CN104407065A - 一种综合评价微藻产油能力的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种综合评价微藻产油能力的方法，本发明通过评价微藻的生长速率、生物量产率、油脂产率、脂肪酸组成及生物柴油性质，得出最终的优势藻种。该方法包括下述步骤；(1)微藻细胞生长和收集；(2)提取细胞内总脂含量；(3)脂肪酸甲酯化；(4)GC-MS分析；(5)计算对数期油脂日产量；(6)黏度，密度，十六烷值，浊点，碘值及热值确定对微藻产油能力进行评价，本发明的方法能为比较不同培养体系下不同藻种产油能力提供标准，从而为最优的藻种选择和培养工艺优化提供依据。

Description

一种综合评价微藻产油能力的方法

技术领域

本发明属于生物燃料领域，涉及一种综合评价微藻产油能力的方法。

背景技术

近年来，随着化石能源的日益枯竭，寻求一种绿色的可持续新能源成为全球关注的问题。而生物柴油作为一种可再生的环保的新能源已成为各国普遍关注的焦点之一。其中微藻因为具有不占用耕地，生长快速，容易培养，含有量高，品种丰富等特点成为当前生物柴油领域研究的热点。利用藻类生产生物柴油，对缓解人类面临的粮食、能源、环境三大危机，有着巨大的潜力，同时对于减少生产生活中对石油的依赖、保证国家能源安全具有深远意义。目前，微藻制备生物柴油的研究主要集中在以下几个方面：藻种分离与筛选、藻类培养、收获和脱水、油脂提取技术、藻类生物燃料转化技术。然而成本过高一直是生物柴油产业化发展的瓶颈问题，最有效的解决方式是从降低原料成本入手，分离筛选生长速度快、油脂含量高、油质质量好的优质藻种成为从源头上降低生物柴油产品成本的重中之重。中国专利公开号CN 101624615A公开了一种快速筛选高油脂含量微藻种质的方法。但是，上述专利仅对油脂含量进行半定量测定，且未对藻种油质质量进一步评价。作为柴油的替代燃料生物柴油应当满足柴油的使用要求才能保证其作为燃料使用，因此评价生物柴油是否可以作为柴油的替代燃料首先应当看其是否具有同矿物柴油相近的性质，主要有以下几个指标：黏度，密度，十六烷值，浊点，碘值及热值，它们是国际上公认的生物柴油质量的重要评估指标，但是它们的检测实际操作复杂，且相关设备造价昂贵，普及性不强。中国专利公开号CN 102495151A公开了一种评价微藻产油能力的方法，仅将十六烷值引入评定指标中，对其他重要生物柴油性质的评定还未建立。

研究表明生物柴油性质与脂肪酸组成密切相关，脂肪酸组成的分析可以进一步评价藻油的油脂是否适合生产生物柴油。但由于脂肪酸组成的多样性和相互矛盾的性质影响生物柴油性能，很难清楚的定义作为生物柴油储备的合适的脂肪酸组成。因此，为评价重要的生物柴油性质，一个综合的脂肪酸组成分析方法是迫切需要的。Hoekman et al.在2012年提出生物柴油的黏度，密度，十六烷值，浊点，碘值及热值与脂肪酸组成的平均不饱和度有线性相关性，并给出相关公式(Hoekman,S.K.,Broch,A.,Robbins,C.,Ceniceros,E.,Natarajan,M.,2012.Review of biodiesel composition,properties,and specifications.Renew.Sust.Energ.Rev.16,143–169)。而且大量研究表明生物柴油的黏度，密度，十六烷值，浊点，碘值及热值与脂肪酸甲酯平均不饱和度密切相关(Knothe,G.,2011.A technical evaluation ofbiodiesel from vegetable oils vs.algae.Will algae-derived biodiesel perform？Green Chem.13,3048–3065)。平均不饱和度的增加会导致十六烷值和氧化稳定性的降低，但是会提高低温流动性能。

发明内容

本发明的目的就在于克服现有技术的上述不足，提供一种综合评价微藻产油能力的方法。为进一步评价微藻作为生物柴油原料的潜力，本发明将这六个性质引入评定指标中，介绍一种依靠脂肪酸组成快速评价微藻生物柴油性质的方法。从而可以轻易实现不同藻种的产油能力的比较，从而为最优藻种的选择和培养方法的优化提供依据。

为解决上述技术问题，本发明是通过以下技术方案实现的：

本发明提供了一种综合评价微藻产油能力的方法，包括如下步骤：

1)微藻细胞生长和收集：

检测藻液生物量，根据藻细胞密度的变化，确定藻类的生长曲线，通过时间和细胞密度的线性回归斜率，计算对数期的藻细胞的比生长速率；取一定量进入稳定期的藻液样品，离心后收集下层的细胞，用甲酸铵溶液清洗后低温干燥，即得待测干藻粉；

2)提取细胞内总脂：

称取一定量干藻粉于离心管中，加入氯仿/甲醇溶液，用超声破碎仪破碎，离心后提取有机相，向有机相中投加氯化钠溶液，静置分层，回收下层油脂提取溶液并测量其体积，计算油脂含量；

3)脂肪酸甲酯化：

称取与步骤2)等量的藻粉，加入甲醇/浓硫酸/氯仿的混合溶液，在90℃下水浴反应，待反应完毕分层后，取上层氯仿，即得供试品溶液；

4)GC-MS检测

采用GC-MS对脂肪酸甲酯进行定性处理，条件如下：

色谱柱：DB-23石英毛细管柱，其规格为60m×0.25mm×250nm；

进样量：1μL；

分流比：50:1；

进样口温度：210℃；

氦气流速：恒流，1ml/min；

升温程序：:80℃保持5min，以4℃每分钟的速度升到290℃，并在290℃保持5min；

离子源温度：250℃；

数据被NIST质量光谱数据库分析；

5)评价产油能力

根据如下公式(3)，计算藻类对数期油脂的日产量：

P＝DW×k×LW      (1)

其中P是微藻对数期油脂日产量，DW是步骤1)中单位体积藻细胞对数末期的干重；k是步骤1)中的对数期比生长速率；LW是步骤2)中的基于干重下的油脂含量；

6)黏度，密度，十六烷值，浊点，碘值及热值确定

根据如下公式计算藻类脂肪酸甲酯混合物的平均不饱和度：

ADU＝∑M╳Yi      (2)

其中，ADU指的是藻油的平均不饱和度；

Yi指的是每一个脂肪酸组分的质量分数；

M是每一个脂肪酸组分中碳碳双键的数目；

由生物柴油不饱和度计算得到生物柴油性质如黏度、密度、浊点、十六烷值、碘值和热值。

优选的是，步骤1)中所述的收集步骤为4℃下3000-5000转/分钟，离心6-10min，收集下层的细胞，用0.5M甲酸铵溶液清洗两遍脱盐，于60℃低温干燥细胞。

步骤1)中所述的藻细胞比生长速率计算步骤为采用如下方程(3)：

k＝ln N-ln N₀/(t–t₀)      (3)

式中：k—微藻对数期比生长速率d^-1；

N—微藻在时间t时刻的细胞密度cells/ml；

N₀—微藻在对数期开始时刻t0的细胞密度cells/ml。

优选的是，步骤2)中所述的提取细胞内总脂的步骤为称取0.09-0.1g干藻粉于50ml离心管中，加入10ml体积比为2:1氯仿/甲醇溶液，超声破碎仪破碎6-10min，频率为21.5KHZ，超声功率为190W，于4000-5000r/min离心分离6-10min，重复两次提取有机相；向上述有机相中投加质量浓度为20％的氯化钠溶液，氯化钠溶液的用量为提取的有机相总体积的0.9％，充分摇匀1-2min，静置分层13-15min，回收下层油脂提取溶液并测量其体积，取5ml回收溶液于10ml玻璃试管中，用氮气吹干，将玻璃管放置于80℃烘箱中烘至衡重。

步骤2)计算油脂含量的步骤为采用如下方程(4)：

$\mathrm{LW}=\frac{(m_2-m_0)\×V}{5\×m_1}---\left(4\right)$

式中：LW—基于干重下的油脂含量，g/g；

m₁—藻粉干重，g；

m₀—10ml玻璃管干重，g；

m₂—带有油脂的10ml玻璃管干重，g；

V—油脂体积，ml。

优选的是，步骤3)中所述的脂肪酸甲酯化的步骤为称取与步骤2)等量的藻粉，放入25ml玻璃管中，加入体积比为4.25:0.75:5的甲醇/浓硫酸/氯仿的混合溶液10ml，在90℃下水浴80-90min，待反应完毕分层后，取上层氯仿相，即得。

优选的是，步骤4)中所述的GC-MS定性处理脂肪酸甲酯的检测用量为1μl。

步骤6)中所述的黏度、密度、浊点、十六烷值、碘值和热值与生物柴油不饱和度的关系由如下公式(5)-(10)表示：

y＝－0.6316x+5.2065      (5)

y＝0.0055x+0.8726      (6)

y＝－13.356x+19.994      (7)

y＝－6.6684x+62.876      (8)

y＝74.373x+12.71      (9)

y＝1.7601x+38.534      (10)。

所述的微藻为蹄形藻、羊角月牙藻、角星鼓藻、小球藻、斜生栅藻、舟形藻、三角褐指藻、串珠藻、库氏鞘丝藻、球等鞭金藻。

本发明的有益效果：

1.提供一种综合评价微藻产油能力的方法。为进一步评价微藻作为生物柴油原料的潜力，本发明将这六个性质引入评定指标中，介绍一种依靠脂肪酸组成快速评价微藻生物柴油性质的方法。从而可以轻易实现不同藻种的产油能力的比较，从而为最优藻种的选择和培养方法的优化提供依据。

2.通过与美国ASTM D6751，欧洲EN 14214生物柴油质量标准及常见生物柴油原料油质质量范围的比较，得出这十株藻的黏度、密度、十六烷值及热值都符合这些标准。检测方法简单高效，实用性强、适宜推广，为快速筛选优质栅藻提供了一种新方法。

具体实施方式

以下通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规的方法和条件进行选择。

实施例1十株微藻生长和产油性能评价

(1)十株微藻生长和收获

十株藻在培养液培养活化7天后(培养基在附表1,2)，准备接种，初始接种密度约为1×10⁵cells/ml，移入1L锥形瓶中，封口。置于光照培养箱中培养，培养温度为25±1℃，全光照，光照强度2500Lux，静置培养，每天手动摇动两次。每日取样监测藻细胞生物量，待藻液生长到稳定期收获。4℃下4000r/min，离心10min，收集下层的细胞，用0.5M甲酸铵溶液清洗两遍脱盐，在60℃下低温干燥24h获得干细胞；

通过藻细胞密度的监测确定好藻类的生长曲线后，对数期的藻细胞的比生长速率通过时间和细胞密度的线性回归斜率计算。比生长速率计算如下方程。

k＝ln N-ln N₀/(t–t₀)

式中：k—微藻对数期比生长速率d^-1；

N—微藻在时间t时刻的细胞密度cells/ml；

N₀—微藻在对数期开始时刻t0的细胞密度cells/ml；

(2)十株微藻总脂提取

称取步骤1获得的约0.1g干藻粉于50ml离心管中，加入10ml氯仿/甲醇(2:1)溶液，用超声破碎仪破碎6-10min，频率为21.5KHZ，超声功率为190W，然后4000r/min离心10min，保留有机相，将有机相转移到分液漏斗中，整个提取过程重复两次。根据分离的有机相的总体积，向上述有机相中投加质量浓度为20％的氯化钠溶液，氯化钠溶液的用量为分离的有机相的总体积的0.9％，充分摇匀1min，并静置分层15min，回收下层油脂提取溶液并测量其体积，取5ml回收溶液于10ml玻璃试管中，用氮气吹干，将玻璃管放置于80℃烘箱中烘至衡重(约30分钟)。方程(4)计算油脂含量。

(3)十株微藻对数期油脂的日产量

根据如下公式，计算藻类对数期油脂的日产量：

P＝DW×k×LW

其中P是微藻对数期油脂日产量，DW是步骤(1)中单位体积藻细胞对数末期的干重；k是步骤(1)中的对数期比生长速率；LW是步骤(2)中的基于干重下的油脂含量。

表1 BG11培养基成分

化学成分	用量(mg·L-1)
		(1)NaNO3	1500
(2)K2HPO4	40
		(3)MgSO4·7H2O	75
(4)CaCl2·2H2O	36
		(5)柠檬酸	6
(6)柠檬酸铁铵	6

(7)EDTANa2	1
		(8)Na2CO3	20
(9)H3BO3	2.86
		(10)MnCl2·4H2O	1.86
(11)ZnSO4·7H2O	0.22
		(12)Na2MoO4.2H2O	0.39
(13)CuSO4.5H2O	0.08
		(14)Co(NO3)2.6H2O	0.05

注：用1M N_aOH或者HCl调节PH到7.1。

表2 f/2培养基成分

化学成分	用量
		(1)NaNO3	75mg/L
(2)NaHPO4·2H2O	0.6mg/L
		(3)Vitamin B12	0.5μg/L
(4)Biotin	0.5μg/L
		(5)Thiamine HCl	100μg/L
(6)Na2SiO3·9H2O	10mg/L
		(7)f/2metals	1mL/L
Na2EDTA·2H2O	4.4g
		FeCl3·6H2O	3.16g
CoSO4·7H2O	0.012g
		ZnSO2·7H2O	0.021g
MnCl2·4H2O	0.18g
		CuSO4·5H2O	0.007g
Na2MoO4·2H2O	0.007g
		Distilled water	1000mL

注：母液用1L的灭菌海水。

表3.D1培养基成分

化学成分	用量(mg·L-1)
		(1)NaNO3	120
(2)K2HPO4	40

(3)MgSO4·7H2O	70
		(4)CaCl2·2H2O	20
(5)KH2PO4	80
		(6)Na2SiO3.9H2O	100
(7)柠檬酸铁	5
		(8)MnSO4	0.2
(9)H3BO3	2.86
		(10)MnCl2·4H2O	1.86
(11)ZnSO4·7H2O	0.22
		(12)Na2MoO4.2H2O	0.39
(13)CuSO4.5H2O	0.08
		(14)Co(NO3)2.6H2O	0.05
(15)土壤提取液	20mL/L

注：土壤提取液配制方法：取花园土未施过肥200g置于烧杯或三角瓶中，加入蒸馏水1000毫升，瓶口用透气塞封口，在水浴中沸水加热3小时，冷却，沉淀24小时，此过程连续进行3次，然过滤，取上清液，于高压灭菌锅中灭菌后于4℃冰箱中保存备用。

表4 十株微藻的培养基、比生长速率和油脂产率的情况

如表4所示，蹄形藻(Kirchneriella lunaris)获得最高的生物量293.79mg·L^-1，但由于油脂含量低，最终获得较低的油脂产率。因此，油脂含量和生物量不能单独作为评价微藻产油能力的指标，油脂产率被选为评价微藻是否有潜力生产生物柴油的一项最基本的指标，因为它由油脂含量和生物量产率共同决定。本发明中，通过测定对数期比生长速率，对数期末期生物量浓度，对数期末期油脂含量，通过三者乘积获得油脂产率。就油脂产率，初步获得5株比较有潜力的藻株羊角月牙藻(Selenastrum capricornutum)、小球藻(Chlorellavulgaris)、斜生栅藻(Scenedesmus obliqnus)、三角褐指藻(Phaeodactylum tricornutum)和球等鞭金藻(Isochrysis sphacrica)，最优藻株为三角褐指藻，油脂含量(61.43％)，生物量产率(256.18mg·L^-1)，油脂产率达到(26.75mg·L^-1d^-1)，被视为优势微藻。

实施例2十株微藻的脂肪酸甲酯分析

(1)十株微藻脂肪酸甲酯化

称取相同质量的藻粉(100mg)平行样，放入25ml玻璃管中，加入甲醇：浓硫酸：氯仿(体积比4.25:0.75:5)的混合溶液10ml，在90度下水浴90分钟，待反应完毕分层后，取上层氯仿相于已编号的GC进样瓶，封口，取1μL进行气相色谱质谱联用(GC-MS)测定。

(2)GC-MS检测

采用GC-MS对脂肪酸甲酯进行定性处理，条件如下：

色谱柱：DB-23石英毛细管柱，其规格为60m×0.25mm×250nm；

进样量：1μL；

分流比：50:1；

进样口温度：210℃；

氦气流速：恒流，1ml/min；

升温程序：:80℃保持5min，以4℃每分钟的速度升到290℃，并在290℃保持5min；

离子源温度：250℃；

数据被NIST质量光谱数据库分析。

表5 十株微藻的脂肪酸甲酯组成

注：-:未检出

1-蹄形藻(Kirchneriella lunaris),2-羊角月牙藻(Selenastrum capricornutum),3-角星鼓藻(Staursatrum sp).,4-普通小球藻(Chlorella vulgaris),5-斜生栅藻(Scenedesmus obliqnus),6-舟形藻(Navicula sp.),7-三角褐指藻(Phaeodactylumtricornutum),8-串珠藻(Batrachospermum sirodotia),9-库氏鞘丝藻(Lyngbya kuetzingii),10-球等鞭金藻(Isochrysis sphacrica).

如表5所示，十株微藻的脂肪酸组成中，适于生产生物柴油的C16-18脂肪酸组份，在60-90％之间波动。其中，优势微藻三角褐指藻含有最高的C16-18组分74.50％。一致认为单不饱和脂肪酸特别是C16:1和C18:1能够实现生物柴油氧化稳定性和低温流动性的统一。其中在斜生栅藻、舟形藻和三角褐指藻中C16:1的含量分别为42.06％、51.88％和22.34％。

实施例3十株微藻的生物柴油性质评价

(1)十株微藻脂肪酸甲酯的平均不饱和度确定

根据如下公式计算藻类脂肪酸甲酯混合物的平均不饱和度：

ADU＝∑M╳Y_i

其中，ADU指的是藻油的平均不饱和度；

Y_i指的是每一个脂肪酸组分的质量分数；

M是每一个脂肪酸组分中碳碳双键的数目。

平均不饱和度数值在表6中。

(2)十株微藻藻油的黏度，密度，十六烷值，浊点，碘值及热值确定

由生物柴油平均不饱和度计算得到生物柴油性质如黏度、密度、浊点、十六烷值、碘值和热值(表6)，它们的关系分别由如下公式表示。

y＝－0.6316x+5.2065

y＝0.0055x+0.8726

y＝－13.356x+19.994

y＝－6.6684x+62.876

y＝74.373x+12.71

y＝1.7601x+38.534

表6 十株微藻油的生物柴油性质和生物柴油、ASTM生物柴油及EN生物柴油标准对比

注：1-蹄形藻(Kirchneriella lunaris),2-羊角月牙藻(Selenastrum capricornutum),3-角星鼓藻(Staursatrumsp).,4-普通小球藻(Chlorella vulgaris),5-斜生栅藻(Scenedesmus obliqnus),6-舟形藻(Navicula sp.),7-三角褐指藻(Phaeodactylum tricornutum),8-串珠藻(Batrachospermum sirodotia),9-库氏鞘丝藻(Lyngbyakuetzingii),10-球等鞭金藻(Isochrysis sphacrica)a来自文献中的常见生物柴油原料油质的质量范围。

如表6所示，通过与美国ASTM D6751，欧洲EN 14214生物柴油质量标准及常见生物柴油原料油质质量范围的比较，得出这十株藻的黏度、密度、十六烷值及热值都符合这些标准。此外，由于气候条件不同，在美国和欧洲的两个标准中，对浊点都没有明确的范围，高的浊点表明较差的低温流动性，同时高的十六烷值有利于藻油的氧化稳定。蹄形藻(Kirchneriellalunaris)和库氏鞘丝藻(Lyngbya kuetzingii)的碘值超过标准的最大值120，这表明这两株藻油比较容易被氧化。最后综合高油脂产率和适宜的生物柴油性质，三角褐指藻(Phaeodactylumtricornutum)、普通小球藻(Chlorella vulgaris)和斜生栅藻(Scenedesmus obliqnus)有潜力生产具有较好低温流动性和氧化稳定性性能的生物柴油，而被最终选为优势能源藻株。

上述虽然对本发明的具体实施方式进行了描述，但并非对本发明保护范围的限制，所属领域技术人员应该明白，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围以内。

Claims (9)

1.一种综合评价微藻产油能力的方法，其特征是，包括如下步骤：

1)微藻细胞生长和收集：

检测藻液生物量，根据藻细胞密度的变化，确定藻类的生长曲线，通过时间和细胞密度的线性回归斜率，计算对数期的藻细胞的比生长速率；取一定量进入稳定期的藻液样品，离心后收集下层的细胞，用甲酸铵溶液清洗后低温干燥，即得待测干藻粉；

2)提取细胞内总脂：

称取一定量干藻粉于离心管中，加入氯仿/甲醇溶液，用超声破碎仪破碎，离心后提取有机相，向有机相中投加氯化钠溶液，静置分层，回收下层油脂提取溶液并测量其体积，计算油脂含量；

3)脂肪酸甲酯化：

称取与步骤2)等量的藻粉，加入甲醇/浓硫酸/氯仿的混合溶液，在90℃下水浴反应，待反应完毕分层后，取上层氯仿，即得供试品溶液；

4)GC-MS检测

采用GC-MS对脂肪酸甲酯进行定性处理，条件如下：

色谱柱：DB-23石英毛细管柱，其规格为60m×0.25mm×250nm；

进样量：1μL；

分流比：50:1；

进样口温度：210℃；

氦气流速：恒流，1ml/min；

升温程序：:80℃保持5min，以4℃每分钟的速度升到290℃，并在290℃保持5min；

离子源温度：250℃；

数据被NIST质量光谱数据库分析；

5)评价产油能力

根据如下公式(3)，计算藻类对数期油脂的日产量：

P＝DW×k×LW      (1)

其中P是微藻对数期油脂日产量，DW是步骤1)中单位体积藻细胞对数末期的干重；k是步骤1)中的对数期比生长速率；LW是步骤2)中的基于干重下的油脂含量；

6)黏度，密度，十六烷值，浊点，碘值及热值确定

根据如下公式计算藻类脂肪酸甲酯混合物的平均不饱和度：

ADU＝∑M╳Yi      (2)

其中，ADU指的是藻油的平均不饱和度；

Yi指的是每一个脂肪酸组分的质量分数；

M是每一个脂肪酸组分中碳碳双键的数目；

由生物柴油不饱和度计算得到生物柴油性质如黏度、密度、浊点、十六烷值、碘值和热值。

2.权利要求1所述的方法，其特征是，步骤1)中所述的收集步骤为4℃下3000-5000转/分钟，离心6-10min，收集下层的细胞，用0.5M甲酸铵溶液清洗两遍脱盐，于60℃低温干燥细胞。

3.权利要求1所述的方法，其特征是，步骤1)中所述的藻细胞比生长速率计算步骤为采用如下方程(3)：

k＝ln N-ln N₀/(t–t₀)      (3)

式中：k—微藻对数期比生长速率d^-1；

N—微藻在时间t时刻的细胞密度cells/ml；

N₀—微藻在对数期开始时刻t0的细胞密度cells/ml。

4.权利要求1所述的方法，其特征是，步骤2)中所述的提取细胞内总脂的步骤为称取0.09-0.1g干藻粉于50ml离心管中，加入10ml体积比为2:1氯仿/甲醇溶液超声破碎仪破碎6-10min，频率为21.5KHZ，超声功率为190W，于4000-5000r/min离心分离6-10min，重复两次提取有机相；向上述有机相中投加质量浓度为20％的氯化钠溶液，氯化钠溶液的用量为提取的有机相总体积的0.9％，充分摇匀1-2min，静置分层13-15min，回收下层油脂提取溶液并测量其体积，取5ml回收溶液于10ml玻璃试管中，用氮气吹干，将玻璃管放置于80℃烘箱中烘至衡重。

5.权利要求1所述的方法，其特征是，步骤2)计算油脂含量的步骤为采用如下方程(4)：

$\mathrm{LW}=\frac{(m_2-m_0)\×V}{5\×m_1}---\left(4\right)$

式中：LW—基于干重下的油脂含量，g/g；

m₁—藻粉干重，g；

m₀—10ml玻璃管干重，g；

m₂—带有油脂的10ml玻璃管干重，g；

V—油脂体积，ml。

6.权利要求1所述的方法，其特征是，步骤3)中所述的脂肪酸甲酯化的步骤为称取与步骤2)等量的藻粉，放入25ml玻璃管中，加入体积比为4.25:0.75:5的甲醇/浓硫酸/氯仿的混合溶液10ml，在90℃下水浴80-90min，待反应完毕分层后，取上层氯仿相，即得。

7.权利要求1所述的方法，其特征是，步骤4)中所述的GC-MS定性处理脂肪酸甲酯的检测用量为1μl。

8.权利要求1所述的方法，其特征是，步骤6)中所述的黏度、密度、浊点、十六烷值、碘值和热值与生物柴油不饱和度的关系由如下公式(5)-(10)表示：

y＝－0.6316x+5.2065  (5)

y＝0.0055x+0.8726    (6)

y＝－13.356x+19.994  (7)

y＝－6.6684x+62.876  (8)

y＝74.373x+12.71     (9)

y＝1.7601x+38.534    (10)。

9.权利要求1所述的方法，其特征是，所述微藻为蹄形藻、羊角月牙藻、角星鼓藻、小球藻、斜生栅藻、舟形藻、三角褐指藻、串珠藻、库氏鞘丝藻、球等鞭金藻。