CN108614056A - 一种落叶水浸出液中脂肪酸类物质的测定方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种落叶水浸出液中脂肪酸类物质的测定方法，包括以下步骤：制备落叶水浸出液；采用正己烷萃取所述落叶水浸出液，得到脂肪酸类物质溶液；将所述脂肪酸类物质溶液经过氢氧化钾甲醇溶液皂化后，再采用三氟化硼甲醇溶液进行甲酯化，然后采用气相色谱‑质谱联用仪测定出脂肪酸类物质的浓度、检出限与回收率。本发明所述落叶水浸出液中脂肪酸类物质的测定方法具有简便易行、操作性强、耗时短、精确度高的特点，解决了现有技术中对于落叶关键化学成分的提取、研究有限，无法充分发挥出其利用价值的问题。
Description
技术领域
本发明涉及分析化学技术领域，尤其涉及一种人面子落叶水浸出液中脂肪酸类物质的测定方法。
背景技术
落叶是植物为了抵抗寒冷的冬天，而采取的自我保护的措施，落叶植物冬季要休眠，叶片要蒸发，又不抗冻，所以纷纷落下，这是植物为适应环境而进化的必然结果。据统计，中等大小的城市每年冬季节落叶量能达到600多吨，各公园区落叶量也能达到近百万吨。目前，通常对落叶的处理方式有：作为垃圾，直接焚烧；放置垃圾场填埋；落叶归根，作堆肥处理，进而美化了环境，或作其它的资源化利用。然而，目前对落叶的化学成分提取的研究相对较少，尤其是对人类有利用价值的化学成分的提取利用的研究并不多，如药用、食品、工业化、农业化利用等。乔木落叶具有材料来源广、数量大、经济成本低、生态相对友好的特点。
人面子（Dracontomelon duperreanum）为漆树科植物，又称人面树，为常绿大乔木，高达20余米。主要分布于广东、海南、广西、云南等地。人面子果实、果核、叶及根皮均有药用，叶味苦、酸、性凉，具有解毒、敛疮等功能，可主治烂疮、褥疮等。有人从人面子根中，提取了一些含有多种挥发性的油类物质。如人面子根挥发油的主要成分为正十六烷酸，十六烷酸为有效的灭蚊剂；胡椒胺为一种非常重要的医药中间体，可合成抗氧化剂和药物中间体芝麻酚，制备抗菌药奥索利酸和西诺沙星；吡咯衍生物单体是精细化工产品的重要中间体，在医药、食品、农药、日用化学品中被广泛应。
人面子乔木是中国南方地区分布较广的一种高大乔木植物，种植面积广、栽培粗放、寿命长等优点。一直以来，人面子果实、果核、叶及根皮等均可有药用。然而，现有技术中对于落叶关键化学成分的提取研究有限，无法充分发挥出利用价值。
因此，现有技术还有待于改进和发展。
发明内容
鉴于上述现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种人面子落叶水浸出液中脂肪酸类物质的测定方法，旨在解决现有技术中对于落叶关键化学成分的提取、研究有限，无法充分发挥出利用价值的问题。
本发明的技术方案如下：
一种落叶水浸出液中脂肪酸类物质的测定方法，其中，包括：
步骤A、制备落叶水浸出液；
步骤B、采用正己烷萃取所述落叶水浸出液，得到脂肪酸类物质溶液；
步骤C、将所述脂肪酸类物质溶液经过氢氧化钾甲醇溶液皂化后，再采用三氟化硼甲醇溶液进行甲酯化，然后采用气相色谱-质谱联用仪测定出脂肪酸类物质的浓度、检出限与回收率。
所述的落叶水浸出液中脂肪酸类物质的测定方法，其中，所述步骤A具体包括：
步骤A1、将人面子落叶揉碎成碎叶片；
步骤A2、将碎叶片浸泡于蒸馏水中，得到混合液；
步骤A3、将所述混合液通过滤膜进行抽滤，制备得到落叶水浸出液。
所述的落叶水浸出液中脂肪酸类物质的测定方法，其中，所述步骤B具体包括：
步骤B1、向落叶水浸出液中加入正己烷，然后依次进行涡旋处理和超声处理；
步骤B2、重复所述步骤B1多次，然后进行氮吹处理, 得到脂肪酸类物质溶液。
所述的落叶水浸出液中脂肪酸类物质的测定方法，其中，所述步骤C具体包括：
步骤C1、取1 ml所述脂肪酸类物质溶液于试管中，加入氢氧化钾甲醇溶液2 ml，在温度为60 ℃的环境下振荡20 min，冷却至室温；
步骤C2、向试管中加入1 ml三氟化硼甲醇溶液，温度为60 ℃的环境下振荡20 min，冷却至室温；
步骤C3、向试管中加入2 ml的正己烷，摇匀，静置分层，取上清液采用气相色谱-质谱联用仪测定落叶水浸出液中脂肪酸类物质的浓度、检出限与回收率。
所述的落叶水浸出液中脂肪酸类物质的测定方法，其中，所述气相色谱-质谱联用仪测试的条件：
色谱柱：石英毛细管柱，长度×内径×膜厚为30 m×0.25 mm×0.25 μm；进样口温度：250 ℃；检测器温度：250 ℃；柱箱程序升温：初始温度为150 ℃，保持3 min，然后以5 ℃/min升温到230 ℃，保持1 min；载气流速：1.0 mL/min；进样方式：不分流；进样量：1 μl。
所述的落叶水浸出液中脂肪酸类物质的测定方法，其中，所述滤膜的孔径为0.22μm。
所述的落叶水浸出液中脂肪酸类物质的测定方法，其中，所述三氟化硼甲醇溶液的质量浓度为14%。
所述的落叶水浸出液中脂肪酸类物质的测定方法，其中，所述氢氧化钾甲醇溶液的浓度为0.8 mol/L。
所述的落叶水浸出液中脂肪酸类物质的测定方法，其中，所述落叶水浸出液的贮存温度为0～4 ℃。
所述的落叶水浸出液中脂肪酸类物质的测定方法，其中，所述脂肪酸类物质为棕榈酸、硬脂酸、油酸中的一种或多种。
有益效果：本发明提供一种落叶水浸出液中脂肪酸类物质的测定方法实现了落叶水浸出液中脂肪酸类物质的浓度、检出限和回收率测定，具有简便易行、操作性强、耗时短、精确度高的特点。同时植物落叶来源广泛，本发明所述测定方法具有极大的潜在实用价值。
具体实施方式
本发明提供一种人面子落叶水浸出液中脂肪酸类物质的测定方法，为使本发明的目的、技术方案及效果更加清楚、明确，以下对本发明进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
本发明提供一种落叶水浸出液中脂肪酸类物质的测定方法，包括以下步骤：
步骤A、制备落叶水浸出液；
步骤B、采用正己烷萃取所述落叶水浸出液，得到脂肪酸类物质溶液；
步骤C、将所述脂肪酸类物质溶液经过氢氧化钾甲醇溶液皂化后，再采用三氟化硼甲醇溶液进行甲酯化，最后采用气相色谱-质谱联用仪（GC-MS）测定出脂肪酸类物质的浓度、检出限与回收率。
本发明所述落叶水浸出液中脂肪酸类物质的测定方法，实现了对落叶水浸出液中脂肪酸类物质的浓度、检出限和回收率测定，具有简便易行、操作性强、耗时短、精确度高的特点，解决了现有技术中对于落叶中关键化学成分的提取、研究有限，无法充分发挥出其利用价值的问题。同时植物落叶来源广泛，本发明所述测定方法具有极大的潜在实用价值。
本发明所述步骤A，具体包括:
步骤A1、将人面子落叶揉碎成碎叶片；
所述步骤A1具体为，将收集的人面子落叶用自来水冲洗3～5 次，在恒温干燥箱中进行烘干，将烘干的人面子落叶揉碎成碎叶片。
步骤A2、将碎叶片浸泡于蒸馏水中，得到混合液；
所述步骤A2具体为，将50 g碎叶片浸泡于装有500 mL蒸馏水的锥形瓶中，密封后，放置在26 ℃的人工气候箱中约5 d，制备得到混合液。
步骤A3、将所述混合液通过滤膜进行抽滤，制备得到落叶水浸出液。
所述步骤A3具体为，将混合液通过滤膜进行抽滤，制备得到浸出液初始浓度为0.1g/mL（落叶干重与水的体积比）的落叶水浸出液，并贮存于冰箱中冷藏待用。
优选的，所述滤膜的孔径为0.22 μm。本发明通过采用孔径为0.22 μm的滤膜对混合液进行抽滤，能够消除落叶中由于微生物的存在而对检测结果造成的不利影响。
优选的，所述落叶水浸出液的贮存温度为0～4 ℃。本发明将制备得到的落叶水浸出液贮存于温度为0～4 ℃的冰箱中待用，有利于保证溶液的稳定性，防止微生物在溶液中滋生从而影响测定的结果。
所述步骤B具体包括：
步骤B1、向落叶水浸出液中加入正己烷，然后依次进行涡旋处理和超声处理；
所述步骤B1具体为，向10 mL落叶水浸出液中加入10 mL正己烷，然后依次进行涡旋处理1 min和超声处理15 min。
所述步骤B1是通过采用在落叶水浸出液中加入正己烷对落叶浸出液中的脂肪酸类物质进行萃取，最终得到脂肪酸类物质溶液。其中，所述落叶浸出液与正己烷的体积比为1:1，所述体积比能够有效提高对落叶水浸出液中的脂肪酸类物质萃取效率。
步骤B2、重复所述步骤B1多次，然后进行氮吹处理, 得到脂肪酸类物质溶液。
所述步骤B2具体为，重复所述步骤B1多次（如2-3次），然后进行氮吹至约4 mL，定容至5 mL，得到脂肪酸类物质溶液。
所述步骤B2是通过对落叶水浸出液萃取多次，能够充分的提取落叶水浸出液中的脂肪酸类物质，提高对脂肪酸类物质测定的准确性。优选的，所述正己烷对落叶水浸出液进行重复萃取3次。
所述步骤C具体包括：
步骤C1、取1 ml所述脂肪酸类物质溶液于具塞刻度试管中，然后加入氢氧化钾甲醇溶液2 ml，在温度为60 ℃的水浴恒温振荡器中振荡20 min，冷却至室温；
步骤C2、向上述试管中加入三氟化硼甲醇溶液1 ml，在温度为60 ℃的水浴恒温振荡器中振荡20 min，取出，冷却至室温；
步骤C3、向上述试管中加入正己烷2 ml，摇匀，静置分层，取上层清液进行GC-MS测定脂肪酸类物质的浓度、检出限与回收率。
本发明所述脂肪酸类物质为棕榈酸、硬脂酸、油酸中的一种或多种。所述棕榈酸、硬脂酸、油酸在人面子落叶中含量较大，且具有较大的商业用途。
其中，所述脂肪酸类物质的浓度、检出限与回收率的测定具体包括：
1、鉴定脂肪酸类物质
取所述上层清液用DB-WAX色谱柱分离，然后进行谱图分析，并参考美国国家标准及技术研究所谱库，对面积相对较大的峰进行谱图分析，鉴定出脂肪酸类物质的种类。
所述脂肪酸类物质为棕榈酸、硬脂酸、油酸。
2、标准溶液配制
标准储备液配制：以正己烷为溶剂，配制多种不同浓度的脂肪酸类物质的标准溶液。
3、加标的脂肪酸类物质溶液配制
在所述脂肪酸类物质溶液中加入相应的所述标准溶液，得到加标后的脂肪酸类物质溶液。
4、检出限（MDL）的测定
401、仪器检测极限测定：校正GC-MS，配制一个较小浓度的脂肪酸类物质溶液，然后进行GC-MS测定，观察GC-MS仪器的S/N。不断稀释脂肪酸类物质溶液，直到GC-MS仪器的S/N=3左右，此时的脂肪酸类物质溶液的浓度即为仪器检测极限。
402、根据GC-MS仪器的检测极限、取样量及定容体积进行预估方法检出限（MDL）。
403、添加标准溶液到7个空白样品中作为待测物标准溶液，然后对待测物标准溶液进行GC-MS测定，使脂肪酸类物质在待测物标准溶液中的最终理论浓度为预估MDL的1至5倍，然后进行计算7次测定值的标准偏差S，并计算方法检测极限MDL=3S，确认MDL预估值的合理性。
5、脂肪酸类物质的浓度和回收率的测定
（1）用标准溶液校正仪器，作标准工作曲线；
（2）选取4个不同浓度的脂肪酸类物质溶液进行GC-MS测定；
（3）选取4个不同浓度的加标的脂肪酸类物质溶液进行GC-MS测定；
（4）分析谱图，计算得到脂肪酸类物质的浓度和回收率。
优选的，所述气相色谱-质谱联用仪测试的条件：
色谱柱：石英毛细管柱，长度×内径×膜厚为30 m×0.25 mm×0.25 μm；进样口温度：250 ℃；检测器温度：250 ℃；柱箱程序升温：初始温度为150 ℃，保持3 min，然后以5 ℃/min升温到230 ℃，保持1 min；载气流速：1.0 mL/min；进样方式：不分流；进样量：1 μl。
本发明通过合理控制检测器温度以及升温程序，有利于提高对脂肪酸类物质测定的准确性。
优选的，所述三氟化硼甲醇溶液的质量浓度为14%。所述浓度的三氟化硼甲醇溶液有利于提高对落叶水浸出液的皂化程度。
优选的，所述氢氧化钾甲醇溶液的浓度为0.8 mol/L。所述浓度的氢氧化钾甲醇溶液能够有效提高对落叶浸出液中脂肪酸类物质的甲酯化效率。
下面通过具体的实施例对本发明的技术方案进行说明。
实施例1
本实施例的实验试剂为：正己烷-色谱纯、氢氧化钾-分析纯、甲醇-色谱纯、三氟化硼甲醇溶液-质量浓度为14%、氢氧化钾甲醇溶液-0.8 mol/L、十八烷酸（硬脂酸）-纯度＞99.0%、十八碳烯酸（顺-9）/油酸-纯度＞99.0%、十六烷酸/棕榈酸-纯度＞99.0%。
实验所用器皿和仪器为：电子天平(精确到0.0001g)、可控温超声波发生器-频率为（40±5）KHz、具塞刻度试管、移液管、离心装置、容量瓶（5、10、25、50ml和100ml）、GC-MS(7890A-5975C)。
1、制备人面子落叶水浸出液
将收集的人面子落叶用自来水冲洗4 次，在温度为40 ℃的恒温干燥箱下烘干5 d，将干燥的落叶揉碎成碎叶片；
将50 g碎叶片浸泡于装有500 mL蒸馏水的1 L锥形瓶中，密封后，放置在26 ℃的人工气候箱中约5 d后，制备得到混合液；
将混合液通过孔径为0.22 μm的滤膜进行抽滤，制备得到浸出液初始浓度为0.1 g/mL（落叶干重与水的体积比）的落叶水浸出液，并贮存于温度为4 ℃得到冰箱中冷藏待用；
2、制备脂肪酸类物质溶液
向10 mL落叶水浸出液中加入10 mL正己烷进行萃取，然后进行涡旋振荡处理1 min，超声处理15 min；
重复上述萃取3次，然后进行氮吹至约4 mL，定容至5 mL，得到脂肪酸类物质溶液。
3、通过GC-MS测定落叶水浸出液中脂肪酸类物质的浓度、检出限与回收率
取脂肪酸类物质溶液于具塞刻度试管中，然后加入氢氧化钾甲醇溶液2 ml，在温度为60 ℃的水浴恒温振荡器中振荡20 min，冷却至室温，接着加入三氟化硼甲醇溶液1 ml，在温度为60 ℃的水浴恒温振荡器中振荡20 min，取出，冷却至室温，加入正己烷2 ml，摇匀，静置分层，取上层清液进行GC-MS测定。
3.1、鉴定脂肪酸类物质
取所述上层清液用DB-WAX色谱柱分离，然后进行谱图分析，并参考美国国家标准及技术研究所谱库，鉴定得到人面子落叶浸出液中包含棕榈酸、硬脂酸、油酸三种脂肪酸类物质。
3.2配制标准溶液
（1）配制标准储备液：以正己烷为溶剂，分别配制浓度均为1000 ug/ml的棕榈酸、硬脂酸、油酸的标准储备液；
（2）配制标准中间液：取10ml上述标准储备液用正己烷定容到100ml容量瓶中，得到浓度为100 ug/ml的标准中间液；
（3）校准工作溶液：采用正己烷为溶剂，由标准溶液配制5个合适浓度的校准工作溶液；
（4）标准工作溶液衍生化：取各个浓度点的校准工作溶液1 ml，按所述步骤（3）进行衍生化，获得棕榈酸、硬脂酸、油酸的不同浓度的标准工作溶液。
3.3配制加标脂肪酸类物质溶液
（1）向脂肪酸类物质溶液1ml加入浓度为100 ug/ml相应的标准溶液100 ul；
（2）加入溶剂正己烷，配制5个合适浓度的加标脂肪酸类物质溶液。
3.4检出限的测定
（1）仪器检测极限测定：校正GC-MS仪器，配制浓度为0.2 mg/L的棕榈酸溶液，然后进行GC-MS检测，观察GC-MS仪器的S/N=3左右，此时的棕榈酸溶液的浓度即为仪器检测极限。本实施例的棕榈酸的仪器检测限为0.2 mg/L。采用与棕榈酸的仪器检测限相同的方法测定硬脂酸和油酸的仪器检测限均为0.2 mg/L。
（2）根据GC-MS仪器的检测极限、取样量及定容体积进行预估方法检出限（MDL），预估得到棕榈酸、硬脂酸和油酸的方法检出限为0.2 mg/L。
（3）添加标准溶液到7个空白样品中，使相应的脂肪酸类物质在溶液中的最终理论浓度为预估MDL的1至5倍，然后进行计算7次测定值的标准偏差S，计算方法检测极限MDL=3S，确认MDL预估值的合理性。通过实验并计算得出棕榈酸、硬脂酸和油酸的MDL均<0.2mg/L，符合要求。
3.5棕榈酸、硬脂酸和油酸的浓度和回收率的测定
（1）采用标准溶液校正仪器，作标准工作曲线；
（2）分别取1ml的 4个不同浓度的脂肪酸类物质溶液于刻度试管中，然后进行GC-MS测试；
（3）分别取1ml的 4个不同浓度的加标脂肪酸类物质溶液于刻度试管中，然后进行GC-MS测试；
（4）测试记录数据如下表所示，通过计算得到棕榈酸、油酸和油酸的浓度和回收率。其中，样品中棕榈酸含量为2.99 mg/L，硬脂酸含量为1.52 mg/L，油酸含量为10.85 mg/L；样品加标后油酸加标回收率在70%以上，其他两种均在80%以上。
综上所述，本发明所述落叶水浸出液中脂肪酸类物质的测定方法，实现了对落叶水浸出液中脂肪酸类物质的浓度、检出限和回收率测定，具有简便易行、操作性强、耗时短、精确度高的特点，解决了现有技术中对于落叶关键化学成分的提取、研究有限，无法充分发挥出利用价值的问题。同时植物落叶来源广泛，本发明所述测定方法具有一定的潜在实用价值。
应当理解的是，本发明的应用不限于上述的举例，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。
Claims (10)
1.一种落叶水浸出液中脂肪酸类物质的测定方法，其特征在于，包括：
步骤A、制备落叶水浸出液；
步骤B、采用正己烷萃取所述落叶水浸出液，得到脂肪酸类物质溶液；
步骤C、将所述脂肪酸类物质溶液经过氢氧化钾甲醇溶液皂化后，再采用三氟化硼甲醇溶液进行甲酯化，最后采用气相色谱-质谱联用仪测定出脂肪酸类物质的浓度、检出限与回收率。
2.根据权利要求1所述的落叶水浸出液中脂肪酸类物质的测定方法，其特征在于，所述步骤A具体包括：
步骤A1、将人面子落叶揉碎成碎叶片；
步骤A2、将碎叶片浸泡于蒸馏水中，得到混合液；
步骤A3、将所述混合液通过滤膜进行抽滤，制备得到落叶水浸出液。
3.根据权利要求1所述的落叶水浸出液中脂肪酸类物质的测定方法，其特征在于，所述步骤B具体包括：
步骤B1、向落叶水浸出液中加入正己烷，然后依次进行涡旋处理和超声处理；
步骤B2、重复所述步骤B1多次，然后进行氮吹处理, 得到脂肪酸类物质溶液。
4.根据权利要求1所述的落叶水浸出液中脂肪酸类物质的测定方法，其特征在于，所述步骤C具体包括：
步骤C1、取1 ml所述脂肪酸类物质溶液于试管中，加入氢氧化钾甲醇溶液2 ml，在温度为60 ℃的环境下振荡20 min，冷却至室温；
步骤C2、向上述试管中加入1 ml三氟化硼甲醇溶液，在温度为60 ℃的环境下振荡20min，冷却至室温；
步骤C3、向上述试管中加入2 ml的正己烷，摇匀，静置分层，取上清液采用气相色谱-质谱联用仪测定脂肪酸类物质的浓度、检出限与回收率。
5.根据权利要求1所述的落叶水浸出液中脂肪酸类物质的测定方法，其特征在于，所述气相色谱-质谱联用仪测试的条件：
色谱柱：石英毛细管柱，长度×内径×膜厚为30 m×0.25 mm×0.25 μm；进样口温度：250 ℃；检测器温度：250 ℃；柱箱程序升温：初始温度为150 ℃，保持3 min，然后以5 ℃/min升温到230 ℃，保持1 min；载气流速：1.0 mL/min；进样方式：不分流；进样量：1 μl。
6.根据权利要求1所述的落叶水浸出液中脂肪酸类物质的测定方法，其特征在于，所述滤膜的孔径为0.22 μm。
7.根据权利要求1所述的落叶水浸出液中脂肪酸类物质的测定方法，其特征在于，所述三氟化硼甲醇溶液的质量浓度为14%。
8.根据权利要求1所述的落叶水浸出液中脂肪酸类物质的测定方法，其特征在于，所述氢氧化钾甲醇溶液的浓度为0.8 mol/L。
9.根据权利要求1所述的落叶水浸出液中脂肪酸类物质的测定方法，其特征在于，所述落叶水浸出液的贮存温度为0～4 ℃。
10.根据权利要求1所述的落叶水浸出液中脂肪酸类物质的测定方法，其特征在于，所述脂肪酸类物质为棕榈酸、硬脂酸、油酸中的一种或多种。
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| CN115166087A (zh) * | 2022-07-07 | 2022-10-11 | 陕西科技大学 | 一种提纯椰肉中脂肪酸用于特定位点碳同位素分析的方法 |
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