CN108344824A - 一种适用于木本植物内源激素测定的高效提取方法 - Google Patents

一种适用于木本植物内源激素测定的高效提取方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于木本植物技术领域，公开了一种适用于木本植物内源激素测定的高效提取方法，称取柠檬叶，液氮速冻并研磨成粉末，加入甲醇溶液，放置4℃冰箱中过夜；加甲醇洗涤残渣，重复操作2次，合并上清夜；将过滤后的上清夜转入旋转蒸发瓶中，在36℃、弱光下减压蒸发至水相，取水相并用纯水洗涤旋转蒸发瓶1次；‑80℃冷藏10min后冻干；用pH＝3.0的PBS4ml溶解；用4ml的乙酸乙酯10ml离心管萃取3次，留酯相弃水相；将乙酸乙酯相转入旋转蒸发瓶中，在36℃、弱光下减压蒸发至干，用A泵流动相溶解过小柱；水相，冷藏后冻干，直接保存；用5mL流动相溶解，得ZT；在进行HPLC分析前样品分别过0.22μm的微孔滤膜，作为供试液。

Description

一种适用于木本植物内源激素测定的高效提取方法
技术领域
本发明属于木本植物技术领域，尤其涉及一种适用于木本植物内源激素测定的高效提取方法。
背景技术
高效液相色谱(HPLC)具有高效、高灵敏度的特点，成为植物内源激素较理想的分析方法。当前最常用的提取方法是用80％的冰甲醇来提取，浸提过夜，收集滤液，旋转蒸干，用少量水溶解残液，冻融过夜，溶化后，离心取上清液，调节pH，加乙酸乙酯萃取，取有机相，然后再旋转蒸发，最后用流动相溶解，上样测定。木本植物具有内含物明显高于草本植物，成分复杂、干扰物质多的特点，采用现有提取工艺不但操作复杂，耗时长，而且一次只能检测一种目标物，峰位重迭、过度密挤、双峰、拖尾等问题严重，还费时费工，并且回收率一般低于80％。
综上所述，现有技术存在的问题是：该方法的工艺流程依照当前分析纯化仪器的进步来说是落后的。当前超低温冰箱和冻干机的应用，不仅可以保障样品目标物的稳定性，而且对小分子挥发物具有很好的消除效果。同时缩短了样品提取时间，提高了回收率，比如旋转蒸发虽然是减压但长时间的高温环境会明显破坏激素结构(IAA最明显)从而显著影响样品回收率，如100mL样品旋转蒸发仪蒸发到干即使在理想条件下也要15分钟，而仅仅蒸发到水相2～3分钟就可以实现。
本发明针对木本材料内含物丰富、多糖多酚类、小分子精油类等干扰物质多的特点，以及植物内源激素的化学物理性质，制定了前处理优化方案，省去了盲目的纯化步骤，采用更先进的纯化仪器，精简了操作步骤。配合液相检测条件的调整，实现了更准确、更高效的检测效果。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种适用于木本植物内源激素测定的高效提取方法。
本发明是这样实现的，一种适用于木本植物内源激素测定的高效提取方法，所述适用于木本植物内源激素测定的高效提取方法包括：
步骤一，称取柠檬叶0.2g，液氮速冻并研磨成粉末，加入冷却的80％甲醇溶液10ml，放置4℃冰箱中过夜；
步骤二，加80％甲醇5mL洗涤残渣，重复以上操作2次，合并上清夜；过0.45μm滤头；
步骤三，将过滤后的上清夜转入旋转蒸发瓶中，在36℃、弱光下减压蒸发至水相，取水相并用纯水洗涤旋转蒸发瓶1次，合计大概6ml；-80℃冷藏10min后冻干，得干粉；用pH＝3.0的PBS 4ml溶解；
步骤四，用4ml的乙酸乙酯10ml离心管萃取3次，留酯相弃水相；
步骤五，将乙酸乙酯相转入旋转蒸发瓶中，在36℃、弱光下减压蒸发至干，用A泵流动相2mL溶解过Pak-ODS-C18小柱，5ml冲洗，得IAA、GA、ABA。取2ml冻存管保存，为分析前样品；
步骤六，水相，-80℃冷藏10min后冻干，后直接保存；
步骤七，用5mL流动相溶解，得ZT。取2ml冻存管保存，为分析前样品；
步骤八，在进行HPLC分析前样品分别过0.22μm的微孔滤膜，作为供试液。
进一步，所述步骤一中柠檬叶0.2g。
进一步，所述步骤三中用pH＝3.0的PBS过0.45水相膜。
进一步，所述步骤五中A泵流动相按照体积比0.01mol/L pH＝3.5的磷酸钠缓冲液：甲醇＝7：3。
进一步，所述步骤五中Pak-ODS-C18小柱，小柱使用前用2mL色谱纯甲醇活化；样品过完小柱后再用5mL流动相冲洗。
本发明的另一目的在于提供一种使用所述适用于木本植物的高效测定内源激素提取的方法测定的内源激素。
本发明的优点及积极效果为：本发明对木本植物样品前处理的提取流程进行了优化，优化后的提取方法由原来5-7天的工作量，减少为1-2天；化学试剂用量少，更环保；并且实现了GA3(赤霉素)、IAA(生长素)、ABA(脱落酸)三种不同植物激素的同步检测，又提高了回收率高(由80％提高到90％以上)和检测精准度(目标峰独立、分离效果好)。首先根据色谱柱分离原理，利用GA3(赤霉素)、IAA(生长素)、ABA(脱落酸)三种植物激素物质成分极性强弱的不同，筛选出流实现木本植物高效同步测定的检测条件；之后，根据干扰物质在色谱峰中的大致位置，判断物质成分，着重重迭峰、密挤峰、双峰、拖尾等影响显著的干扰物质，制定纯化方案，将干扰控制在检测范围内，从而精简了提取工艺，节省工时，达到了高效的检测目的。
附图说明
图1是本发明实施例提供的适用于木本植物内源激素测定的高效提取方法流程图。
图2是本发明实施例提供的是用本发明提取的柠檬芽和叶片的HPLC色谱图(自上而下分别是柠檬芽、柠檬芽、各标样、柠檬叶、柠檬叶)。
图3是本发明实施例提供的内源激素各标样色谱图(上)和柠檬叶片HPLC色谱图(下)示意图。
图4是本发明实施例提供的石油醚纯化前HPLC色谱图(上)和石油醚纯化后HPLC色谱图(下)示意图。
图5是本发明实施例提供的乙酸乙酯纯化HPLC色谱图。
图6是本发明实施例提供的pH值调节后HPLC色谱图。
图7是本发明实施例提供的C18小柱去除的杂志色谱图(上)和纯化后的HPLC色谱图(下)
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
下面结合附图对本发明的应用原理作详细的描述。
如图1所示，本发明实施例提供的适用于木本植物内源激素测定的高效提取方法包括以下步骤：
S101：浸提：称取柠檬叶0.2g，液氮速冻并研磨成粉末，加入冷却的80％甲醇溶液10ml，放置4℃冰箱中过夜；
S102：加80％甲醇5mL洗涤残渣，重复以上操作2次，合并上清夜。过0.45μm滤头；
S103：将过滤后的上清夜转入旋转蒸发瓶中，在36℃、弱光下减压蒸发至水相，取水相并用纯水洗涤旋转蒸发瓶1次，合计大概6ml；-80℃冷藏10min后冻干，得干粉；用pH＝3.0的PBS(过0.45水相膜)4ml溶解；
S104：用4ml的乙酸乙酯10ml离心管萃取3次，留酯相弃水相(水相用于提取细胞分裂素ZT)；
S105：将乙酸乙酯相转入旋转蒸发瓶中，在36℃、弱光下减压蒸发至干，用A泵流动相(0.01mol/L PH＝3.5的PBS(磷酸钠缓冲液)：甲醇＝7：3(体积比)2mL溶解过Pak-ODS-C18小柱，5ml冲洗，得IAA、GA3、ABA。取2ml冻存管保存，为分析前样品；(Pak-ODS-C18小柱，小柱使用前用2mL色谱纯甲醇活化；样品过完小柱后再用5mL流动相冲洗)；
S106：水相，-80℃冷藏10min后冻干，后直接保存；
S107：用5mL流动相溶解，得Z。取2ml冻存管保存，为分析前样品；
S108：在进行HPLC分析前样品分别过0.22μm的微孔滤膜，作为供试液。
下面结合试验对本发明的应用效果作详细的描述。
1结果与分析
1.1色谱条件的选择
按照CK的方法提取柠檬叶片内源激素，经HPLC分析如图3所示，30μg/mL的标样中GA3、IAA、ABA和Z的标样保留时间分别为3.4、9.6、13.2和11.3min，在保留时间7.5min后各峰分离效果较清晰。说明，采用此液相条件，对实现IAA、ABA和Z三种激素检测的干扰较少，有较好的分离效果；而有大量物质干扰GA3的检测。可见，实现柠檬四种内源激素准确定量测定的重点是GA3的分离纯化。在保障IAA、ABA和Z三种激素良好分离效果的基础上，依据GA3的性质制定纯化工艺。
1.2各处理方法对样品IAA、GA3和ABA纯化效果的影响
1.2.1PVP的影响
PVP可以与酚类物质结合，形成絮状物，通过静止分离等方法去除酚类物质，从而达到纯化效果。但是，在实际操作中，加入PVP后再用石油醚或乙酸乙酯萃取分层时，溶液振荡后产生大量泡沫，溶液变为白色乳浊液并且很难实现静止分层。说明柠檬叶片中酚类物质较少或是存在于PVP反映敏感物质，所以在纯化操作中，为避免引入杂志物质或使操作更复杂先避免PVP的使用。
1.2.2石油醚的影响
由图4可知，经石油醚纯化后，保留时间在7.5min之前色谱峰的纯化效果没有明显变化，而在7.5min之后具有一定变化，在保留时间在10min左右新出现一个较大的色谱峰，保留11-20min之间色谱峰数量由9个峰数量减少为8个峰，尤其是11-15min之间色谱峰出峰清晰，这对ABA、IAA和Z的分离纯化有正效果。
1.2.3乙酸乙酯的影响
由图5可知，经乙酸乙酯纯化后，对保留时间在7.5min之前色谱峰的纯化效果没有明显正效果。而在7.5-11.5min之间使色谱峰分离清晰，且分离效果较好，纯化效果明显。并且对保留时间在11-20min之间色谱峰数量由9个峰数量减少为8个峰，尤其是11-15min之间色谱峰出峰清晰，这对ABA、IAA、和Z的分离纯化有正效果。
1.2.4pH值的影响
由图6可知，经调节pH值后，保留时间在7.5min之前的色谱峰数量增加了，说明pH的调节对纯化起到一定作用，但是，对GA3的色谱峰(保留时间在3-4民)没有明显的改善，对7.5min之后的色谱峰，具有一定的消除效果。使色谱峰进一步清晰。这对ABA、IAA和Z的分离纯化有正效果。
1.2.5C18小柱的影响
由图7可知，经固相萃取小柱纯化后，对保留时间在7.5min之前的杂志物质具有很好的清除效果，明显改善了杂志对检测GA3的干扰。并且固相萃取小柱对7.5min之后的色谱峰影响较小，几乎没有色谱峰的消除。综合看来，在此色谱条件下，固相萃取小柱的纯化对干扰GA3的分析具有很好的除杂效果，并且纯化后对ABA、IAA和Z的检测没有不良影响，且消耗很少，对四种激素的分离检测有正效果。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.一种适用于木本植物内源激素测定的高效提取方法，其特征在于，所述适用于木本植物内源激素测定的高效提取方法包括：
步骤一，称取柠檬叶0.2g，液氮速冻并研磨成粉末，加入冷却的80％甲醇溶液10ml，放置4℃冰箱中过夜；
步骤二，加80％甲醇5mL洗涤残渣，重复以上操作2次，合并上清夜；过0.45μm滤头；
步骤三，将过滤后的上清夜转入旋转蒸发瓶中，在36℃、弱光下减压蒸发至水相，取水相并用纯水洗涤旋转蒸发瓶1次，合计大概6ml；-80℃冷藏10min后冻干，得干粉；用pH＝3.0的PBS4ml溶解；
步骤四，用4ml的乙酸乙酯10ml离心管萃取3次，留酯相弃水相；
步骤五，将乙酸乙酯相转入旋转蒸发瓶中，在36℃、弱光下减压蒸发至干，用A泵流动相2mL溶解过Pak-ODS-C18小柱，5ml冲洗，得IAA、GA、ABA；取2ml冻存管保存，为分析前样品；
步骤六，水相，-80℃冷藏10min后冻干，后直接保存；
步骤七，用5mL流动相溶解，得ZT；取2ml冻存管保存，为分析前样品；
步骤八，在进行HPLC分析前样品分别过0.22μm的微孔滤膜，作为供试液。
2.如权利要求1所述的适用于木本植物内源激素测定的高效提取方法，其特征在于，所述步骤一中柠檬叶0.2g。
3.如权利要求1所述的适用于木本植物内源激素测定的高效提取方法，其特征在于，所述步骤三中用pH＝3.0的PBS过0.45水相膜。
4.如权利要求1所述的适用于于木本植物内源激素测定的高效提取方法，其特征在于，所述步骤五中A泵流动相按照体积比0.01mol/L pH＝3.5的磷酸钠缓冲液：甲醇＝7：3。
5.如权利要求1所述的适用于于木本植物内源激素测定的高效提取方法，其特征在于，所述步骤五中Pak-ODS-C18小柱，小柱使用前用2mL色谱纯甲醇活化；样品过完小柱后再用5mL流动相冲洗。
6.一种使用权利要求1～5任意一项所述适用于于木本植物内源激素测定的高效提取方法。
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