CN103849456B - 一种微量藻粉快速甲酯化的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明是一种微量藻粉快速甲酯化的方法。本发明解决了现有技术在微藻油脂成分分析过程使用的甲酯化方法需样量大、操作步骤多和耗时长的技术问题。本发明方法无需将提取藻油，在酸催化和高甲醇：藻粉比条件下，直接对微量的藻粉直接进行甲酯化反应：5-10mg干藻粉，加入5ml的1-10%硫酸甲醇（或盐酸甲醇）溶液，在搅拌混合作用下，于70℃回流反应1-8h。本发明方法适用于绿藻门、金藻门、硅藻门等单细胞藻类进行快速及在线监测的甲酯化。

Description

一种微量藻粉快速甲酯化的方法
技术领域
本发明属于一种以微藻藻粉为原料的微量快速甲酯化方法，其产物用于对微藻脂肪酸甲酯进行定性定量分析。（C11B1/04）
背景技术
近年来，随着石油资源日趋紧张，生物能源尤其是微藻生物能源得到了越来越多的关注和发展。作为目前液体燃料最适宜的替代物，生物柴油是众多可替代能源中最有可能率先大规模应用的产品。作为生物圈最大生物量之一的微藻，具有快速生长和光合固定二氧化碳双重优势，是具有很高应用前景的生物柴油生产生物。微藻生物技术的开发，将为我国提供新的能源途径。
但在世界范围内，海洋微藻能源研究及应用尚处于起步阶段，存在的突出问题是成本过高，理论和现实差距大，许多关键技术有待突破，就前期的研究来看，如何快速获得微藻生物柴油较为重要。但是目前均需要先把微藻油脂提取出来，再对提取出来的油脂进行反应。所以微量快速获得微藻生物柴油成为迫在眉睫的工作，也是其他各项后续工作的前提。
将微藻油脂进行甲酯化是最为常用的微藻生物柴油制备方法，但是所需样品量大，样品处理与提取过程耗时长，不能满足微藻油脂研究和生产的检测要求。通常甲酯化时甲醇与藻粉比为8-40:1（重量体积比，即8-40mL甲醇：1g藻粉）（CN1940021A）。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种样品用量更低，反应更为快速的甲酯化方法。
为了实现上述目的，本发明采取的技术方案为：
使用5-10mg微藻藻粉进行直接甲酯化，通过提高甲醇与藻粉比例，在酸催化条件下向藻粉中加入藻粉量400-800倍（重量比）的1-10%酸化甲醇（硫酸或盐酸）溶液，在搅拌混合作用下于在70°C回流反应1-8h，即可快速的获得甲酯化产物。
本发明使用微量的藻粉，在酸催化和高甲醇：藻粉比条件下直接进行甲酯化，获取脂肪酸甲酯可用于气相色谱等分析。
本发明与现有技术相比具有如下优点：
1.藻粉使用量少，5-10mg藻粉即可检测；
2.无需提取藻种油脂，减少了操作步骤；
3.高甲醇：藻粉比与70℃回流反应，同时满足提高反应速度和脂肪酸甲酯化率的要求；
4.缩短样品甲酯化时间，最快可在1-2小时内完成检测大大的节省了时间成本。
本发明具体步骤如下：
1.酸性甲醇溶液配制：向99mL甲醇中加入1mL浓硫酸，混合均匀，备用。
2.甲酯化反应：将藻粉样品置于圆底烧瓶中，加入藻粉量400-800倍（质量比，5mg藻粉对应2.5-5mL质量为2-4g的甲醇）1-10%硫酸甲醇（盐酸甲醇）溶液，在搅拌作用下70℃回流反应1-8小时，完成反应。
附图说明
图1为牟氏角毛藻不同转酯化方法气相色谱图对比。
具体实施方式：
下面通过具体实施例对本发明方法和结果进行说明。
藻种：亚心形四爿藻（Tetraselmis subcordiformis）、湛江等鞭金藻（Isochrysis zhanjiangensis)、牟氏角毛藻（Chaetoceros muelleri）
藻粉的获得：
将藻液4000rpm室温离心5min，弃上清。将获得的藻泥放在60℃的烘箱内烘干16h后研磨成粉。
实施例1：
选用了湛江等鞭金藻（Isochrysis zhanjiangensis）考察微量藻粉进行直接转酯化的可行性。
分别将5mg和10mg的湛江等鞭金藻干藻粉置于10ml烧瓶中，加入1%的硫酸-甲醇溶液5ml（质量为4g），在搅拌混合作用下于70℃回流反应2h.待反应完成后，冷却、加入1ml蒸馏水和2ml正己烷，充分振荡，静置后分层，收集正己烷层，使用气相色谱对其脂肪酸甲酯成分进行分析（采用标准品比对）。
表1.湛江等鞭金藻不同质量藻粉脂肪酸甲酯质量含量比较结果
5mg藻粉 10mg藻粉
组分名 % %
C14:0 23.6±1.4 29.6±1.2
C16:0 10.6±0.1 10.2±0.5
C16:1 1.6±0.7 4.6±1.7
C16:2 7.7±0.1 7.1±0.3
C18:0 0.3±0.2 0.0±0.0
C18:1 16.9±0.7 14.6±0.8
C18:2 6.0±0.2 5.6±0.1
C18:3 12.0±0.3 10.0±0.3
C18:4 17.6±0.4 15.8±0.6
DHA 3.7±1.1 2.5±0.8
实施例2：
选用了亚心形四爿藻（Tetraselmis subcordiformis）考察微量藻粉进行直接转酯化的可行性。
将5mg的亚心形四爿藻干藻粉置于10ml烧瓶中，加入1%的硫酸-甲醇溶液5ml（质量为4g），在搅拌混合作用下于70℃分别回流反应2h和8h.待反应完成后，冷却、加入1ml蒸馏水和2ml正己烷，充分振荡，静置后分层，收集正己烷层，使用气相色谱对其脂肪酸甲酯成分进行分析（采用标准品比对）。
表2.亚心形四爿藻不同反应时间脂肪酸甲酯质量含量比较结果
2h 8h
组分名 % %
C14:0 3.8±1.3 0.9±0.0
C16:0 25.3±1.6 22.7±0.1
C16:1 4.5±1.8 11.5±0.6
C16:2 3.5±0.5 3.1±0.6
C16:4 14.2±1.0 17.1±2.3
C18:0 0.3±0.3 0.2±0.3
C18:1(n-9) 6.1±0.9 4.2±0.5
C18:1(n-7) 5.0±0.5 5.3±0.2
C18:2 8.3±0.5 8.1±0.4
C18:3 24.6±2.3 24.3±1.7
C18:4 4.3±0.8 3.3±0.1
实施例3：
分别将5mg的牟氏角毛藻（Chaetoceros muelleri）干藻粉和使用100mg藻粉提取得到的油脂置于10ml烧瓶中，加入1%的硫酸-甲醇溶液5ml（质量为4g），在搅拌混合作用下于70℃分别回流反应2h.待反应完成后，冷却、加入1ml蒸馏水和2ml正己烷，充分振荡，静置后分层，收集正己烷层，使用气相色谱对其脂肪酸甲酯成分进行分析。

Claims (2)

1.一种微量藻粉快速甲酯化的方法，其特征在于：
将藻粉样品置于容器中，向容器中加入藻粉质量400-800倍的体积浓度1-10％硫酸甲醇溶液或盐酸甲醇溶液，在搅拌作用下回流反应1-8小时，完成反应，其中回流反应温度为65-70℃。
2.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：所使用藻粉是绿藻、金藻、硅藻中一种或二种以上的单细胞藻类干粉。
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