CN103952310A

CN103952310A - 一种快速批量靶向化筛选生物柴油微藻的方法及系统

Info

Publication number: CN103952310A
Application number: CN201310753572.2A
Authority: CN
Inventors: 缪晓玲; 巩三强
Original assignee: Shanghai Jiaotong University
Current assignee: Shanghai Jiaotong University
Priority date: 2013-12-31
Filing date: 2013-12-31
Publication date: 2014-07-30

Abstract

本发明公开了一种快速批量靶向化筛选优势目标微藻的方法及系统：该方法系统包括从典型工业位点采集含有藻类的样品；样品的限制性富集培养；富集培养后藻株的固体平板稀释点布克隆；藻落克隆子细胞脂滴的原位染色；染色后待筛选藻株油脂含量的比较分析；优势藻株的平板转移。该发明实现了目标藻株快速、高效批量靶向化筛选，利用该发明获得的微藻具有高浓度二氧化碳固定耦合生物柴油原材料生产的应用潜力。

Description

一种快速批量靶向化筛选生物柴油微藻的方法及系统

技术领域

本发明涉及生物质能源技术领域，具体涉及一种快速批量靶向化筛选可用于转化工业烟道气二氧化碳为三酰基甘油酯的微藻藻株的方法及系统。

背景技术

能源危机以及化石燃料燃烧带来的温室效应日益严峻，直接影响一个国家国际形象，制约者一个国家经济的可持续发展。因此，在全球共同面对全球变暖、推进经济社会可持续发展的形势下，可再生清洁能源的开发及CO₂减排已成为世界各国政府关注的焦点。

在众多的可再生能源（风能、地热能、水能、太阳能、生物质能等）中，生物柴油以其在能量密度、燃烧性等方面与石化柴油具有极高相似性，甚至超过石化柴油，且具有易降解、基本不含硫及芳烃类化合物、碳中性对环境友好等特性，受到世界各国的广泛关注。一些发达国家于20世纪90年代初便开始了生物柴油的商业化生产。目前商业化生产的生物柴油主要是第一代和第二代生物柴油制备技术。第一代生物柴油制备技术主要是利用油料作物为原料制备生物柴油。第二代生物柴油制备技术主要是利用废弃油脂以及麻风树等为原料制备生物柴油。我国生物柴油产业兴起较晚，目前，我国生产生物柴油的原料主要是大豆、油菜等油料作物、油棕和麻风树等油料木果实及废餐饮油等。但是，这种以传统农业为基础的生物柴油生产方式，不仅产量低、成本高，而且不符合“不与农业争粮争地”的根本原则，另外不能满足生物柴油产业对原料持续增长的需求。研究发现许多藻类可以快速生长并在体内产生大量的油脂，被称为产油微藻。产油微藻即在一定条件下，将CO₂、碳水化合物、碳氢化合物和普通油脂等碳源转化为微藻细胞内大量贮存的油脂，且油脂含量超过生物总量20%的微型藻类。微藻因含油量高、易于培养、单位面积产量高、可以与废水废气的处理相互耦合等优点而被视为新一代的、甚至是唯一能实现完全替代石化柴油的生物柴油制备原料。

据不完全统计，目前，国内外从事微藻生物柴油研究及开发的主要机构超过100家，其中有5家正在开展半工业化中试实验（例如美国的Green FueL,我国河北新奥等），从2007 年到2009年底，投入微藻生物能源开发的资金总量超过70亿美元。但是现阶段没有大规模商业化生产微藻生物柴油的报道。

近年来，微藻生物柴油技术也引起了我国政府科研机构和企业的重视，被列为科技部863计划，973基础规划，以及国家十二五发展规划的重点项目之一。各高校和科研院所都开展了这方面的研究，主要集中于藻种的筛选、微藻培养生物反应器设计及下游加工技术。

虽然微藻生物柴油目前在技术上是可行的，但是与化石柴油相比，微藻生物柴油的生产面临着两大“瓶颈”，使得微藻生物柴油的生产严重受阻。其一是微藻生物柴油生产成本高，故产品价格也较高，还无法适应当前的市场需求；二是目前藻种自养培养密度低，导致下游加工处理工艺成本过高。而将“微藻生物柴油生产”与“CO₂减排”高度耦合技术，不仅可以降低微藻生物柴油生产成本，实现温室气体的减排并且可获得其它高附加值产品来创造额外的生态及社会经济效益。这种新理念为缓解当前能源紧缺和温室效应的形势提供了新途径，也为微藻生物柴油的生产提供了一种可行性方案。

事实上，de Morays and Costa(2007a),Yoo(2010),唐大海(2011)，Fernandez(2012)等人的研究结果表明某些微藻藻种可以用于二氧化碳减排以及生物柴油原材料的生产。但是，藻类种群结构丰富多样，并不是所有的藻类都能够满足生产的需求，因此如何快速高效的从大量样品中获得符合要求的目标藻株是该项技术工业化应用的关键环节之一。

发明内容

本发明的目的是提供一种目标微藻藻株高效、快速、易于操作的靶向筛选工具，利用该发明获得的藻株油脂含量高并且可以耦连高浓度CO₂的高效固定，为微藻碳减排及生物柴油生产的商业化应用以及基础理论研究提供优良藻种。

本发明首先公开了一种快速批量靶向化筛选生物柴油微藻的方法，包括以下步骤：

1）采集含有藻类的酸性废水水样；

2）对步骤1）采集到的废水水样进行富集培养，获得富集水样；富集培养的条件为：温度10～40℃，光照强度2500～20000lux，光照时间为8～24h/天，通气量0.1～1vvm，其中CO₂体积分数为0.03～50%，富集培养时间为8～20天；

3）对步骤2）的富集水样进行梯度稀释，并将稀释后的富集水样点到BG11固体培养基平板上，进行平板培养；平板培养的条件为：10～40℃，光照强度2500～20000lux，光照时间为8～24h/天，平板培养时间为8～15天；

4）步骤3）的平板培养结束后，挑取固体培养基平板上长出的单个微藻藻落于载玻片上制备微藻细胞的临时装片，采用苏丹黑B亲脂性染料进行染色，在光学显微镜下观察，与含油参照微藻藻株进行比较，选择细胞中黑色油滴的面积较参照株细胞中黑色油滴面积更大的微藻细胞，即为目标微藻。

优选的，步骤1）所述酸性废水水样的pH值为3.0～6.5。

步骤1）所述酸性废水水样采集自燃煤发电厂、水泥厂或冶炼厂工业烟道气附近水域。

优选的，步骤2）所述富集培养的条件为：温度25～35℃，光照强度6000～9000lux，光照时间为9～18h/天，通气量0.2～1vvm，其中CO₂体积分数为10～20%，富集培养时间为10～15天。

更优的，步骤2）所述富集培养的条件为：温度为28℃，光照强度7500lux；光照时间为12h/天，通气量为0.33vvm，其中CO₂体积分数为15%，富集培养时间为14天。

优选的，步骤3）所述梯度稀释为采用灭菌后的BG11液体培养基将富集水样稀释10¹～10⁷倍。

优选的，步骤3）中所述富集水样点到固体培养基平板上时，每次点样量为1～50微升稀释的富集水样。

优选的，步骤3）中所述BG11固体培养基中琼脂含量为0.8～1.5wt%。

步骤4）中所述微藻细胞临时装片的制备方法可参考《微生物学实验》周德庆中微生物细胞临时装片的制备方法。

优选的，步骤4）所述苏丹黑B亲脂性染料中，溶质为0.6wt%的苏丹黑B，溶剂为95v/v%乙醇水溶液，染色温度为100℃。

优选的，步骤4）中所述含油参照微藻藻株为Chlorella pyrenoidosa SJTU-2。

步骤4）所述选择细胞中黑色油滴的面积较参照株细胞中黑色油滴面积更大的微藻细胞是指：选择细胞中黑色油滴总面积占该细胞总面积的百分比，较参照株细胞中黑色油滴总面积占参照株细胞总面积的百分比更大的微藻细胞。

所述目标微藻为细胞内油脂含量高于20wt%，且耐受0.03～15%体积分数二氧化碳浓度的微藻藻株。

更优选的，还可以对前述方法筛选出的目标微藻进行更进一步的筛选，方法为：采用氯仿甲醇法分别检测前述方法筛选出的目标微藻和参照株细胞中油脂含量，选择油脂含量显著高于参照株细胞中油脂含量的目标微藻，即为高含脂量微藻。

本发明第二方面公开了前述方法在生物质能源领域的应用。

优选的，为前述方法在生物柴油生产领域的应用。

采用本发明快速批量靶向化筛选生物柴油微藻的方法，本发明筛选获得四株可以生产生物柴油的微藻，分离的四株藻株已于2013年11月27日在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏号分别为CCTCC M2013607、CCTCC M2013608、CCTCC M2013609、CCTCCM2013610。

该藻类筛选方法与传统藻类筛选方法相比具有以下三大优点：

1.利用苏丹黑B微藻细胞脂滴原位染色技术大大降低了传统油脂含量测定过程的高强度、对样品本身、样品制备过程以及检测检验仪器设备的高要求，并消除了传统油脂测定过程中有机试剂对人体的危害。

2.利用藻落稀释点布克隆技术，大批的样品可以同时在1-2个平板上获得克隆、分离，提高了藻类筛选的效率，同时避免了传统划线分离或涂布分离交叉污染的风险。

3.利用苏丹黑B染色技术、藻落稀释点布克隆技术并结合高浓度二氧化碳压力富集筛选提高了筛选过程的靶向性。

综上，本发明以高效、快速、易于操作以及靶向筛选为目标，构建了一种基于高浓度二氧化碳限制性富集筛选、藻落稀释点布克隆、苏丹黑B微藻脂滴原位染色的优势藻株筛选模型。

本发明藻株保藏信息如下：

藻株名称：小球藻C.sorokiniana GS03；

保藏号为：CCTCC M2013607；

保藏日期：2013年11月27日；

保藏单位名称：中国典型培养物保藏中心；

保藏单位简称：CCTCC；

保藏单位地址：武汉市武昌珞珈山街道武汉大学生命科学学院。

藻株名称：Chlorella sorokiniana HN01；

保藏号为：CCTCC M2013608

保藏日期：2013年11月27日；

保藏单位名称：中国典型培养物保藏中心；

保藏单位简称：CCTCC；

藻株名称：Desmodesmus communes GS05；

保藏号为：CCTCC M2013609；

保藏日期：2013年11月27日；

保藏单位名称：中国典型培养物保藏中心；

保藏单位简称：CCTCC；

藻株名称：Heynigia riparia SX01；

保藏号为：CCTCC M2013610

保藏日期：2013年11月27日；

保藏单位名称：中国典型培养物保藏中心；

保藏单位简称：CCTCC；

附图说明

图1：参照藻株经苏丹黑B染色后的显微照片

图2：富集培养水样样品稀释点布克隆流程图

图3：利用该发明从实际环境中获得的藻株形态照片；其中图a-f（3）为目标藻株经苏丹黑B染色后形态照片，图g（3）为参照藻株Chlorella pyrenoidosa SJTU-2经苏丹黑B染色后的显微照片，图a-g（1）为目标藻株及参照藻株扫描电镜图，图a-g（2）为目标藻株及参照藻株普通光学显微镜下形态照片图（未染色）。

图4：保藏号为CCTCC M2013608的藻株生物柴油脂肪酸甲酯组成的HPLC分析

图5：保藏号为CCTCC M2013607的藻株生物柴油脂肪酸甲酯组成的HPLC分析

图6：保藏号为CCTCC M2013610的藻株生物柴油脂肪酸甲酯组成的HPLC分析

图7：保藏号为CCTCC M2013609的藻株生物柴油脂肪酸甲酯组成的HPLC分析

具体实施方式

通过以下具体实施例对本发明进行进一步的阐述，以下实施例仅用于说明，而不用于限制本发明的保护范围。

实施例1

1.实验方法

1）样本处理

从湖南、陕西、甘肃、内蒙等地运营时间超过30年以上的燃煤发电厂、水泥厂、冶炼厂工业烟道气附近采集含有藻类的酸性废水水样（pH=3.0～6.5）40份，水样于4℃冰箱保藏。

转移100ml采集的含有藻的水样进行富集培养，培养温度28℃温度，光照强度7500lux，通气量0.33vvm,其中通入含有15%体积浓度的CO₂作为筛选压力，培养时间14天。

通过上述富集培养，不能耐受15%CO₂的微藻被淘汰或成为弱势种群，能耐受15%CO₂的微藻得到富集并成为优势种群，得到富集水样。

配制BG-11培养基100ml，并加入1.2g琼脂粉，于121℃蒸汽灭菌30min.倒置固体平板。待其凝固后，吸取经富集培养后的稀释液（将富集水样稀释10倍、10²倍、10³倍），取5微升稀释户的富集水样点布于BG-11固体平板上，固体平板置于28℃温度，7500lux光照强度下静置培养，培养10天。

2）染色

称取0.6g苏丹黑B粉末于100ml容量瓶中，缓慢加入95%的乙醇溶液，定容。于100℃水浴加热加速溶解，溶解过程中蒸发的溶剂用95%乙醇水溶液补齐，获得苏丹黑B亲脂性染料。

挑取固体平板上的微藻藻落滴加一滴清水均匀涂布于载玻片中央，加盖玻片制备微藻细胞的临时装片；滴加一滴苏丹黑B亲脂性染料并涂布均匀，载玻片置于酒精灯正上方移动加热染色，待溶剂挥发干后，玻片利用70%酒精洗脱，经过洗脱的载玻片于普通光学显微镜下观察并拍照（显微镜放大倍数1000倍），实验结果见图3。

2.实验结果

选择细胞中黑色油滴的面积较参照株细胞中黑色油滴面积更大的微藻细胞，黑色油滴的面积包括两个方面：1.细胞中脂肪滴面积；2.细胞中所有脂肪滴的数目；即筛选黑色油滴的总面积占该细胞总面积的比例与参照株相比明显更大的细胞。或者，还可以通过Photoshop软件计算黑色油滴的总面积占其细胞总面积的比例，并与参照株细胞中黑色油滴总面积占该细胞总面积的比例进行比较，最终筛选出细胞中黑色油滴的面积较参照株细胞黑色油滴面积更大的微藻细胞6株，分别命名a-f，见图3。

实施例2

1.实验方法

选取实施例1筛选得到的六株微藻细胞中任意四株进行培养，并检测微藻细胞中油脂的含量，具体方法如下：

1.1 藻株a

无菌条件下在固体平板上挑取图3a所示来源的单藻（保藏号为CCTCC M2013608，保藏日期：2013年11月27日；保藏单位名称：中国典型培养物保藏中心；保藏单位简称：CCTCC）落到含有30ml灭菌培养液的100ml三角瓶中，于光照培养架静置培养，温度28℃，光照强度7500lux，光暗比12：12，培养时间12天，生长到指数末期获得种子液。

配制BG-11培养基500mL，按5v/v%接种量接入已扩大培养的细胞培养液。初始pH8.0，温度28℃，光暗比12：12(白天：夜晚)，光照强度7500lux，葡萄糖添加量15g/L,通入0.33vvm的无菌空气（CO₂含量为0.03%（v/v），培养9天。

离心收集藻细胞，真空冷冻干燥器干燥，称藻粉并计算干重。藻粉生物量浓度为6.2g/L，生物量产率为0.67g/L/d，氯仿甲醇法测定油脂含量为43%。蛋白含量38%以上，亚油酸亚麻酸占总脂肪酸组成的20%以上。油脂组成成分的HPLC图谱如图4所示。

1.2 藻株b

无菌条件下在固体平板上挑取图3b所示来源的单藻（保藏号为CCTCC M2013607；保藏日期：2013年11月27日；保藏单位名称：中国典型培养物保藏中心；保藏单位简称：CCTCC）落到含有30ml灭菌培养液的100ml三角瓶中，于光照培养架静置培养，温度28℃，光照强度7500lux，培养12天，生长到指数末期以1:10接种比例扩大培养。

配制BG-11培养基，按15%接种量接入已扩大培养的细胞。初始pH 8.0，温度28℃，7500lux光照强度下，通入0.33vvm的15%CO₂（v/v），培养14天。

离心收集藻细胞，真空冷冻干燥器干燥，称藻粉干重并计算。藻粉生物量浓度为2700mg/L，生物量产率为250mg/L/d，CO₂固定效率为460mg/L/d，氯仿甲醇法测定油脂含量为43%，生物柴油脂肪酸甲酯的组成主要为C16、C18的短链脂肪酸，占总脂肪酸甲酯组成的98%以上。油脂组成成分的HPLC图谱如图5所示。

1.3 藻株d

无菌条件下在固体平板上挑取图3d所示来源的单藻落（保藏号为CCTCC M2013610，保藏日期：2013年11月27日；保藏单位名称：中国典型培养物保藏中心；保藏单位简称：CCTCC）到含有30ml灭菌培养液的100ml三角瓶中，于光照培养架静置培养，温度28℃，光照强度7500lux，光暗比12：12，培养时间12天，生长到指数末期获得种子液。

配制BG-11培养基500mL，按10v/v%接种量接入已扩大培养的细胞培养液。初始pH8.0，温度28℃，光照暗比12:12(白天：夜晚)，光照强度7500lux，葡萄糖添加量20g/L，通入0.33vvm的无菌空气（CO₂含量为0.03%（v/v），培养9天。

离心收集藻细胞，真空冷冻干燥器干燥，称藻粉并计算干重。藻粉生物量浓度为14g/L，生物量产率为1.56g/L/d，氯仿甲醇法测定油脂含量为57%。蛋白含量40%以上。油脂组成成分的HPLC图谱如图6所示。

1.4 藻株e

无菌条件下在固体平板上挑取图3e所示来源的单藻落（保藏号为CCTCC M2013609，保藏日期：2013年11月27日；保藏单位名称：中国典型培养物保藏中心；保藏单位简称：CCTCC）到含有30ml灭菌培养液的100ml三角瓶中，于光照培养架静置培养，温度28℃，7500lux光照强度下，培养12天，生长到指数末期以1:10接种比例扩大培养。

配制BG-11培养基接入已扩大培养的细胞。初始pH 5.0，温度35℃，7500lux光照强度下，通入0.33vvm的15%CO₂（v/v），培养12天。

离心收集藻细胞，真空冷冻干燥器干燥，称藻粉干重并计算。藻粉生物量浓度为2600mg/L，生物量产率为200mg/L/d，CO₂固定效率为200mg/L/d，氯仿甲醇法测定油脂含量为41%，生物柴油脂肪酸甲酯的组成主要为C16、C18的短链脂肪酸，占总脂肪酸甲酯组成的95%以上。油脂组成成分的HPLC图谱如图7所示。

2.实验结果

可见，本发明方法筛选的目标藻株，能够耐受0.03～15%的二氧化碳浓度且细胞内油质含量高于20%，均可达到40wt%以上。

Claims

1.一种快速批量靶向化筛选生物柴油微藻的方法，包括以下步骤：

1）采集含有藻类的酸性废水水样；

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1）所述酸性废水水样的pH值为3.0～6.5。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2）所述富集培养的条件为：温度25～35℃，光照强度6000～9000lux，光照时间为9～18h/天，通气量0.2～1vvm，其中CO₂体积分数为10～20%，富集培养时间为10～15天。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3）所述梯度稀释为采用灭菌后的BG11液体培养基将富集水样稀释10¹～10⁷倍。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3）中所述富集水样点到固体培养基平板上时，每次点样量为1～50微升稀释的富集水样。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤4）所述苏丹黑B亲脂性染料中，溶质为0.6wt%的苏丹黑B，溶剂为95v/v%乙醇水溶液，染色温度为100℃，染色时间为10min。

7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤4）中所述含油参照微藻藻株为Chlorellapyrenoidosa SJTU-2。

8.权利要求1-7任一权利要求所述的方法在生物质能源领域的应用。

9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，所述应用为权利要求1-7任一权利要求所述的方法在生物柴油生产领域的应用。