CN115166087A - 一种提纯椰肉中脂肪酸用于特定位点碳同位素分析的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种提纯椰肉中脂肪酸用于特定位点碳同位素分析的方法，属于植物脂肪酸的提取和碳同位素分析方法技术领域，解决了现有脂肪酸提取分离效果不明显、纯度低，不能满足特定位点碳同位素测定条件的技术问题。本发明公开的方法，本文中公开了一种提纯椰肉中脂肪酸用于特定位点碳同位素分析的方法，采用硝酸银硅胶柱层析法纯化待测的脂肪酸甲酯，使用该方法提纯出的碳十六脂肪酸的纯度高达98％以上，同时，该方法提纯效率高，提纯后的碳十六脂肪酸可用于后续的特定位点同位素分析，可以观测其与当地环境气候的响应关系，同时为可进行碳同位素分析的脂肪酸提纯方法提供借鉴，具有良好的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于植物脂肪酸的提取和碳同位素分析方法技术领域，具体涉及一种提纯椰肉中脂肪酸用于特定位点碳同位素分析的方法。
背景技术
碳同位素技术可以研究不同的空间和时间尺度的生态环境机制，是对植物生理状况和生态环境演变的重要研究手段之一。植物体内脂肪酸稳定碳同位素(δ13C)组成不仅记录了植物生长过程中外界环境信息的变化，还可以揭示生物地球化学循环过程，成为研究植物自身生长及与环境间相互关系的重要方法。
同位素分析技术已进入各种化学研究，稳定同位素分析可分为全样品、单个化合物和特定位点三种分析形式，特定位点记录了植物生理过程中更加精准的信息，并且需要用到核磁技术。核磁共振光谱是有机分子结构分析不可或缺的最重要的方法。核磁共振是一种非破坏性的，信息丰富的分析技术，可以帮助研究人员了解分子结构和动力学，可对各种有机物和无机物的成分、结构进行定性定量分析，该方法对待测样品纯度要求很高，一般纯度要求为98％以上。但目前为止，由于植物中组成较为复杂的混合脂肪酸，不仅存在链的长短不同，不饱和度也不同，混合脂肪酸中各组分间的理化性质较为接近，且分子间存在特殊的氢键作用力，脂肪酸的完全分离具有一定困难，现有的脂肪酸分离、纯化的方法通常具有分离效果不明显、溶剂使用量大、纯度不高等缺点，对于椰子中脂肪酸提取以及进行特定位点碳同位素产生了很大限制。
发明内容
为了克服上述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种提纯椰肉中脂肪酸用于特定位点碳同位素分析的方法，用以现有脂肪酸提取分离效果不明显、纯度低，不能满足特定位点碳同位素测定条件的技术问题。
为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案予以实现：
本发明公开了一种提纯椰肉中脂肪酸用于特定位点碳同位素分析的方法，
包括以下步骤：
S1：将椰肉放入NaOH-CH3OH溶液中，在油浴条件下加热回流后冷却至室温，随后进行过滤得到滤液；依次向滤液中加入正己烷、调节pH值、分液后，得到第一有机相；对第一有机相进行处理，得到脂肪酸粗产物；
S2：将脂肪酸粗产物放入BF3-CH3OH溶液中，在油浴条件下加热回流后冷却至室温，随后加入水和正己烷后，进行分液，得到第二有机相；对第二有机相进行处理，得到中间产物，对得到的中间产物采用硝酸银硅胶柱层析法获得脂肪酸甲酯；
S3：对得到的脂肪酸甲酯进行GC-MS和IRMS定性检测，得到单个化合物碳稳定同位素值。
进一步地，S1中，所述椰肉和NaOH-CH3OH溶液的用量比为(100～110)g：(23.0～24.0)mL；所述NaOH-CH3OH溶液的浓度为1mol/L；所述油浴的温度为70℃～80℃，所述加热回流的时间为4h～6h。
进一步地，S1中，椰肉和正己烷的用量比为(100～110)g：(4.5～5.0)mL。
进一步地，S1中，采用HCl溶液、H2SO4溶液或H3PO4溶液调节pH值至1～2。
进一步地，S2中，脂肪酸粗产物和BF3-CH3OH溶液的用量比为(0.10～0.15)g～(1.0～2.5)mL；所述BF3-CH3OH溶液的质量浓度为14％；所述油浴的温度为70℃～75℃，所述加热回流的时间为30min～60min。
进一步地，S2中，所述脂肪酸粗产物、水和正己烷的用量比为(0.10～0.15)g：(10.0～15.0)mL：(30.0～45.0)mL；在第二有机相中加入无水硫酸钠进行干燥处理，得到脂肪酸粗产物。
进一步地，S2中，所述硝酸银硅胶柱层析法的具体步骤为：
首先将硅胶、硝酸银、去离子水和乙醇混合，得到银化硅胶；对得到的中间产物采用银化硅胶进行脂肪酸甲酯的分离，采用洗脱剂按照极性由小到大依次洗脱，得到脂肪酸。
进一步地，所述银化硅胶中硝酸银的质量浓度为5％～20％。
进一步地，S3中，所述GC-MS的检测参数为：进样口温度为200℃～300℃，升温速率为10℃每分钟；载体气体为He气，载体气体的流量为1.5mL/min～2.0min。
进一步地，所述IRMS检测的检测参数为：离子源温度为200℃～300℃，电子能量为50eV～80eV。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本文中公开了一种提纯椰肉中脂肪酸用于特定位点碳同位素分析的方法，采用硝酸银硅胶柱层析法纯化待测的脂肪酸甲酯，使用该方法提纯出的碳十六脂肪酸的纯度高达98％以上，同时，该方法提纯效率高，提纯后的碳十六脂肪酸可用于后续的特定位点同位素分析，可以观测其与当地环境气候的响应关系，同时为可进行碳同位素分析的脂肪酸提纯方法提供借鉴，具有良好的应用前景。
附图说明
图1为硝酸银浓度-洗脱液体积的关系图；
图2为硝酸银浓度-脂肪酸甲酯纯度的关系图；
图3为实施例3和对比例1进行GC-MS和IRMS定性检测的结果图；
其中：a-对比例1得到的实验数据；b-经洗脱剂(正己烷：乙酸乙酯＝80％：20％)洗脱得到的饱和脂肪酸甲酯；c-经洗脱剂(二氯甲烷：乙酸乙酯＝75％：25％)洗脱得到的单不饱和脂肪酸甲酯；d-经洗脱剂(二氯甲烷：乙酸乙酯＝50％：50％)洗脱得到的双不饱和脂肪酸甲酯。
具体实施方式
为使本领域技术人员可了解本发明的特点及效果，以下谨就说明书及权利要求书中提及的术语及用语进行一般性的说明及定义。除非另有指明，否则文中使用的所有技术及科学上的字词，均为本领域技术人员对于本发明所了解的通常意义，当有冲突情形时，应以本说明书的定义为准。
本文描述和公开的理论或机制，无论是对或错，均不应以任何方式限制本发明的范围，即本发明内容可以在不为任何特定的理论或机制所限制的情况下实施。
本文中，所有以数值范围或百分比范围形式界定的特征如数值、数量、含量与浓度仅是为了简洁及方便。据此，数值范围或百分比范围的描述应视为已涵盖且具体公开所有可能的次级范围及范围内的个别数值(包括整数与分数)。
本文中，若无特别说明，“包含”、“包括”、“含有”、“具有”或类似用语涵盖了“由……组成”和“主要由……组成”的意思，例如“A包含a”涵盖了“A包含a和其他”和“A仅包含a”的意思。
本文中，为使描述简洁，未对各个实施方案或实施例中的各个技术特征的所有可能的组合都进行描述。因此，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，各个实施方案或实施例中的各个技术特征可以进行任意的组合，所有可能的组合都应当认为是本说明书记载的范围。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
下列实施例中使用本领域常规的仪器设备。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。下列实施例中使用各种原料，除非另作说明，都使用常规市售产品，其规格为本领域常规规格。在本发明的说明书以及下述实施例中，如没有特别说明，“％”都表示重量百分比，“份”都表示重量份，比例都表示重量比。
实施例1
一种提纯椰肉中脂肪酸用于特定位点碳同位素分析的方法，包括以下步骤：
步骤1：取100g新鲜椰肉于500mL圆底烧瓶中，再加入23mL、1mol/L的NaOH-CH3OH溶液，在80℃油浴条件下加热回流4h；2)待冷却到室温后过滤除掉液体中的杂质；3)往滤液中加入4.5mL正己烷除去椰肉中未皂化部分；4)用1mol/L的HCl溶液调节水相pH至1，转移溶液于分液漏斗中，加入二氯甲烷溶液分层，收集有机相，加入无水硫酸钠干燥，旋蒸得到脂肪酸粗产物。
步骤2：取100mg脂肪酸粗产物于10mL圆底烧瓶中，加入1mL14％的BF3-CH3OH溶液，于75℃油浴条件下加热回流30min；待冷却到室温后加入10mL的H2O转移到分液漏斗中，并加入正己烷(3×10mL)，收集有机相，加入无水硫酸钠干燥得到中间产物，对得到的中间产物采用硝酸银硅胶柱层析法获得脂肪酸；所述硝酸银浓度为5％(w/w)的硝酸银-硅胶，硝酸银-硅胶柱层析以正己烷：乙酸乙酯＝80％：20％；二氯甲烷：乙酸乙酯＝75％：25％；二氯甲烷：乙酸乙酯＝50％：50％为洗脱液，按极性从小到大依次洗脱，每5mL收集一次，得到脂肪酸甲酯；
步骤3：对得到的脂肪酸甲酯进行GC-MS和IRMS定性检测，得到单个化合物碳稳定同位素值。
实施例2
一种提纯椰肉中脂肪酸用于特定位点碳同位素分析的方法，包括以下步骤：
步骤1：取100g新鲜椰肉于500mL圆底烧瓶中，再加入24.0mL、1mol/L的NaOH-CH3OH溶液，在80℃油浴条件下加热回流4h；2)待冷却到室温后过滤除掉液体中的杂质；3)往滤液中加入5.0mL正己烷除去椰肉中未皂化部分；4)用1mol/L的HCl溶液调节水相pH至2，转移溶液于分液漏斗中，加入二氯甲烷溶液分层，收集有机相，加入无水硫酸钠干燥，旋蒸得到脂肪酸粗产物。
步骤2：取100mg脂肪酸粗产物于10mL圆底烧瓶中，加入1mL14％的BF3-CH3OH溶液，于75℃油浴条件下加热回流30min；待冷却到室温后加入10mL的H2O转移到分液漏斗中，并加入正己烷(3×10mL)，收集有机相，加入无水硫酸钠干燥得到中间产物，对得到的中间产物采用硝酸银硅胶柱层析法获得脂肪酸；所述硝酸银浓度为5％(w/w)的硝酸银-硅胶，硝酸银-硅胶柱层析以正己烷：乙酸乙酯＝80％：20％；二氯甲烷：乙酸乙酯＝75％：25％；二氯甲烷：乙酸乙酯＝50％：50％为洗脱液；按极性从小到大依次洗脱，每5mL收集一次，得到脂肪酸甲酯；
步骤3：对得到的脂肪酸甲酯进行GC-MS和IRMS定性检测，得到单个化合物碳稳定同位素值。
实施例3
一种提纯椰肉中脂肪酸用于特定位点碳同位素分析的方法，包括以下步骤：
步骤1：取110g新鲜椰肉于500mL圆底烧瓶中，再加入23.0mL、1mol/L的NaOH-CH3OH溶液，在80℃油浴条件下加热回流5h；2)待冷却到室温后过滤除掉液体中的杂质；3)往滤液中加入5.0mL正己烷除去椰肉中未皂化部分；4)用1mol/L的HCl溶液调节水相pH至2，转移溶液于分液漏斗中，加入二氯甲烷溶液分层，收集有机相，加入无水硫酸钠干燥，旋蒸得到脂肪酸粗产物。
步骤2：取150mg脂肪酸粗产物于10mL圆底烧瓶中，加入2.5mL14％的BF3-CH3OH溶液，于75℃油浴条件下加热回流60min；待冷却到室温后加入15mL的H2O转移到分液漏斗中，并加入正己烷(3×10mL)，收集有机相，加入无水硫酸钠干燥得到中间产物，对得到的中间产物采用硝酸银硅胶柱层析法获得脂肪酸；所述硝酸银浓度为10％(w/w)的硝酸银-硅胶，硝酸银-硅胶柱层析以正己烷：乙酸乙酯＝80％：20％；二氯甲烷：乙酸乙酯＝75％：25％；二氯甲烷：乙酸乙酯＝50％：50％为洗脱液，按极性从小到大依次洗脱，每5mL收集一次，得到脂肪酸甲酯；
步骤3：对得到的脂肪酸甲酯进行GC-MS和IRMS定性检测，得到单个化合物碳稳定同位素值。
实施例4
一种提纯椰肉中脂肪酸用于特定位点碳同位素分析的方法，包括以下步骤：
步骤1：取100g新鲜椰肉于500mL圆底烧瓶中，再加入24mL、1mol/L的NaOH-CH3OH溶液，在75℃油浴条件下加热回流4h；2)待冷却到室温后过滤除掉液体中的杂质；3)往滤液中加入少量正己烷除去椰肉中未皂化部分；4)用1mol/L的HCl溶液调节水相pH值至2，转移溶液于分液漏斗中，加入二氯甲烷溶液分层，收集有机相，加入无水硫酸钠干燥，旋蒸得到脂肪酸粗产物。
步骤2：取100mg脂肪酸粗产物于10mL圆底烧瓶中，加入1mL14％的BF3-CH3OH溶液，于75℃油浴条件下加热回流30min；待冷却到室温后加入10mL的H2O转移到分液漏斗中，并加入正己烷(3×10mL)，收集有机相，加入无水硫酸钠干燥得到中间产物，对得到的中间产物采用硝酸银硅胶柱层析法获得脂肪酸；所述硝酸银浓度为15％(w/w)的硝酸银-硅胶，硝酸银-硅胶柱层析以正己烷：乙酸乙酯＝80％：20％；二氯甲烷：乙酸乙酯＝75％：25％；二氯甲烷：乙酸乙酯＝50％：50％为洗脱液，按极性从小到大依次洗脱，每5mL收集一次，得到脂肪酸甲酯；
步骤3：对得到的脂肪酸进行甲酯GC-MS和IRMS定性检测，得到单个化合物碳稳定同位素值。
实施例5
一种提纯椰肉中脂肪酸用于特定位点碳同位素分析的方法，包括以下步骤：
步骤1：取100g新鲜椰肉于500mL圆底烧瓶中，再加入24mL、1mol/L的NaOH-CH3OH溶液，在80℃油浴条件下加热回流4h；2)待冷却到室温后过滤除掉液体中的杂质；3)往滤液中加入5.0mL正己烷除去椰肉中未皂化部分；4)用1mol/L的H3PO4溶液调节水相pH至2，转移溶液于分液漏斗中，加入二氯甲烷溶液分层，收集有机相，加入无水硫酸钠干燥，旋蒸得到脂肪酸粗产物。
步骤2：取100mg脂肪酸粗产物于10mL圆底烧瓶中，加入1mL14％的BF3-CH3OH溶液，于75℃油浴条件下加热回流30min；待冷却到室温后加入10mL的H2O转移到分液漏斗中，并加入正己烷(3×10mL)，收集有机相，加入无水硫酸钠干燥得到中间产物，对得到的中间产物采用硝酸银硅胶柱层析法获得脂肪酸；所述硝酸银浓度为20％(w/w)的硝酸银-硅胶，硝酸银-硅胶柱层析以正己烷：乙酸乙酯＝80％：20％；二氯甲烷：乙酸乙酯＝75％：25％；二氯甲烷：乙酸乙酯＝50％：50％为洗脱液，按极性从小到大依次洗脱，得到脂肪酸甲酯；
步骤3：对得到的脂肪酸甲酯进行GC-MS和IRMS定性检测，得到单个化合物碳稳定同位素值。
实施例6
一种提纯椰肉中脂肪酸用于特定位点碳同位素分析的方法，包括以下步骤：
步骤1：取110g新鲜椰肉于500mL圆底烧瓶中，再加入23mL、1mol/L的NaOH-CH3OH溶液，在70℃油浴条件下加热回流6h；2)待冷却到室温后过滤除掉液体中的杂质；3)往滤液中加入4.5mL正己烷除去椰肉中未皂化部分；4)用1mol/L的H2SO4溶液溶液调节水相pH至1，转移溶液于分液漏斗中，加入二氯甲烷溶液分层，收集有机相，加入无水硫酸钠干燥，旋蒸得到脂肪酸粗产物。
步骤2：取100mg脂肪酸粗产物于10mL圆底烧瓶中，加入1mL14％的BF3-CH3OH溶液，于70℃油浴条件下加热回流60min；待冷却到室温后加入10mL的H2O转移到分液漏斗中，并加入正己烷(3×15mL)，收集有机相，加入无水硫酸钠干燥得到中间产物，对得到的中间产物采用硝酸银硅胶柱层析法获得脂肪酸；所述硝酸银浓度为5％(w/w)的硝酸银-硅胶，硝酸银-硅胶柱层析以正己烷：乙酸乙酯＝80％：20％；二氯甲烷：乙酸乙酯＝75％：25％；二氯甲烷：乙酸乙酯＝50％：50％为洗脱液，按极性从小到大依次洗脱，每5mL收集一次，得到脂肪酸甲酯；
步骤3：对得到的脂肪酸甲酯进行GC-MS和IRMS定性检测，得到单个化合物碳稳定同位素值。
对比例1
一种进行椰肉中脂肪酸碳同位素分析的方法，包括以下步骤：
步骤1：取100g新鲜椰肉于500mL圆底烧瓶中，再加入23mL、1mol/L的NaOH-CH3OH溶液，在70℃油浴条件下加热回流6h；待冷却到室温后过滤除掉液体中的杂质；往滤液中加入4.5mL正己烷除去椰肉中未皂化部分；用1mol/L的HCl溶液溶液调节水相pH至1，转移溶液于分液漏斗中，加入二氯甲烷溶液分层，收集有机相，加入无水硫酸钠干燥，旋蒸得到脂肪酸粗产物。
步骤2：取100mg脂肪酸粗产物于10mL圆底烧瓶中，加入1mL14％的BF3-CH3OH溶液，于70℃油浴条件下加热回流60min；待冷却到室温后加入10mL的H2O转移到分液漏斗中，并加入正己烷(3×15mL)，收集有机相，加入无水硫酸钠干燥得到中间产物；
步骤3：对得到的中间产物进行GC-MS和IRMS定性检测，得到单个化合物碳稳定同位素值。
以上实施例中进行GC-MS的检测参数为：进样口温度为200℃～300℃，升温速率为10℃每分钟；载体气体为He气，载体气体的流量为1.5mL/min～2.0min；IRMS检测的检测参数为：离子源温度为200℃～300℃，电子能量为50eV～80eV。
图1横坐标表示硝酸银-硅胶中硝酸银所占的质量比例，纵坐标表示脂肪酸甲酯开始出现时所需要洗脱液的体积；图2横坐标表示硝酸银-硅胶中硝酸银所占的质量比例，纵坐标表示所能得到的脂肪酸甲酯的纯度(GC-MS面积归一法)。结合两组数据对比不同硝酸银浓度时得出结果，当硝酸银质量分数(浓度)为10％时，可以有效地对脂肪酸进行分离，且得到的纯度很高，同时成本相对较低。
图3所示为实施例3和对比例1进行GC-MS和和IRMS定性检测的结果图，从图3中可以看出经过三种极性大小不同的洗脱剂可以将所得混合脂肪酸甲酯依次分离开，依次得到饱和的脂肪酸甲酯、单不饱和脂肪酸甲酯、双不饱和脂肪酸甲酯，证明本方法下的硝酸银硅胶柱层析法纯化待测的脂肪酸甲酯效果好，其纯度达到测定特定位点碳同位素值的条件。
以上内容仅为说明本发明的技术思想，不能以此限定本发明的保护范围，凡是按照本发明提出的技术思想，在技术方案基础上所做的任何改动，均落入本发明权利要求书的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种提纯椰肉中脂肪酸用于特定位点碳同位素分析的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1：将椰肉放入NaOH-CH3OH溶液中，在油浴条件下加热回流后冷却至室温，随后进行过滤得到滤液；向滤液中加入正己烷后，调节pH值、分液，得到第一有机相；对第一有机相进行处理，得到脂肪酸粗产物；
S2：将脂肪酸粗产物放入BF3-CH3OH溶液中，在油浴条件下加热回流后冷却至室温，随后加入水和正己烷后，进行分液，得到第二有机相；对第二有机相进行处理，得到中间产物，对得到的中间产物采用硝酸银硅胶柱层析法获得脂肪酸甲酯；
S3：对得到的脂肪酸甲酯进行GC-MS和IRMS定性检测，得到单个化合物碳稳定同位素值。
2.根据权利要求1所述的一种提纯椰肉中脂肪酸用于特定位点碳同位素分析的方法，其特征在于，S1中，所述椰肉和NaOH-CH3OH溶液的用量比为(100～110)g：(23.0～24.0)mL；所述NaOH-CH3OH溶液的浓度为1mol/L；所述油浴的温度为70℃～80℃，所述加热回流的时间为4h～6h。
3.根据权利要求1所述的一种提纯椰肉中脂肪酸用于特定位点碳同位素分析的方法，其特征在于，S1中，椰肉和正己烷的用量比为(100～110)g：
(4.5～5.0)mL。
4.根据权利要求1所述的一种提纯椰肉中脂肪酸用于特定位点碳同位素分析的方法，其特征在于，S1中，采用HCl溶液、H2SO4溶液或H3PO4溶液调节pH值至1～2。
5.根据权利要求1所述的一种提纯椰肉中脂肪酸用于特定位点碳同位素分析的方法，其特征在于，S2中，脂肪酸粗产物和BF3-CH3OH溶液的用量比为(0.10～0.15)g～(1.0～2.5)mL；所述BF3-CH3OH溶液的质量浓度为14％；所述油浴的温度为70℃～75℃，所述加热回流的时间为30min～60min。
6.根据权利要求1所述的一种提纯椰肉中脂肪酸用于特定位点碳同位素分析的方法，其特征在于，S2中，所述脂肪酸粗产物、水和正己烷的用量比为(0.10～0.15)g：(10.0～15.0)mL：(30.0～45.0)mL；在第二有机相中加入无水硫酸钠进行干燥处理，得到脂肪酸粗产物。
7.根据权利要求1所述的一种提纯椰肉中脂肪酸用于特定位点碳同位素分析的方法，其特征在于，S2中，所述硝酸银硅胶柱层析法的具体步骤为：
首先将硅胶、硝酸银、去离子水和乙醇混合，得到银化硅胶；对得到的中间产物采用银化硅胶进行脂肪酸甲酯的分离，采用洗脱剂按照极性由小到大依次洗脱，得到脂肪酸。
8.根据权利要求7所述的一种提纯椰肉中脂肪酸用于特定位点碳同位素分析的方法，其特征在于，所述银化硅胶中硝酸银的质量浓度为5％～20％。
9.根据权利要求1所述的一种提纯椰肉中脂肪酸用于特定位点碳同位素分析的方法，其特征在于，S3中，所述GC-MS的检测参数为：进样口温度为200℃～300℃，升温速率为10℃每分钟；载体气体为He气，载体气体的流量为1.5mL/min～2.0min。
10.根据权利要求1所述的一种提纯椰肉中脂肪酸用于特定位点碳同位素分析的方法，其特征在于，所述IRMS检测的检测参数为：离子源温度为200℃～300℃，电子能量为50eV～80eV。
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