CN103217495B

CN103217495B - 一种测定草坪草内源激素的方法

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Publication number: CN103217495B
Application number: CN201310098780.3A
Authority: CN
Inventors: 常智慧; 禚来强; 尹淑霞; 于芳芳
Original assignee: Beijing Forestry University
Current assignee: Beijing Forestry University
Priority date: 2013-03-26
Filing date: 2013-03-26
Publication date: 2014-12-31
Anticipated expiration: 2033-03-26
Also published as: CN103217495A

Abstract

本发明涉及一种测定草坪草内源激素的方法，包括以下步骤：1）将草坪草用磷酸钠缓冲液和二氯甲烷进行两次提取，两次离心后，然后氮气吹干，得到草坪草内源激素；2）将步骤1）得到的草坪草内源激素用甲醇溶解后，利用固相萃取柱进行脱色脱脂，取洗脱液，然后真空抽干后，再用甲醇和乙酸的混合溶液溶解；3）以甲醇和乙酸作为流动相，利用高效液相色谱对经过步骤2）处理后的草坪草内源激素进行测定，得到草坪草内源激素的含量。本发明的方法选择适宜的内源激素提取方法和色谱条件，准确测定草坪草内源激素的含量，与现有技术进行相比，具有回收率、提取效率高；准确率高、重复性好的优点。

Description

一种测定草坪草内源激素的方法

技术领域

本发明涉及植物内源激素的测定领域，具体地，涉及一种测定草坪草内源激素的方法。

背景技术

自20世纪70年代采用高效液相色谱（High Performance LiquidChromatography,HPLC）分析植物内源激素以来，由于其具有灵敏度高和选择性、重复性好及分析速度快等特点，已在除乙烯外的四大类植物激素和生长调节剂的研究领域中得到不断发展。利用高效液相色谱对植物内源激素进行定量测定的重点在于选择出合适的内源激素提取方法和色谱条件。但因生物体内源激素的复杂性和特殊性，目的成分的分离提取是极为关键的一步，而且是直接影响其精密度、回收率的重要因素。传统的利用高效液相色谱法测定植物内源激素的方法，通常是利用80%的冰甲醇来提取植物内源激素，然后过滤，收集滤液，利用旋转蒸发仪蒸干，用少量水溶解残液，冻融过夜，融化后，离心取上清液，调节pH，加乙酸乙酯萃取，取有机相，然后再旋转蒸发，最后用流动相溶解，上样。这种方法不但操作复杂，而且回收率相当低（约为80%），不利于准确地测定植物内源激素含量。

因此，选择出合适的内源激素提取方法和色谱条件，对于测定植物内源激素，尤其是草坪草内源激素的含量将有重大的意义。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明的目的是提供一种测定草坪草内源激素的方法。

本发明提供的测定草坪草内源激素的方法，包括以下步骤：

1）将草坪草用磷酸钠缓冲液和二氯甲烷进行两次提取，两次离心后，然后氮气吹干，得到草坪草内源激素；

2）将步骤1）得到的草坪草内源激素用甲醇溶解后，利用固相萃取柱进行脱色脱脂，取洗脱液，然后真空抽干后，再用甲醇和乙酸的混合溶液溶解；

3）以甲醇和乙酸作为流动相，利用高效液相色谱对经过步骤2）处理后的草坪草内源激素进行测定，得到草坪草内源激素的含量。

其中，步骤1）中，所述磷酸钠缓冲液的浓度为0.05M，pH值为7.0，还含有0.02%～0.05%（w/v，优选0.02%）的二乙基二硫代氨基甲酸钠。w/v为质量体积比，即磷酸钠缓冲液中含有0.02～0.05%二乙基二硫代氨基甲酸钠指：100mL磷酸钠缓冲液中含有0.02～0.05g二乙基二硫代氨基甲酸钠。二乙基二硫代氨基甲酸钠作为抗氧化剂，可以起到避免提取出来的草坪草内源激素被空气氧化的作用。

其中，步骤1）中，草坪草与磷酸钠缓冲液的质量体积比为1:8～1:12，优选1:10（g:mL）。

其中，步骤1）中，磷酸缓冲液与二氯甲烷的体积比为3:4～1:1，优选1:1。

其中，步骤1）中，用磷酸钠缓冲液进行提取的条件包括：在4°C下提取0.8～1.2h后，用1M盐酸调pH至2.5～3.0，优选为：在4°C下提取1h后，用1M盐酸调pH至2.6。

其中，步骤1）中，用二氯甲烷进行提取的条件包括：在4°C下提取0.8～1.2h；优选为：在4°C提取1h。

其中，步骤1）中，两次离心的条件包括：在8000～12000rpm下离心8～15min，取下清液，残渣再用二氯甲烷进行提取，在8000～12000rpm下再次离心8～15min，合并下清液。优选为：在10000rpm下离心10min，取下清液，残渣再用二氯甲烷进行提取，在10000rpm下再次离心10min，合并下清液。

进一步地，残渣再用二氯甲烷进行提取，提取的条件与首次利用二氯甲烷提取（用磷酸钠缓冲液进行提取后）的条件相同，包括：在4°C下提取0.8～1.2h；优选为：在4°C提取1h。

经过本发明步骤1）提取草坪草，得到的草坪草内源激素主要含有：ABA（脱落酸）和IAA（吲哚-3-乙酸），再用后续的步骤测定它们的含量。

其中，步骤2）中，溶解草坪草内源激素的甲醇的浓度为80%。

其中，步骤2）中，固相萃取柱具体可以为：C₁₈固相萃取小柱。

其中，步骤2）中，利用固相萃取柱进行脱色脱脂，收集洗脱液的条件包括：先用甲醇活化固相萃取柱，再用浓度为80%的甲醇平衡；然后上浓度为80%甲醇溶解的草坪草内源激素样品，再用浓度为80%的甲醇洗脱，收集洗脱液，35°C真空抽干。

其中，步骤2）中，甲醇和乙酸的混合溶液中，甲醇和乙酸的体积比为2:1～1:1，优选1:1。乙酸的浓度为0.075%。

其中，步骤3）中，高效液相色谱的条件包括：色谱柱为C₁₈反相柱(5μm,4.6mm×25cm)；流速为1mL/min；柱温为30℃；进样量为10μL；检测波长：ABA为262nm，IAA为280nm。

其中，步骤3）中，高效液相色谱以标样出峰时间和峰高叠加定性，外标法峰面积定量；梯度洗脱条件为：

其中，步骤3）中，乙酸浓度为0.075%。

本发明利用的草坪草是叶片部位。

本发明具有以下有益的效果：

（1）采用的是两相溶剂系统，可以充分提取植物内源激素（有效的提取草坪草中极性和非极性物质，并且可以使极性和非极性物质溶解于不同的溶剂层中），并可以将其与其他提取物质分开，避免其他提取物质对植物内源激素的干扰。

（2）采用两次提取、两次离心，可以提高草坪草内源激素的回收率，实验证明现有技术得到的回收率为80%，本发明的回收率可达到90%～95%。

（3）提高了草坪草内源激素的提取效率。传统仅采用80%甲醇作为提取溶剂的提取方法，提取时间一般都在24h以上，而采用本发明的提取溶剂，则将提取时间缩短至4h左右。

（4）得到的草坪草内源激素用甲醇溶解后，利用固相萃取柱进行脱色脱脂，避免了出现杂峰影响测定效果。

（5）本发明所选择的色谱条件，尤其是梯度洗脱条件的确定，避免了传统方法采用等度洗脱所出现的分离度低、峰形差和拖尾等现象，大大缩短了上样时间，每个样品的测定时间为22.10min。

（6）草坪草内源激素和标准样品的保留时间相同，而且向草坪草内源激素样品中添加少量的标准样品后，峰面积添加，说明本发明的准确率高、重复性好。

总之，本发明测定草坪草内源激素的方法，选择适宜的内源激素提取方法和色谱条件，准确测定草坪草内源激素（生长素IAA和脱落酸ABA）的含量（特定技术手段，测定特定植物中的特定物质），与现有技术进行相比，具有回收率、提取效率高；准确率高、重复性好的优点。

附图说明

图1：各激素标准样品色谱图，其中IAA保留时间为10.849min；ABA保留时间为11.483min。

图2：实施例1中草地早熟禾样品测定的IAA色谱图，测定波长为280nm，保留时间为10.854min。

图3：实施例1中草地早熟禾样品中添加少量标样测定的IAA色谱图。测定波长为280nm，保留时间为10.861min。

图4：实施例1中黑麦草样品测定的IAA色谱图。测定波长为280nm，保留时间为10.859min。

图5：实施例1中黑麦草样品中添加少量标样测定的IAA色谱图。测定波长为280nm，保留时间为10.862min。

图6：实施例1中草地早熟禾样品测定的ABA色谱图。测定波长为262nm，保留时间为11.483min。

图7：实施例1中草地早熟禾样品中添加少量标样测定的ABA色谱图。测定波长为262nm，保留时间为11.483min。

图8：实施例1中黑麦草样品测定的ABA色谱图。测定波长为262nm，保留时间为11.479min。

图9：实施例1中黑麦草样品中添加少量标样测定的ABA色谱图。测定波长为262nm，保留时间为11.483nm。

图10：本发明的草坪草样品内源激素色谱图。

图11：对比例1中80%甲醇提取，采用等度洗脱的草坪草内源激素色谱图。

图12：对比例2中未经C₁₈固相萃取小柱进行脱色脱脂的草坪草内源激素色谱图。

图1～图12中，横坐标数值的单位为分钟（min），纵坐标数值的单位为吸光度（mAU）。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

本发明磷酸钠缓冲液的配制：先配置成0.05M，pH=7.0磷酸钠缓冲液，然后再用磷酸缓冲液溶解二乙基二硫代氨基甲酸钠（100mL磷酸钠缓冲液溶解0.02～0.05g二乙基二硫代氨基甲酸钠）。

C₁₈固相萃取小柱为CNWBOND LC-C18 SPE小柱，500mg/3mL。

本发明中浓度为80%的甲醇中的百分数指体积百分比，即100mL高纯水中溶解80mL甲醇。本发明所用甲醇除指明是80%甲醇外，其他都是纯甲醇。

0.075%的乙酸中的百分数是体积百分比，也就是750μL乙酸溶于1L高纯水中。

本发明所使用的物料与仪器均可以从市场上购得，所未涉及的操作条件均为本领域的常规选择。

实施例1

（1）选取比较有代表性的草坪草（草地早熟禾和黑麦草：分开提取和检测，均用本实施例的方法）作为样品。剪取0.3g新鲜叶片，加液氮研磨至粉碎。

（2）加3mL磷酸钠缓冲液（0.05M，pH=7.0，含0.02%二乙基二硫代氨基甲酸钠；保持叶片重g：提取液体积mL=1:10），转移到10mL的离心管中，在4°C下震荡1h后，用1M盐酸调pH约至2.6，再加入3mL二氯甲烷，在4°C震荡1h。

注意：植物内源激素非常不稳定，确保震荡过程始终维持在4°C环境下。

（3）取出离心管，将上个步骤得到的提取物在10000rpm下离心10min，取下清液（约3mL）转移至另一离心管中。残渣再加入3mL二氯甲烷，在4°C下继续震荡1h，再次离心（10000rpm下离心10min），合并下清液。

（4）用氮气吹干二氯甲烷，然后用1mL浓度80%甲醇溶解，涡旋5min后。利用C₁₈固相萃取小柱进行脱色脱脂：先用5mL甲醇活化C₁₈固相萃取小柱，再用5mL浓度80%甲醇平衡；然后再上样（草坪草内源激素待测样品），最后用1mL浓度80%甲醇洗脱，共收集2mL洗脱液，35°C真空抽干。

（5）用400μL甲醇/0.075%乙酸溶液（V/V=1:1）的混合溶液溶解。涡旋3min。然后过0.45μm滤膜，转移至色谱瓶中。

（6）利用安捷伦1260高效液相色谱仪对样品（脱色脱脂后的草坪草内源激素）进行测定，其色谱条件为：

色谱柱为Agilent(C₁₈)反相柱(5μm,4.6mm×25cm)；流动相为甲醇∶0.075%的乙酸；流速为1mL/min；柱温为30℃；进样量为10μL；检测波长：ABA为262nm，IAA为280nm。以标样出峰时间和峰高叠加定性，外标法峰面积定量。梯度洗脱条件：

（7）激素标准样品色谱图（如图1所示），其中IAA的保留时间为10.849min，峰面积为67.3；ABA的保留时间为11.483min，峰面积为172.6。

如图2所示：草地早熟禾样品测定的IAA色谱图，测定波长为280nm，保留时间为10.854min，峰面积为3.4。

如图3所示：草地早熟禾样品中添加少量标样测定的IAA色谱图。测定波长为280nm，保留时间为10.861min，峰面积为20.9。

如图4所示：黑麦草样品测定的IAA色谱图。测定波长为280nm，保留时间为10.859min，峰面积为13.8。

如图5所示：黑麦草样品中添加少量标样测定的IAA色谱图。测定波长为280nm，保留时间为10.862min，峰面积为20.844。

如图6所示：草地早熟禾样品测定的ABA色谱图。测定波长为262nm，保留时间为11.483min，峰面积为43.6。

如图7所示：草地早熟禾样品中添加少量标样测定的ABA色谱图。测定波长为262nm，保留时间为11.483min，峰面积为77.2。

如图8所示：黑麦草样品测定的ABA色谱图。测定波长为262nm，保留时间为11.479min，峰面积为8.50024。

如图9所示：黑麦草样品中添加少量标样测定的ABA色谱图。测定波长为262nm，保留时间为11.483nm，峰面积为15.8761。

如图10所示：本发明的草坪草样品内源激素色谱图，无干扰峰，测定时间短，20min后无其他峰出现。其中IAA的保留时间为10.861min，峰面积为22.8；ABA的保留时间为11.486min，峰面积为49.8。

标准曲线的制备：

取适量母液，用甲醇：0.075%的冰乙酸=1:1作为溶剂，配制成浓度梯度为：0.05μg/mL、0.1μg/mL、0.2μg/mL、0.4μg/mL、0.8μg/mL、1.6μg/mL、3.2μg/mL的标样系列溶液，然后进行HPLC测定，获得标准曲线，从而建立起激素浓度和峰面积大小之间的函数关系。激素标样标准曲线方程分别为：Y_IAA=0.0498X+0.0215，R2=0.9998；Y_ABA=0.0138X-0.0026，R2=0.9998。其中X为HPLC图谱上的峰面积；Y为样品激素浓度（μg/mL）。

回收率的测定：

采用添加标样法测定回收率。取同一盆草坪草叶片样品3份，在研磨时第1份不加激素标样；第2份加入IAA和ABA标样；第3份在本发明实施例1步骤（5）中加入IAA和ABA标样，使其标样激素含量与第2份的理论含量相等，按提取步骤平行操作，并在相同的色谱条件下分别进样，三份样品的色谱图均出现与标样相同保留时间的激素吸收峰。有标样的样品上HPLC仪后，在这些激素的保留时间处色谱峰高和峰面积均增大，说明样品内源激素和添加的激素标样叠加出峰。回收率=（第3份的峰面积-第1份的峰面积）/（第2份的峰面积-第1份的峰面积）*100%。重复5次。所得结果为：IAA的平均回收率为95%，ABA的平均回收率为90%。此测定方法保留时间稳定，回收率符合微量分析的要求，说明所选择的激素提取、分离、纯化的方法和HPLC色谱条件是可行的。

色谱条件的选择将影响检测图谱的分析效果，也随之影响试验的可信度。因此，在进行具体的测定以前，进行色谱条件的选择非常重要。色谱条件主要包括流动相、洗脱条件、流速、柱温和检测波长等。本发明通过多次试验，摸索出一种适合安捷伦1260高效液相色谱仪测定草坪草内源激素的色谱条件，避免了同时测定两种及两种以上植物内源激素往往出现的峰位重迭、过度密挤、双峰、拖尾等问题，且分离度高，准确性、重复性好，适合草坪草内源激素的测定。

实施例2

草坪草用草地早熟禾，其他条件与实施例1相同，所不同的是：

草坪草与磷酸钠缓冲液的质量体积比为1:8（g:mL）；

磷酸钠缓冲液中的二乙基二硫代氨基甲酸钠的浓度为0.05%；

磷酸缓冲液与二氯甲烷的体积比为3:4；

用磷酸钠缓冲液进行提取的条件：在4°C下提取0.8h后，用1M盐酸调pH至3.0；

用二氯甲烷进行首次提取，以及残渣再用二氯甲烷进行提取的条件：在4°C下提取1.2h；

两次离心的条件包括：取出离心管，在8000rpm下离心15min，取下清液（约3mL），转移至另一离心管中。残渣再加入3mL二氯甲烷，在4°C继续震荡1.2h，再次离心（在8000rpm下离心15min），合并下清液。

实施例3

草坪草用黑麦草，其他条件与实施例1相同，所不同的是：

草坪草与磷酸钠缓冲液的质量体积比为1:12（g:mL）；

用磷酸钠缓冲液进行提取的条件：在4°C下提取1.2h后，用1M盐酸调pH至2.5；

用二氯甲烷进行首次提取，以及残渣再用二氯甲烷进行提取的条件：在4°C下提取0.8h；

两次离心的条件包括：取出离心管，在12000rpm下离心8min，取下清液（约3mL），转移至另一离心管中。残渣再加入3mL二氯甲烷，在4°C继续震荡0.8h，再次离心（在12000rpm下离心8min），合并下清液；

溶解真空抽干的洗脱液，所用的甲醇与乙酸的混合溶液，其中甲醇与乙酸的体积比为2:1。

根据实施例2和3得到的检测结果与实施例1的类似，以实施例1的结果为最优。

对比例1

采取等度洗脱（如图11所示，条件为甲醇：0.075%乙酸=40:60）：先利用80%的冰甲醇来提取12h，然后过滤，收集滤液，再加入80%的冰甲醇提取12h，再过滤，合并滤液，利用旋转蒸发仪蒸干10～15min（由于没有氮气保护，激素会被氧化），用少量水溶解残液，冻融12h，融化后，离心取上清液，调节pH，加乙酸乙酯萃取，取有机相，然后再旋转蒸发（激素再次被氧化），最后用流动相溶解，上样。

得到草坪草内源激素色谱图，有干扰峰，测定时间长，30min后还有其他峰出现，如图11所示。

测定的IAA和ABA的平均回收率均为80%。该方法提取效率低，提取时间长。

对比例2

其他条件同实施例1，所不同的是：未经C₁₈固相萃取小柱进行脱色脱脂。得到的草坪草内源激素色谱图，在IAA保留时间处有明显的干扰峰，如图12所示：保留时间为10.748的峰面积为1.12273，保留时间为10.851的峰面积为1.72093。未经C₁₈固相萃取小柱进行脱色脱脂，结果说明在保留时间范围内，有干扰峰，而且干扰峰的峰面积相对来说非常大。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims

1.一种测定草坪草内源激素的方法，包括以下步骤：

先配置0.05M，pH＝7.0磷酸钠缓冲液，然后再用磷酸缓冲液溶解二乙基二硫代氨基甲酸钠，具体为100mL磷酸钠缓冲液溶解0.02～0.05g二乙基二硫代氨基甲酸钠；

C₁₈固相萃取小柱为CNWBOND LC-C18SPE小柱，500mg/3mL；

(1)选取草地早熟禾和黑麦草，分开提取和检测，剪取0.3g新鲜叶片，加液氮研磨至粉碎；

(2)加3mL 0.05M，pH＝7.0，含0.02％二乙基二硫代氨基甲酸钠的磷酸钠缓冲液，保持叶片重g：提取液体积mL＝1:10，转移到10mL的离心管中，在4℃下震荡1h后，用1M盐酸调pH至2.6，再加入3mL二氯甲烷，在4℃震荡1h；

(3)取出离心管，将上个步骤得到的提取物在10000rpm下离心10min，取下清液约3mL转移至另一离心管中；残渣再加入3mL二氯甲烷，在4℃下继续震荡1h，10000rpm下离心10min，合并下清液；

(4)用氮气吹干二氯甲烷，然后用1mL浓度80％甲醇溶解，涡旋5min后，利用C₁₈固相萃取小柱进行脱色脱脂：先用5mL甲醇活化C₁₈固相萃取小柱，再用5mL浓度80％甲醇平衡；然后再上草坪草内源激素待测样品，最后用1mL浓度80％甲醇洗脱，共收集2mL洗脱液，35℃真空抽干；

(5)用400μL甲醇/0.075％乙酸溶液，V/V＝1:1的混合溶液溶解；涡旋3min；然后过0.45μm滤膜，转移至色谱瓶中；

(6)利用安捷伦1260高效液相色谱仪对脱色脱脂后的草坪草内源激素样品进行测定，其色谱条件为：

色谱柱为Agilent C₁₈反相柱5μm,4.6mm×25cm；流动相为甲醇∶0.075％的乙酸；流速为1mL/min；柱温为30℃；进样量为10μL；检测波长：ABA为262nm，IAA为280nm；以标样出峰时间和峰高叠加定性，外标法峰面积定量，梯度洗脱条件：

标准曲线的制备：

取适量母液，用甲醇：0.075％的冰乙酸＝1:1作为溶剂，配制成浓度梯度为：0.05μg/mL、0.1μg/mL、0.2μg/mL、0.4μg/mL、0.8μg/mL、1.6μg/mL、3.2μg/mL的标样系列溶液，然后进行HPLC测定，获得标准曲线，从而建立起激素浓度和峰面积大小之间的函数关系；激素标样标准曲线方程分别为：Y_IAA＝0.0498X+0.0215，R2＝0.9998；Y_ABA＝0.0138X-0.0026，R2＝0.9998；其中X为HPLC图谱上的峰面积；Y为样品激素浓度μg/mL；

回收率的测定：

采用添加标样法测定回收率：取同一盆草坪草叶片样品3份，在研磨时第1份不加激素标样；第2份加入IAA和ABA标样；第3份在步骤(5)中加入IAA和ABA标样，使其标样激素含量与第2份的理论含量相等，按提取步骤平行操作，并在相同的色谱条件下分别进样，三份样品的色谱图均出现与标样相同保留时间的激素吸收峰；有标样的样品上HPLC仪后，在这些激素的保留时间处色谱峰高和峰面积均增大，说明样品内源激素和添加的激素标样叠加出峰，回收率＝(第3份的峰面积-第1份的峰面积)/(第2份的峰面积-第1份的峰面积)*100％，重复5次，所得结果为：IAA的平均回收率为95％，ABA的平均回收率为90％。