CN101532991A - 一种快速检测海洋微藻脂肪酸含量的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种快速检测海洋微藻脂肪酸含量的方法，该方法是利用饱和KOH－CH3OH对微藻中脂类提取并造化，使提取过程和造化过程合二为一，再用HCl－CH3OH进行甲酯化，获得脂肪酸，该组分经过提取、皂化和甲酯化后进行气相色谱质谱分析，具体步骤如下：(1)样品准备，(2)脂肪酸的提取、皂化和甲酯化，(3)脂肪酸的气相色谱检测条件。该方法具有操作步骤简单，节省时间，方法简单快捷，数据直观，增加了样品之间的可比性。
Description
技术领域
本发明属于海洋微生物领域，具体地说，其是对海洋微藻脂肪酸利用饱和KOH-CH3OH快速检测海洋微藻脂肪酸含量的方法。
背景技术
海洋微藻含有丰富的脂肪酸、多不饱和脂肪酸(PUFAs)、蛋白质、各种维生素、生物多糖等，具有优异的营养保健功能。开发和利用微藻资源已成为当今世界生命科学与技术领域关注的焦点之一。
研究证实，多不饱和脂肪酸对于生物体具有重要转化成具调节某些生理功能的代谢产物等。γ—亚麻酸(γ-linolenic acid)、AA、二十碳五烯酸[20：5(n-3)，EPA]和二十二碳六烯酸[22：6(n-3)，DHA]是比较重要的PUFAs，其中EPA和DHA作为人体必须脂肪酸，在营养强化、预防和治疗多种疾病如预防动脉粥样硬化和心血管疾病，降低血浆中胆固醇和甘油三酯水平、减轻炎症等有明显疗效。此外，已有关于EPA作为抗癌剂的报道。
海洋微藻是海洋生态体系中重要的初级生产者，某些海洋微藻不仅含有较高的脂肪酸和多不饱和脂肪酸，而且其组成比较单一，利于分离纯化。海洋微藻具有资源丰富、生长快等优点，在保健品和生物能源方面具有较大开发和利用的潜力，已经成为国内外的研究热点。
对海洋微藻脂肪酸的测定，目前还没有标准方法，大多数的方法是用有机溶剂提取浓缩后得到微藻粗脂肪，粗脂肪加热皂化两个小时后用有机溶剂提取浓缩，再经过一个小时甲酯化，用有机溶剂提取，利用GC来测定脂肪酸的含量。
蒋霞敏等采用Bligh-Dyer法提取微藻中总脂。提取总脂加KOH甲醇溶液皂化2h。皂化液转移到离心管中，用盐酸调，加饱和氯化钠溶液，用氯仿：正己烷提取两次。合并提取液，浓缩，浓缩液再甲酯化1h，最后用正己烷提取，上气相色谱仪进行分析。该方法操作复杂，处理时间长，步骤繁琐。
Chiara Bigogno的方法是在藻粉加入H2SO4/甲醇溶液，将样品瓶放入80℃砂浴(磁力加热板)中加热搅拌抽提1h。再用正己烷萃取，离心15min。取出上层正己烷层氮气下吹干，再加入100μL正己烷备测。与其它方法比较，该方法操作步骤虽然已经简化，但还是比较繁琐，操作时间较长，所以不适合在实验室快速检测。
针对微藻脂肪酸，如何建立快速，简便、准确的检测方法，是今后一段时期功能食品研究开发的热点。本文即针对这一问题，开展微藻脂肪酸快速测定方法研究，并利用该方法探讨从微藻中提取脂肪酸的最近试验条件，为其应用提供前期基础。
发明内容
本发明的目的是提供一种快速检测海洋微藻脂肪酸含量的方法，该方法利用饱和KOH-CH3OH对微藻中脂类提取并造化，使提取过程和造化过程合二为一，再用HCl-CH3OH进行甲酯化，获得脂肪酸，该组分经过提取、皂化和甲酯化后进行气相色谱质谱分析，本方法与传统常用的微藻脂肪酸提取制备方法比较，具有操作步骤简单、节省时间、有机试剂用量少、减少了有机溶剂的使用量，节约了人力物力，大大提高了工作效率。
本发明的目的是由以下技术方案实现的，研制了一种快速检测海洋微藻脂肪酸含量的方法。该方法利用饱和KOH-CH3OH对微藻中脂类提取并造化，使提取过程和造化过程合二为一，再用HCl-CH3OH进行甲酯化，获得脂肪酸，该组分经过提取、皂化和甲酯化后进行气相色谱质谱分析，具体步骤如下：
(1)样品准备：
称取8-10mg的藻粉样品；配制饱和KOH—CH3OH溶液和1moL/L的HCl—CH3OH溶液(使pH<2)；取15.00mg十九碳酸于10mL容量瓶中，用正己烷稀释至刻度配制成内标溶液；将混合标准溶液用正己烷稀释至100倍成标准溶液；
(2)脂肪酸的提取、皂化和甲酯化：
该方法利用饱和KOH-CH3OH对微藻中脂类提取并造化，使提取过程和造化过程合二为一，再用HCl-CH3OH进行甲酯化，获得脂肪酸，该组分经过提取、皂化和甲酯化后进行气相色谱质谱分析，具体步骤如下：
1、脂肪酸提取条件的确定
脂肪酸测定方法：称取10mg左右的藻粉样品，置于螺口试管中，加50μL浓度为1mg/mL的十九碳酸内标和1mL的饱和KOH—CH3OH溶液，充氨气保护，于75℃水浴皂化10min，冷却后加2mL的1moL/L的HCl—CH3OH溶液(使pH<2).混匀.75℃水浴10min。冷却.加0.5mL正己烷和2mL蒸馏水，充分振荡，静置，取正己烷层，用气相色谱质谱仪分析。
标准曲线的绘制
内标溶液：准确称取15.00mg十九碳酸于10mL容量瓶中，用正己烷稀释至刻度。
标准溶液：将混合标准溶液用正己烷稀释至100倍。
2、样品的测定和计算
标准溶液的测定：取标准溶液1μL注入气相色谱仪，得到标准溶液的谱图，经计算得到各脂肪酸的校正因子。
样品的测定：取1μL待测样品注入气相色谱仪进行测定，根据标准溶液的谱图进行定性，根据校正因子进行定量。
游离脂肪酸含量的计算：根据被测物和内标物的质量及在色谱图上相应的峰面积比，由校正因子按下式求游离脂肪酸的含量：
Xi＝Ws×Fsi×Ai/(As×Wi)。
其中，Xi为微藻脂肪酸i的含量；Ws为样品中加入内标物的质量；As为内标物的峰面积；Ai为脂肪酸i的峰面积，Fsi为相对校正因子，计算公式如下：
Fsi＝Wi×As/(Ws×Ai)。
3、色谱条件：
将藻粉样品置于螺口试管中→加50μL浓度为1mg/mL的十九碳酸内标和1mL的饱和KOH—CH3OH溶液→充氨气保护→于75℃水浴皂化10min→冷却后加2mL的1moL/L的HCl—CH3OH溶液(使pH<2)混匀→75℃水浴10min→冷却→加0.5mL正己烷和2mL蒸馏水→振荡→静置→取正己烷层用气相色谱质谱仪分析；
(3)脂肪酸的气相色谱检测条件：
a、色谱柱：HP-5MS石英毛细管柱(30m×0.25mm id×0.25um)；
b、载气：氦气，流速为1mL/min，进样口温度250℃，传输线温度为300℃；
c、电子能量70eV，离子源温度230℃，四极杆温度150℃’；
d、升温程序为：初温50℃，10℃/min升到280℃；
e、进样量1μL，分流进样(10：1)，扫描方式为全扫描(Scan)方式；各脂肪酸组分含量由对应的峰面积和内标物的峰面积的比值求得。
本发明快速检测海洋微藻脂肪酸含量的方法优点是：本方法的与传统常用的微藻脂肪酸提取制备方法比较，具有操作步骤简单(两步即可完成，传统方法需要至少需要五步)、节省时间(整个操作过程只需30min，传统方法需要3-4h)，有机试剂用量少(每一个样品只需2ml即可)等优点，减少了有机溶剂的使用量，节约了人力物力，这样大大提高了工作效率。传统的脂肪酸计算方法是采用面积归一化法计算相对百分含量，计算的数据是一个相对值，数据之间可比性比较差，本发明的方法采用内标法进行定量分析，方法简单快捷，数据直观，增加了样品之间的可比性。为微藻的开发利用提供了科学可靠的基础数据。
附图说明
图1为脂肪酸气相色谱分离图；
具体实施例
本发明的保护范围不仅局限于以下实施例中，参见图1本发明的具体技术步骤如下：
色谱柱：HP-5MS石英毛细管柱(30m×0.25mm id×0.25um)；载气：氦气，流速为1mL/min，进样口温度250℃，传输线温度为300℃。电子能量70eV，离子源温度230℃，四极杆温度150℃。升温程序为：初温50℃，10℃/min升到280℃。进样量1μL，分流进样(10：1)，扫描方式为全扫描(Scan)方式。
4、脂肪酸的鉴定：
参照标准样品和谱库NIST5.0进行，用归一化法计算出脂肪酸组分的百分含量，以占脂肪酸总量的百分比表示。
5、实际样品的验证：
按照对微藻中脂肪酸进行提取，根据色谱条件进行分析，最后按照样品的测定和计算进行结果分析。
6、微藻中脂肪酸的气相色谱-质谱分析
在实验部分给出的色谱条件下，一种微藻脂肪酸的色谱图示于图1，可以看出，个脂肪酸峰型对称、没有脱尾现象，分离的效果很好。
7、微藻中脂肪酸的含量
精密度实验：取微藻样品1份，按供试液制备方法制备供试液，采用色谱条件，连续进样5次，结果相对峰面积大于1％的8个色谱峰相对保留时间和相对峰面积RSD分别在0～0.19％和0.38％～3.75％的范围内，说明该方法精密度良好。
重现性实验：取同一批号微藻样品5份，按供试液制备方法制备供试液，分别测定指纹图谱。结果18个色谱峰相对保留时间和相对峰面积RSD分别为0～0.38％和0.57％～5.6％。表明该方法的重现性良好，符合测定的要求。
8、提取液样品的稳定性考察
取微藻样品1份，按供试液制备方法制备供试液，分别在0、1、3、4、8、16、24和48h测定指纹图谱。结果表明48h前，18个色谱峰相对保留时间和相对峰面积RSD均小于1％，表明样品在48h内测定是稳定的。
本领域的普通技术人员都会理解，在本发明的保护范围内，对于上述实施例进行修改，添加和替换都是可能的，其都没有超出本发明的保护范围。
Claims (1)
1.一种快速检测海洋微藻脂肪酸含量的方法，其特征在于：利用饱和KOH-CH3OH对微藻中脂类提取并造化，使提取过程和造化过程合二为一，再用HCl-CH3OH进行甲酯化，获得脂肪酸，该组分经过提取、皂化和甲酯化后进行气相色谱质谱分析，具体步骤如下：
(1)样品准备：
称取8-10mg的藻粉样品；配制饱和KOH—CH3OH溶液和1moL/L的HCl—CH3OH溶液(使pH<2)；取15.00mg十九碳酸于10mL容量瓶中，用正己烷稀释至刻度配制成内标溶液；将混合标准溶液用正己烷稀释至100倍成标准溶液；
(2)脂肪酸的提取、皂化和甲酯化：
将藻粉样品置于螺口试管中→加50μL浓度为1mg/mL的十九碳酸内标和1mL的饱和KOH—CH3OH溶液→充氨气保护→于75℃水浴皂化10min→冷却后加2mL的1moL/L的HCl—CH3OH溶液(使pH<2)混匀→75℃水浴10min→冷却→加0.5mL正己烷和2mL蒸馏水→振荡→静置→取正己烷层用气相色谱质谱仪分析；
(3)脂肪酸的气相色谱检测条件：
a、色谱柱：HP-5MS石英毛细管柱(30m×0.25mm id×0.25um)；
b、载气：氦气，流速为1mL/min，进样口温度250℃，传输线温度为300℃；
c、电子能量70eV，离子源温度230℃，四极杆温度150℃’；
d、升温程序为：初温50℃，10℃/min升到280℃；
e、进样量1μL，分流进样(10：1)，扫描方式为全扫描(Scan)方式；各脂肪酸组分含量由对应的峰面积和内标物的峰面积的比值求得。
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