一定量藻湿重的叉鞭金藻细胞，按前述的苏丹黑B染色处理程序，测得的经染色后的叉鞭金藻细胞吸光值为0.326，按相应的回归方程式计算得到的叉鞭金藻细胞油脂含量为19.01毫克/克藻湿重；按总的回归方程式计算得到的叉鞭金藻细胞油脂含量为19.31毫克/克藻湿重，与采用酸热萃取法得到的叉鞭金藻油脂含量实际数值为18.03毫克/克藻湿重相比较，绝对误差分别为0.98和1.28，相对误差分别为5.45％和7.09％.

对照实施例证6、称取一定量藻湿重的盐藻细胞，按前述的苏丹黑B染色处理程序，测得的经染色后的盐藻细胞吸光值为0.301，按相应的回归方程式计算得到的盐藻细胞油脂含量为19.43毫克/克藻湿重；按总的回归方程式计算得到的盐藻细胞油脂含量为17.84毫克/克藻湿重，与采用酸热萃取法得到的盐藻油脂含量实际数值为17.94毫克/克藻湿重相比较，绝对误差分别为1.49和0.10，相对误差分别为8.30％和0.54％.

对照实施例证7、称取一定量藻湿重的衣藻细胞，按前述的苏丹黑B染色处理程序，测得的经染色后的衣藻细胞吸光值为0.27，按相应的回归方程式计算得到的衣藻细胞油脂含量为17.32毫克/克藻湿重；按总的回归方程式计算得到的衣藻细胞油脂含量为16.03毫克/克藻湿重，与采用酸热萃取法得到的衣藻油脂含量实际数值为15.79毫克/克藻湿重相比较，绝对误差分别为1.53和0.24，相对误差分别为9.67％和1.50％.

进一步的具体实施验证结果表明，采用苏丹黑B染色处理程序后测定各种微藻细胞的吸光值，按相应的回归方程式或按总的回归方程式计算可得到微藻细胞油脂含量的估测值，估测值与采用酸热萃取法得到的微藻油脂含量实际数值都很接近，误差量小，相对误差值在常规可允许的10％范围内。因此，采用苏丹黑B染色处理，可以达到方便、准确检测微藻细胞油脂含量的效果，是适宜采用的检测微藻细胞油脂含量的好方法。

Claims (1)

1.一种苏丹黑B用于快速检测微藻油脂含量的方法，其包括以下步骤：

微藻细胞在适宜的培养条件下培养，采收藻细胞；

重复用蒸馏水洗涤、去除微藻细胞的盐分、离心数次后，藻液离心浓缩；

称取0.5-1.0g经脱盐分的湿藻样，加入50-100ml蒸馏水，充分混合均匀，然后稀释成1/2、1/3、1/4、1/5、1/10的5个不同藻浓度的藻溶液；

称取0.3克-0.5克苏丹黑B粉末，溶于100-200ml 70％乙醇中，室温下放置4-6天，期间经常摇动，让其充分溶解后过滤，保存备用；

上述每个藻浓度分别取2支试管，各加入5-10mL藻液和5-10ml 1mol/L的HCl，充分混合后，每个藻浓度一支管加入0.4-0.8ml的苏丹黑B染色液，另一支管加入0.4-0.8ml 70％乙醇，作为对照管，充分混匀，沸水浴煮，冷却后8000-12,000rpm离心5-10min，取沉淀，50％乙醇洗涤2-4次后，用5-10ml 70％乙醇混匀微藻细胞；

测定经苏丹黑B染色后的微藻细胞在波长为645nm的吸光值；

通过微藻细胞的吸光值与微藻细胞油脂含量的相关回归方程式，计算得出微藻样品的油脂含量。