CN103123340B - 一种测定毛喉鞘蕊花中半日花烷型二萜的方法 - Google Patents

Abstract

本发明属天然药物质量分析领域，涉及毛喉鞘蕊花中半日花烷型二萜的测定方法，具体涉及一种采用基质固相分散技术检测毛喉鞘蕊花中半日花烷型二萜的方法。本发明采用基质固相分散技术萃取毛喉鞘蕊花中的二萜类成分，并去除极性与非极性干扰物，然后采用高效液相色谱法定性、定量分析异佛司可林等5种半日花烷型二萜。本发明方法简化了样品前处理的复杂过程，节省了时间，降低了有机溶剂的消耗，消除了液液萃取引起的乳化现象，检测方法准确、灵敏，为毛喉鞘蕊花提供了一种快速、有效的质量评价方法。

Description

一种测定毛喉鞘蕊花中半日花烷型二萜的方法

技术领域

本发明属天然药物质量分析领域，涉及一种测定毛喉鞘蕊花中半日花烷型二萜的方法，具体涉及一种采用基质固相分散技术检测毛喉鞘蕊花中半日花烷型二萜的方法。

背景技术

毛喉鞘蕊花Coleus forskohlii(Willd)Briq.系唇形科Labiatae鞘蕊花属Coleus Lour.植物，具有强心、降压、抗血栓、平喘等作用，长期用于治疗心血管疾病、感冒、咳嗽和呼吸紊乱等疾病。现有技术公开了毛喉鞘蕊花中的主要有效成分为半日花烷型二萜(又称劳丹烷型二萜)，包括异佛司可林(isoforskolin)、佛司可林(forskolin)等，上述成分通常作为毛喉鞘蕊花药材的质量评价指标。通常国外品种以佛司可林为指标，而国内品种中的主要有效成分为异佛司可林，故以其为定量指标；近年来也见有同时测定异佛司可林等多种半日花烷型二萜的研究报道。

目前，检测毛喉鞘蕊花药材中异佛司可林等半日花烷型二萜的方法主要采用高效液相色谱法(HPLC)，在常规分析中采用紫外(UV)、二极管阵列检测检测器(DAD)或蒸发光散射检测器(ELSD)；特殊需要时，如要求专属、灵敏地检测时，则联用贵重的质谱检测器(MS)。为了制得供液相分析的供试品溶液，常需要对样品进行前处理。

一般毛喉鞘蕊花以全草入药，其中含有叶绿素等多种极性与非极性杂质，待测成分半日花烷型二萜没有紫外特征吸收峰，在常规分析中采用200～210nm的紫外末端吸收或通用性的ELSD进行检测，上述检测方法的专属性不强，样品中各种各样的其他组分会被检出，从而对二萜的测定产生严重干扰。当采用专属的质谱检测器测定时，也要求样品洁净，否则将对质谱系统造成污染或产生基质效应，因此，要准确测定毛喉鞘蕊花药材中的异佛司可林等二萜类成分，样品前处理是至关重要的步骤。

有文献报道指出，为了有效地提取二萜类成分并去除干扰物，样品前处理过程一般需包括提取和净化两步，其中，提取方法包括索氏提取、超声提取、微波辅助萃取等，得到的提取物还需要进一步净化才能供液相色谱分析；净化方法包括液液萃取法、硅胶柱层析和氧化铝柱层析等。因此，上述的样品前处理的方法存在以下缺点：步骤复杂、耗时、有机溶剂的消耗量较大，液液萃取易引起乳化现象等。

基质固相分散(MSPD)是一种提取净化的新技术，其优点在于：集样品分散、提取和净化为一体，从而可简化操作过程，缩短样品制备时间；以及减少或避免样品多次浓缩和转溶造成的待测物损失，消除液液萃取产生的乳化现象。目前已有将MSPD技术用于天然药物中化学成分定量分析的报道，但该方面的研究有限，尚未见涉及针对毛喉鞘蕊花中二萜类成分的测定的报道。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的缺陷和不足，提供一种测定毛喉鞘蕊花中半日花烷型二萜的方法，尤其涉及一种采用基质固相分散技术检测毛喉鞘蕊花中半日花烷型二萜的方法；该方法解决目前液相色谱分析前样品前处理过程复杂、费时的问题。

本发明采用基质固相分散技术萃取毛喉鞘蕊花中的二萜类成分，并去除极性与非极性干扰物，然后采用高效液相色谱法定性、定量分析异佛司可林等5种半日花烷型二萜，本方法明显简化了样品前处理的复杂过程，节省了时间，降低了有机溶剂的消耗，消除了液液萃取引起的乳化现象，且准确、灵敏。

具体而言，本发明的测定毛喉鞘蕊花中半日花烷型二萜的方法，其特征在于，采用基质固相分散-液相色谱法测定毛喉鞘蕊花中的二萜，其包括步骤：

(1)药材药品的前处理

毛喉鞘蕊花药材粉末与倍量的固体载体于研钵中研磨，将获得的混合样品装入固相萃取小柱，先以5～10％甲醇为淋洗剂通过小柱，抽干，加入少量洗脱剂浸润，超声后或直接以洗脱剂通过小柱，收集洗脱液，蒸干，残渣用甲醇或含水甲醇复溶解，制得供试品溶液；

(2)液相色谱法测定上述供试品溶液中的半日花烷型二萜

采用高效液相色谱法(HPLC)，定性、定量分析半日花烷型二萜，其中，所述色谱分析的固定相为十八烷基键合硅胶，流动相为乙腈-水或甲醇-水；

本发明中，与液相联用的检测器可选自紫外、二极管阵列检测器、蒸发光散射检测器或质谱检测器；

本发明中，定性、定量分析的半日花烷型二萜包括异佛司可林、佛司可林、佛司可林G、佛司可林J和佛司可林A。

本发明的方法中，所述的毛喉鞘蕊花药材粉末与固体载体的质量比为0.1～1∶3～5；

所述的固体载体为烷基键合硅胶，本发明的一个实施例中优选C₁₈键合硅胶；

所述的洗脱剂选自甲醇、甲醇-乙酸乙酯或甲醇-二氯甲烷。

本发明方法进行了以下实验或测试，

(1)药材粉末与固体载体的质量比：固体载体的量太小，不能充分吸附药材中的待测组分；固体载体的量太大，后续淋洗和洗脱所需的溶剂量也相应增多，浪费载体和溶剂；结果表明，药材粉末(过50～80目筛)与固体载体的质量比为1∶3～5时能保证待测组分的充分吸附；

(2)研磨时间：研磨是基质固相分散的重要步骤；当样品在磨砂研钵中与固体载体研磨混匀时，产生剪切力，破坏样品的粗结构，使成为较小的微粒，增加样品的比表面积，使待测成分充分吸附到载体上；不同研磨时间的比较结果表明，研磨3～5min即可获得满意的效果；

(3)固体载体：载体的种类是选择性吸附待测组分的决定因素；本方法对硅胶、硅藻土、烷基键合硅胶如十八烷基键合硅胶、细沙等载体进行测试，结果表明，十八烷基键合硅胶对5种半日花烷型二萜的提取效果最好；

(4)洗脱程序：本方法以十八烷基键合硅胶为载体的洗脱程序，淋洗剂选自0～20％甲醇或乙醇，洗脱剂选自甲醇、乙醇、甲醇-水、甲醇-乙酸乙酯、乙醇-乙酸乙酯、甲醇-二氯甲烷等；结果表明，采用0～10％甲醇淋洗既可保证待测组分的回收率，又尽可能除去极性杂质；

本方法中，洗脱剂采用甲醇、甲醇-乙酸乙酯或甲醇-二氯甲烷能使5种待测组分的回收率均在95～105％。

本发明的测定毛喉鞘蕊花中半日花烷型二萜的方法，能明显简化样品前处理的复杂过程，节省了时间，降低了有机溶剂的消耗，消除了液液萃取引起的乳化现象，本检测方法准确、灵敏，为毛喉鞘蕊花提供了一种快速、有效的质量评价方法。

本发明的方法与现有技术相比，具有以下优点：

(1)样品的提取和净化合为一体，简化了操作过程，缩短了处理时间，制备一个样品只需20～30min；已报道的样品前处理一般包括提取和净化两步，按照文献步骤进行操作，结果显示，以制备一个样品计算，采用索氏提取结合液液萃取净化、索氏提取结合硅胶或氧化铝柱层析、超声提取结合柱层析，以及微波辅助萃取结合柱层析所需时间分别约为5、5、1和1h；

(2)样品和有机溶剂的用量少；本发明方法只需用0.1～1g药材粉末，而现有技术需8～15g样品；由于本方法所用的样品量少、步骤简化，因此，消耗的有机溶剂量显著减少；

(3)消除了液液萃取引起的乳化现象，降低对提取效率和方法重现性的影响。

(4)制得的样品洁净，适用于液相色谱及液相联用的检测器的定性、定量分析。

为了便于理解，下面通过附图和具体实施例对本发明的测定毛喉鞘蕊花中半日花烷型二萜的方法的方法进行详细的描述。需要特别指出的是，具体实施例和附图仅是为了说明，显然本领域的技术人员可以根据本文说明，对本发明进行各种修正或改变，这些修正和改变也将纳入本专利范围之内。

附图说明

图1：实施例1的HPLC-MS/MS色谱图，其中，a为5种半日花烷型二萜对照品，b为毛喉鞘蕊花供试品溶液；色谱峰：1为异佛司可林，2为佛司可林，3为佛司可林G，4为佛司可林J，5为佛司可林A。

图2：实施例2的HPLC-ELSD色谱图，其中，a为5种半日花烷型二萜对照品，b为毛喉鞘蕊花供试品溶液；色谱峰：1为异佛司可林，2为佛司可林，3为佛司可林G，4为佛司可林J，5为佛司可林A。

具体实施方式

实施例1

采用本发明的基质固相分散法对毛喉鞘蕊花干燥全草进行前处理，然后采用高效液相色谱串联质谱法(HPLC-MS/MS)对5种半日花烷型二萜进行鉴定，其包括：

(1)样品前处理

精密称定毛喉鞘蕊花全草药材粉末(过60目筛)0.10g，十八烷基键合硅胶0.5g，置玻璃研钵中，混合研磨3min，将混合物装入底部垫有筛板的空柱管，顶面放置筛板，活塞压实，将固相萃取柱置于固相萃取装置上，先以10％甲醇5mL快速淋洗，真空抽干，然后用甲醇8mL以约2mL/min的流速洗脱，收集洗脱液，于50℃水浴中氮气吹干，残渣用甲醇1mL复溶解，离心5min(10000rpm)，吸取上清液，用甲醇稀释50倍，作为供试品溶液。

(2)HPLC-MS/MS法鉴定半日花烷型二萜

采用安捷伦公司1200 HPLC-APCI-MSⁿ系统，色谱条件：色谱柱为Kromasil C₁₈柱(250mm×4.6mm，5μm，Phenomenex)，保护柱为C₁₈(4.0mm×3.0mm，5μm，Phenomenex)；流动相采用水(A)-乙腈(B)梯度洗脱，梯度程序为：0～8min，维持在A-48％与B-52％，8～18min，线性升高B的比例，至13min为A-34％与B-66％，维持至18min；柱温30～40℃；流速1.0mL/min；进样体积5μL；检测时间18min。质谱条件：大气压化学电离，负离子模式，离子源温度为400℃，N₂气流速为10mL/min，离子喷雾电压为-4500V，入口电压(EP)为-10V，碰撞室出口电压(CXP)为-15V。

根据5种半日花烷型二萜对照品一级和二级质谱的质谱峰情况，选择以下离子对检测供试品溶液中的二萜：异佛司可林m/z 409.5→367.4，佛司可林m/z 409.5→349.5，佛司可林G m/z 435.2→365.2，佛司可林J m/z 451.2→331.4，佛司可林A m/z 493.2→451.4。通过与对照品比较离子对的m/z和相应离子对通道的色谱峰保留时间，判断供试品中是否含有待测化合物。对照品与供试品溶液的HPLC-MS/MS色谱图如图1所示，结果表明，所述供试品中含有所述5种二萜。

实施例2

采用基质固相分散法对毛喉鞘蕊花干燥全草进行前处理，然后采用高效液相色谱-蒸发光散射检测器(HPLC-ELSD)定量测定半日花烷型二萜，其包括步骤：

(1)样品前处理

精密称定毛喉鞘蕊花全草药材粉末(过60目筛)0.25g，十八烷基键合硅胶1g，置玻璃研钵中，混合研磨5min。将混合物装入底部垫有筛板的空柱管，顶面放置筛板，活塞压实。将固相萃取柱置于固相萃取装置上，先以5％甲醇5mL快速淋洗，真空抽干，以乙酸乙酯∶甲醇(1∶4)约3mL浸润，柱下端活塞封住，水浴超声(45kHz)2min，然后用乙酸乙酯∶甲醇(1∶4)10mL以约1.5mL/min的流速洗脱，收集，于50℃水浴中氮气吹干，残渣用甲醇1mL复溶解，离心5min(10000rpm)，吸取上清液，作为供试品溶液。

(2)HPLC-ELSD法定量分析半日花烷型二萜

采用安捷伦公司1200 HPLC-ELSD系统。色谱条件中进样体积为20μL，其余同实施例1。蒸发光散射检测器检测条件：漂移管温度68℃，增益7，氮气分压3.5bar。

分别精密吸取含5种待测二萜的对照品溶液和供试品溶液，注入液相色谱仪分析，以峰面积法计算含量。对照品与供试品溶液的HPLC-ELSD色谱图(图2)显示，5种待测成分的色谱峰分离良好，样品中其他组分不干扰5种成分的测定，方法的专属性良好。分析结果显示，5种成分在5～200μg/mL范围内均呈良好线性关系(r＞0.9995)，日内和日间测定的RSD≤1.96％(n＝3)，样品重复测定的RSD≤4.70％(n＝6)，加样回收率在98.36～102.08％范围内。

上述方法学验证的结果表明，本方法测得的各项指标符合定量分析的要求，可准确测定样品中异佛司可林、佛司可林、佛司可林G、佛司可林J和佛司可林A的含量。

Claims (4)

1.一种测定毛喉鞘蕊花中半日花烷型二萜的方法，其特征在于，采用基质固相分散–液相色谱法测定毛喉鞘蕊花中的二萜，其包括步骤：

（1）药材药品的前处理

毛喉鞘蕊花药材粉末与倍量的固体载体十八烷基键合硅胶置于研钵中研磨3～5min，将混合样品装入固相萃取小柱，以0～10%甲醇作为淋洗剂通过小柱，抽干，加入少量洗脱剂浸润，超声后或直接以洗脱剂通过小柱，收集洗脱液，蒸干，残渣用甲醇或含水甲醇复溶解，制得供试品溶液，

所述的洗脱剂选自甲醇、甲醇–乙酸乙酯或甲醇–二氯甲烷；

（2）采用液相色谱法测定制得的供试品溶液中的半日花烷型二萜，

采用高效液相色谱法HPLC测定，所述色谱分析的固定相为十八烷基键合硅胶，流动相为乙腈–水或甲醇–水；与液相联用的检测器选自紫外、二极管阵列检测器、蒸发光散射检测器或质谱检测器。

2.按权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的毛喉鞘蕊花药材粉末与固体载体的质量比为0.1～1：3～5。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（2）中，色谱条件：色谱柱为Kromasil C₁₈柱250mm×4.6mm，5μm，Phenomenex，保护柱为C₁₈4.0mm×3.0mm，5μm，Phenomenex；流动相采用水A–乙腈B梯度洗脱，梯度程序为：0～8min，维持在A-48%与B-52%，8～18min，线性升高B的比例，至13min为A-34%与B-66%，维持至18min；柱温30～40℃；流速1.0mL/min；进样体积5μL；检测时间18min；质谱条件：大气压化学电离，负离子模式，离子源温度为400℃，N₂气流速为10mL/min，离子喷雾电压为-4500V，入口电压（EP）为-10V，碰撞室出口电压（CXP）为-15V。

4.按权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的半日花烷型二萜包括异佛司可林、佛司可林、佛司可林G、佛司可林J和佛司可林A。

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