CN104764827B - 一种番茄植株顶芽内源激素含量的测定方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种番茄植株顶芽内源激素含量的测定方法，包括以下步骤：1)供试番茄顶芽样品前处理；2)配制流动相、设置色谱条件；3)标准液的制备；4)专属性考察；5)线性关系考察；6)样品含量测定；步骤1)的方法包括提取、石油醚萃取后进行减压蒸发，再调节pH，并经乙酸乙酯萃取后，最后经二次减压蒸发制成样品待测液；步骤2)中流动相为甲醇与0.075％冰乙酸配制而成。本发明提供的HPLC法测定番茄顶芽内源激素含量的方法，可快速、准确、同时测定4种植物内源激素的含量，具有测定快速、高效、高灵敏度、高自动化的特点；进行加标回收率实验，平均回收率为99.85％，RSD小于1.56％，符合激素测定要求。
Description
技术领域
本发明涉及农学中作物内源激素技术领域，具体涉及一种用于高效液相色谱法(HPLC)测定番茄植株顶芽内源激素含量的方法。
背景技术
番茄(Lycopersicon esculentum)是世界和中国主要设施作物之一，因其口味佳、营养丰富而深受广大消费者的喜爱。我国设施番茄栽培面积及产量均居世界首位。目前关于设施番茄的科学研究，多集中在形态指标、光合特性及干物质分配等方面。通过分子机理的研究，深入认识植物激素调控设施番茄生长、发育及其对环境适应的机制，具有重要的科学意义。
植物激素(plant hormone,PH)是指在植物体的某一部位合成，可转移到其他部位，并对植物的生长发育具有显著调节作用的微量有机物，亦称植物天然激素或内源激素。其特点是：(1)内源性：植物自身合成；(2)能从合成部位运往作用部位；(3)在极低浓度下发挥作用：参与细胞分裂与伸长、组织与器官分化、开花与结实、成熟与衰老、休眠与萌发等生理过程。生长素、赤霉素、细胞分裂素和脱落酸是植物体内四种重要的生长激素；植物内源激素种类多，含量甚微，且易被破坏。
目前关于番茄顶芽和叶片的内源激素测定方法有间接酶联免疫吸附法(ELISA)(生吉萍等，2000；乔志霞，2004；阮英，2005；朱延姝和冯辉，2005；贺忠群等，2010)，高效液相色谱法(High Performance Liquid Chromatography，简称HPLC)是一种区别于经典液相色谱，基于仪器方法的高效能分离手段，因其高速、高效、高灵敏度、高自动化的特点，广泛用于各个领域，也是目前用于番茄内源激素测定的重要方法。目前关于利用高效液相色谱法测定番茄顶芽的内源激素的方法未见报道，本发明主要解决了在利用高效液相色谱法测定番茄顶芽激素时，探索番茄顶芽样品前处理方法、流动相的选择和色谱条件，对成功利用HPLC测定植物激素提供一种可靠快速方法。
已有番茄顶芽内源激素测定方法是间接酶联免疫吸附法(ELISA)，其基本方法是将已知的抗原或抗体吸附在固相载体(聚苯乙烯微量反应板)表面，使酶标记的抗原抗体反应在固相表面进行，用洗涤法将液相中的游离成分洗除。但需要购买酶联免疫试剂盒，对试验条件高。高效液相色谱法测定快速、高效、高灵敏度、高自动化的特点，但对配制流动相、设置色谱条件要求较高，目前没有一种适合高效液相色谱法测定番茄顶芽内源激素的样品前处理、流动相、设置色谱条件的方法。
发明内容
发明目的：为了克服现有技术中存在的不足，本发明提供一种适合高效液相色谱法测定番茄顶芽内源激素含量的样品前处理、流动相及设置色谱条件的方法，具有测定快速、高效、高灵敏度、高自动化的特点。
技术方案：为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
一种番茄植株顶芽内源激素含量的测定方法，包括以下步骤：
1)供试番茄顶芽样品前处理；2)配制流动相、设置色谱条件；3)标准液的制备；4)专属性考察；5)线性关系考察；6)样品含量测定；
所述步骤1)的方法包括提取、石油醚萃取后进行减压蒸发，再调节pH，并经乙酸乙酯萃取后，最后经二次减压蒸发制成样品待测液；
所述步骤2)中流动相为甲醇与0.075％冰乙酸配制而成；
所述标准液和所述样品含量测定的植物激素包括IAA、ZT、ABA和GA3。
进一步的，在本发明中，所述步骤1)的具体方法包括：
1-1)提取：供试番茄顶芽样品加入冷甲醇中，于4℃下静置16h浸提，抽滤得清液，得粗提取液；
1-2)石油醚萃取：将所述粗提取液用等体积石油醚萃取，弃去醚相，合并水相；
1-3)减压蒸发：将步骤1-2)所得的所述水相在37℃下旋转蒸发至所述水相体积的1/3～1/4，得一次浓缩液；
1-4)调节pH：将所述一次浓缩液调节pH至2.75～2.85之间；
1-5)乙酸乙酯萃取：将调节好pH的一次浓缩液用等体积乙酸乙酯萃取，弃去水相，合并酯相；
1-6)二次减压蒸发：将步骤1-5)所得的所述酯相在37℃下旋转蒸发至所述酯相体积的1/4～1/5，得二次浓缩液，用甲醇定容至所述二次浓缩液体积的2倍，制成样品待测液，保存于4℃下棕色瓶中，待测。
进一步的，在本发明中，所述步骤2)中所述流动相为：甲醇与0.075％冰乙酸按体积比为45：55配制流动相。
进一步的，在本发明中，所述步骤2)中，色谱条件设置为检测波长210nm，流速为0.7mL/min，进样量为20μL。
进一步的，在本发明中，步骤3)中，所述标准液包括：0.1g/L的IAA标准液、0.001g/L的ZT标准液、0.001g/L的ABA标准液和0.01g/L的GA3标准液；将所述标准液按照不同浓度配比，配制成系列浓度梯度的标准混合溶液，4℃保存。
进一步的，在本发明中，所述步骤4)中，在步骤2)所述的色谱条件下，专属性考察包括对所述番茄顶芽样品中的IAA、ZT、ABA和GA3进行HPLC分离检测。
进一步的，在本发明中，所述步骤5)的具体方法为：分别量取经所述步骤3)制成的IAA、ZT、ABA和GA3标准液各1mL，在10mL的棕色容量瓶中用甲醇定容，过滤、进样并检测，以4种混标峰面积与相应质量浓度进行线性回归分析。
进一步的，在本发明中，所述步骤6)的具体方法为：将步骤1)制成的所述样品待测液，过滤进样，按外标法以峰面积计算所述番茄顶芽样品中IAA、ZT、ABA和GA3的含量。
进一步的，在本发明中，完成所述步骤6)后，进行加标回收率试验，具体方法为：分别配制0.01g/L的IAA、ZT、ABA和GA3二号标准液，4℃保存；将步骤1)制成的所述样品待测液中分别加入等体积的所述二号标准液，按外标法以峰面积测定植物激素含量，计算加标回收率。
有益效果：本发明提供的高效液相色谱法测定番茄顶芽内源激素含量的方法，可快速、准确、同时测定4种植物内源激素(IAA、ZT、ABA和GA3)的含量，具有测定快速、高效、高灵敏度、高自动化的特点，填补了现有技术中缺乏高效液相色谱法测定番茄顶芽激素的测定方法的空白，为此领域的技术人员提供了应用基础和提示；此外，进行加标回收率实验，平均回收率为99.85％，RSD小于1.56％，符合激素测定要求。
附图说明
图1为本发明的测定方法流程图；
图2为本发明的标准液的色谱测试结果图；
图3为本发明的样品待测液的色谱测试结果图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作更进一步的说明。
如图1所示为本发明的测定方法流程图，一种番茄植株顶芽内源激素含量的测定方法，包括以下步骤：
1)供试番茄顶芽样品前处理，包括提取、石油醚萃取后进行减压蒸发，再调节pH，并经乙酸乙酯萃取后，最后经二次减压蒸发制成样品待测液；具体方法包括：
1-1)提取：供试番茄顶芽样品1g加入80％冷甲醇中，于4℃下静置16h浸提，抽滤得清液，得粗提取液；
1-2)石油醚萃取：将粗提取液用等体积石油醚萃取，弃去醚相，合并水相；
1-3)减压蒸发：将步骤1-2)所得的水相在37℃下旋转蒸发至水相体积的1/3～1/4，得一次浓缩液；
1-4)调节pH：将一次浓缩液调节pH至2.75～2.85之间；
1-5)乙酸乙酯萃取：将调节好pH的一次浓缩液用等体积乙酸乙酯萃取，弃去水相，合并酯相；
1-6)二次减压蒸发：将步骤1-5)所得的酯相在37℃下旋转蒸发至所述酯相体积的1/4～1/5，得二次浓缩液，用甲醇定容至所述二次浓缩液体积的2倍，制成样品待测液，保存于4℃下棕色瓶中，待测；
2)配制流动相、设置色谱条件：采用甲醇与0.075％冰乙酸按体积比为45：55配制流动相；色谱条件设置为检测波长210nm，流速为0.7mL/min，进样量为20μL；
3)标准液的制备：植物激素的标准液包括0.1g/L的IAA标准液、0.001g/L的ZT标准液、0.001g/L的ABA标准液和0.01g/L的GA3标准液；将标准液按照不同浓度配比，配制成系列浓度梯度的标准混合溶液，4℃保存；
4)专属性考察：在步骤2)的色谱条件下，专属性考察包括对番茄顶芽样品中的IAA、ZT、ABA和GA3进行HPLC分离检测；
5)线性关系考察：分别量取经步骤3)制成的IAA、ZT、ABA和GA3标准液各1mL，在10mL的棕色容量瓶中用甲醇定容，过滤、进样并检测，以4种混标峰面积与相应质量浓度进行线性回归分析；
6)样品含量测定：将步骤1)制成的样品待测液，过滤进样，按外标法以峰面积计算番茄顶芽样品中IAA、ZT、ABA和GA3的含量；
完成步骤6)后，进行加标回收率试验，具体方法为：分别配制0.01g/L的IAA、ZT、ABA和GA3二号标准液，4℃保存；将步骤1)制成的所述样品待测液1mL中分别加入等体积的所述二号标准液1mL，按外标法以峰面积测定植物激素含量，计算加标回收率。
实施例
一、材料准备
①待测材料
经过预处理的番茄顶芽样品。
②试剂：
IAA标准品，SIGMA-ALDRICH，product of USA；
ZT标准品，SIGMA-ALDRICH，product of USA；
ABA标准品，SIGMA-ALDRICH，product of USA；
GA3标准品，SIGMA-ALDRICH，product of USA；
甲醇，色谱纯，国药集团化学试剂有限公司，上海；
冰乙酸，分析纯，国药集团化学试剂有限公司，上海。
③仪器：
10-1000μL DRAGONLAB可调式移液枪，上海万岛仪器科技有限公司；
1000mL砂芯过滤装置，天津津腾实验设备有限公司；
QP-01小型真空泵，深圳良谊仪器公司；
DS-5510 DTH超声波清洗器，上海奥析科学仪器有限公司；
Agilent 1200series HPLC-UV液相色谱仪，Agilent Technologies,USA。
二、处理步骤
1)供试番茄顶芽样品前处理，包括提取、石油醚萃取后进行减压蒸发，再调节pH，并经乙酸乙酯萃取后，最后经二次减压蒸发制成样品待测液；具体方法包括：
1-1)提取：取1.000g冷冻植物样品作为供试番茄顶芽样品，用10ml 80％冷甲醇研磨并完全转移至玻璃试管，置于4℃下静置16h，将提取液抽滤得清液；用10ml 80％冷甲醇重新浸提残渣两次，合并清液，得粗提取液；
1-2)石油醚萃取：将粗提取液用等体积的20ml石油醚萃取，弃去醚相，合并水相，重复两次；
1-3)减压蒸发：将步骤1-2)所得的水相在37℃下旋转蒸发至水相体积的1/3～1/4，得一次浓缩液；
1-4)调节pH：将一次浓缩液用0.5mol/L盐酸和0.5mol/L氢氧化钠调节pH至2.75～2.85之间；
1-5)乙酸乙酯萃取：将调节好pH的一次浓缩液用等体积的5～6ml乙酸乙酯萃取，弃去水相，合并酯相，重复两次；
1-6)二次减压蒸发：将步骤1-5)所得的酯相在37℃下旋转蒸发至所述酯相体积的1/4～1/5，得二次浓缩液，用甲醇定容至所述二次浓缩液体积的2倍，过0.45μm微孔滤膜，制成样品待测液，保存于4℃下棕色瓶中，待测；
2)配制流动相、设置色谱条件：使用移液枪准确量取375μL冰乙酸，在500mL容量瓶中用蒸馏水定容至刻度线，制成0.075％冰乙酸；将甲醇与0.075％冰乙酸分别抽滤并超声波震动30min，按体积比为45：55配制流动相；色谱条件设置为检测波长210nm，流速为0.7mL/min，进样量为20μL；
3)标准液的制备：准确称取标准品IAA 100mg、ZT 1mg、ABA 1mg和GA310mg，在1000mL棕色容量瓶中用甲醇定容至刻度线，制成植物激素的标准液包括0.1g/L的IAA标准液、0.001g/L的ZT标准液、0.001g/L的ABA标准液和0.01g/L的GA3标准液；将标准液按照不同浓度配比，配制成系列浓度梯度的标准混合溶液，4℃保存于冰箱中，备用；
4)专属性考察：在步骤2)的色谱条件下，专属性考察包括对番茄顶芽样品中的IAA、ZT、ABA和GA3进行HPLC分离检测；
5)线性关系考察：分别精密量取经步骤3)制成的IAA、ZT、ABA和GA3标准液各1mL，在10mL的棕色容量瓶中用甲醇定容至刻度线，过滤、进样并检测，重复进样6次，以4种混标峰面积与相应质量浓度进行线性回归分析，如：
以峰面积为纵坐标，以各进样浓度(mg/L)为横坐标，在EXCEL 2003中进行运算，得到四种植物内源激素的线性回归方程及其相关系数，如表1所示；
表1、内源激素在选定色谱条件下的标准曲线
从表1可以看出，各标准液浓度与其峰面积线性关系良好，相关系数满足分析要求，测定结果如附图2所示；
6)样品含量测定：将步骤1)制成的样品待测液，在确定的色谱条件下过滤进样，按外标法将测得的峰面积代入回归方程计算番茄顶芽样品中IAA、ZT、ABA和GA3的含量测定值，如：
每个样品待测液重复进样6次，测得经过24℃/12℃(昼温/夜温)温差处理21天后的番茄植株顶芽内源GA3含量为7.918μg/g FW(鲜重)，ZT含量为1.330μg/g FW，IAA含量为4.277μg/g FW，ABA含量为0.072μg/g FW，测定结果如附图3所示；
7)加标回收率试验：完成步骤6)后，进行加标回收率试验，具体方法为：分别配制0.01g/L的IAA、ZT、ABA和GA3二号标准液，4℃保存；将步骤1)制成的样品待测液1mL中分别加入等体积的二号标准液1mL，按外标法以峰面积测定植物激素含量，计算加标回收率，如：
取1mL样品待测液，分别加入所述0.01g/L二号标准液1mL，测定各内源激素浓度，根据结果换算成加二号标准液前后各内源激素的质量值；重复6次，计算加标回收率；试验结果见表2，进行加标回收率实验，平均回收率为99.85％，RSD小于1.56％，符合激素测定要求。
表2、内源激素加标回收试验结果
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出：对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (5)
1.一种番茄植株顶芽内源激素含量的测定方法，其特征在于：包括以下步骤：
1)供试番茄顶芽样品前处理；2)配制流动相、设置色谱条件；3)标准液的制备；4)专属性考察；5)线性关系考察；6)样品含量测定；
所述步骤1)的方法包括提取、石油醚萃取后进行减压蒸发，再调节pH，并经乙酸乙酯萃取后，最后经二次减压蒸发制成样品待测液；具体方法包括：
1-1)提取：供试番茄顶芽样品1g加入80％冷甲醇中，于4℃下静置16h浸提，抽滤得清液，得粗提取液；
1-2)石油醚萃取：将所述粗提取液用等体积石油醚萃取，弃去醚相，合并水相；
1-3)减压蒸发：将步骤1-2)所得的所述水相在37℃下旋转蒸发至所述水相体积的1/3～1/4，得一次浓缩液；
1-4)调节pH：将所述一次浓缩液调节pH至2.75～2.85之间；
1-5)乙酸乙酯萃取：将调节好pH的一次浓缩液用等体积乙酸乙酯萃取，弃去水相，合并酯相；
1-6)二次减压蒸发：将步骤1-5)所得的所述酯相在37℃下旋转蒸发至所述酯相体积的1/4～1/5，得二次浓缩液，用甲醇定容至所述二次浓缩液体积的2倍，制成样品待测液，保存于4℃下棕色瓶中，待测；
所述步骤2)中流动相为甲醇与0.075％冰乙酸按体积比为45：55配制而成；色谱条件设置为检测波长210nm，流速为0.7mL/min，进样量为20μL；
所述标准液和所述样品含量测定的植物激素包括IAA、ZT、ABA和GA3；所述标准液包括：0.1g/L的IAA标准液、0.001g/L的ZT标准液、0.001g/L的ABA标准液和0.01g/L的GA3标准液。
2.根据权利要求1所述的番茄植株顶芽内源激素含量的测定方法，其特征在于：所述步骤4)中，在步骤2)所述的色谱条件下，专属性考察包括对所述番茄顶芽样品中的IAA、ZT、ABA和GA3进行HPLC分离检测。
3.根据权利要求1所述的番茄植株顶芽内源激素含量的测定方法，其特征在于：所述步骤5)的具体方法为：分别量取经所述步骤3)制成的IAA、ZT、ABA和GA3标准液各1mL，在10mL的棕色容量瓶中用甲醇定容，过滤、进样并检测，以4种混标峰面积与相应质量浓度进行线性回归分析。
4.根据权利要求1所述的番茄植株顶芽内源激素含量的测定方法，其特征在于：所述步骤6)的具体方法为：将步骤1)制成的所述样品待测液，过滤进样，按外标法以峰面积计算所述番茄顶芽样品中IAA、ZT、ABA和GA3的含量。
5.根据权利要求1所述的番茄植株顶芽内源激素含量的测定方法，其特征在于：完成所述步骤6)后，进行加标回收率试验，具体方法为：分别配制0.01g/L的IAA、ZT、ABA和GA3二号标准液，4℃保存；将步骤1)制成的所述样品待测液中分别加入等体积的所述二号标准液，按外标法以峰面积测定植物激素含量，计算加标回收率。
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| EXSB | Decision made by sipo to initiate substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| TR01 | Transfer of patent right |
Effective date of registration: 20181210 Address after: No. 97 Chenghe Road, Tuihe Neighborhood Committee, Fucheng Street, Funing County, Yancheng City, Jiangsu Province (C) Patentee after: Jiangsu Manchu Yiduo Eco-Agricultural Science and Technology Development Co., Ltd. Address before: 210044 Ning six road, Nanjing, Jiangsu Province, No. 219 Patentee before: Nanjing University of Information Science and Technology |
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| TR01 | Transfer of patent right | ||
| TR01 | Transfer of patent right |
Effective date of registration: 20200323 Address after: 233400 building 111, No.8 pedestrian street, middle section of Yuwang Road, Huaiyuan County, Bengbu City, Anhui Province Patentee after: Huaiyuan Hanbang Technology Consulting Co., Ltd Address before: No. 97 Chenghe Road, Tuihe Neighborhood Committee, Fucheng Street, Funing County, Yancheng City, Jiangsu Province (C) Patentee before: Jiangsu Manchu Yiduo Eco-Agricultural Science and Technology Development Co., Ltd. |
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| TR01 | Transfer of patent right |