CN106596797B - 鞘蕊苏胶囊的含量测定 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种鞘蕊苏胶囊的含量测定方法，所述方法采用高效液相色谱法，包括以下步骤步骤1、称取异佛司可林对照品，加甲醇制成每ml含0.1‑0.3mg的溶液；步骤2、取鞘蕊苏胶囊，倾出内容物，混匀，取1份，加乙醇30‑100份，超声(或回流、索式提取)，过滤，取续滤液，蒸干，或不经上述方法提取，加入硅胶2‑4份，加入乙醇5‑7份，拌匀，蒸干，研匀，移至硅胶柱上，用体积比为3:1的石油醚‑乙酸乙酯混合溶液120‑180份洗脱，收集洗脱液，移至含2‑4％AgNO3的硅胶柱上，AgNO3的硅胶用量3‑8份，弃去流出液，用体积比为2:1的石油醚‑乙酸乙酯混合溶液90‑180份洗脱，弃去洗脱液，再用用体积比为3:1的石油醚‑乙酸乙酯混合溶液90‑180份洗脱，收集洗脱液，蒸干，用甲醇溶解并转移至2‑5倍量瓶中，加甲醇至刻度，过滤；步骤3、分别吸取对照品溶液及供试品溶液各5‑20μl，注入液相色谱仪，得到色谱图，根据色谱图计算供试品溶液中有效成分异佛司可林的含量。

Description

鞘蕊苏胶囊的含量测定
技术领域：
本发明涉及一种药物检测方法，特别涉及一种鞘蕊苏胶囊的含量测定方法。
背景技术：
慢性支气管炎是气管、支气管粘膜及其周围组织的慢性非特异性炎症，临床上以咳嗽、咳痰或伴有气喘及反复发作的慢性过程为特征。病情呈缓慢进行性进展，常并发阻塞性肺气肿，严重者常发生肺动脉高压，甚至肺源性心脏病。本病为一常见多发病，以中老年为常见。西医治疗近期虽然疗效确切，但对抗菌素不敏感的耐药菌株曰益增多，以及西药过敏反应与毒副作用的频繁发生，治疗常收不到满意效果，近几年，尽管有新的抗菌药不断问世，但对其不敏感的耐药菌株也在逐渐增加。而中药具有广谱的抗感染作用及祛痰平喘作用，且疗效稳定，无不良反应。所以，中医药治疗慢性支气管炎急性发作具有广阔的前景，而研制开发疗效确切、不良反应少的中药制剂具有良好的社会效益和经济效益。
鞘蕊苏胶囊由鞘蕊苏、前胡、甘草三昧药物组成，具有清热化痰、止咳平喘功效，可以用来治疗慢性支气管炎急性发作期的痰热郁肺证。临床前药理学实验研究表明:鞘蕊苏胶囊既具有止咳、平喘、抗炎、抑菌作用，又具有增强机体免疫和抗疲劳作用。
近年来，有报道，对鞘蕊苏药材中的有效成分异佛司可林进行含量测定。方法:采用高效液相色谱法(HPLC)进行含量测定。结果:异佛司可林含量在1.24～12.4μg范围内线性关系良好,平均回收率为102.2％,RSD＝1.35％。
有报道，鞘蕊苏胶囊中异佛斯可林的含量测定方法。用高效液相色谱-蒸发光散射检测法(HPLC-ELSD),Alltima C-18色谱柱,流动相为乙腈-水(43:57),流速为1.0ml·min～(-1)；蒸发光散射检测器参数:漂移管温度40℃,气压3.5bar。结果:异佛斯可林在0.32～6.40μg(r＝0.9999)范围内线性关系良好,平均回收率分别为98.04％(RSD＝1.1％)。但所建立的检测时间为80分钟，分析耗时长，损耗试剂多，不利于进行多批次样本的分析。
因此，急需建立一种检测更加全面、更快速的鞘蕊苏胶囊质量评价方法。
发明内容：
本发明提供一种鞘蕊苏胶囊的含量测定方法，所述方法采用高效液相色谱法，包括以下步骤
步骤1、对照品溶液的制备：称取异佛司可林对照品，加甲醇制成每ml含0.1-0.3mg的溶液；
步骤2、取鞘蕊苏胶囊，倾出内容物，混匀，取1份，加乙醇30-100份，超声(或回流、索式提取)，过滤，取续滤液，蒸干，或不经上述方法提取，加入硅胶2-4份，加入乙醇5-7份，拌匀，蒸干，研匀，移至硅胶柱上，用体积比为3:1的石油醚-乙酸乙酯混合溶液120-180份洗脱，收集洗脱液，移至含2-4％AgNO3的硅胶柱上，AgNO3的硅胶用量3-8份，弃去流出液，用体积比为2:1的石油醚-乙酸乙酯混合溶液90-180份洗脱，弃去洗脱液，再用用体积比为3:1的石油醚-乙酸乙酯混合溶液90-180份洗脱，收集洗脱液，蒸干，用甲醇溶解并转移至2-5倍量瓶中，加甲醇至刻度，过滤；
步骤3、分别吸取对照品溶液及供试品溶液各5-20μl，注入液相色谱仪，得到色谱图，根据色谱图计算供试品溶液中有效成分异佛司可林的含量。
优选的，本发明的鞘蕊苏胶囊的含量测定方法，所述方法包括以下步骤：
步骤1、对照品溶液的制备：称取经60℃减压干燥至恒重的异佛司可林对照品，加甲醇制成每1ml含0.15mg的溶液；
步骤2、供试品溶液的制备：取鞘蕊苏胶囊10粒，倾出内容物，混匀，取约1.0g，精密称定，加入100-200目硅胶3.0g，加入6ml乙醇拌匀，水浴蒸干，研匀，照中国药典2015年版四部0511柱色谱法试验，移至100-200目硅胶硅胶柱上，用量4g，柱内经1.5cm，湿法装柱，用体积比为3:1的石油醚-乙酸乙酯混合溶液150ml洗脱，收集洗脱液，移至含3％AgNO3硅胶柱上，弃去流出液，用体积比为2:1的石油醚-乙酸乙酯混合溶液150ml洗脱，弃去洗脱液，再体积比为3:1的石油醚-乙酸乙酯混合溶液120ml洗脱，收集洗脱液，水浴蒸干，用甲醇溶解并转移至5ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，微孔滤膜过滤；
步骤3、测定分别精密吸取对照品溶液及供试品溶液各20μl，注入液相色谱仪，得到色谱图，根据色谱图计算供试品溶液中有效成分异佛司可林的含量。
其中，色谱条件如下：
用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；乙腈－0.1％三乙胺水溶液(用磷酸调pH至4.0)(40:60)为流动相；检测波长为210nm。理论塔板数按异佛司可林峰计算应不低于5000。
本发明是经过筛选获得的，筛选过程如下：
1仪器与试剂
1.1Ultimate－3000高效液相色谱系统。
1.2色谱柱：Thermo BETASIL C18柱250mm×4.6mm 5μm
1.3异佛司可林对照品自提，经高效液相色谱面积归一法测定含量为98.8％
1.4鞘蕊苏胶囊：批号20140902，供含量测定方法学考察用。
1.5试剂：乙腈、三乙胺、磷酸，色谱纯，其它为分析纯
2色谱条件的优化
2.1测定波长的选择
异佛司可林虽然在其结构式中无明显共轭双键结构，但Merck索引报道其中210nm及305nm处有最大吸收(之比为1000:50)，经对其进行光谱扫描，其在210nm处有较强烈的紫外吸收峰，而流动相乙腈-0.1％三乙胺水溶液(用磷酸调pH至4.0)(40:60)在210nm处的吸收度为0.05左右，符合《中国药典》2015年版四部高效液相色谱法对溶剂的要求，故选择以210nm作为测定波长检视异佛司可林峰。
2.2流动相选择
经比较选用甲醇－水、甲醇－磷酸盐缓冲液以及乙腈－水等洗脱系统，发现采用乙腈－0.1％三乙胺水溶液(用磷酸调PH至4.0)(40:60)洗脱系统，既可使异佛司可林峰形良好，与供试品色谱中其余干扰杂质达基线分离，同时偏酸的洗脱系统也可使三乙胺的加入不会导致硅烷键合相从硅醇基上脱落，较好地保护色谱柱。
2.3柱温考察
以同一供试品溶液，采用不同柱温进行测定，考察不同柱温异佛司可林对保留时间、峰面积、分离度和理论板数的影响。
表1不同柱温考察结果
柱温 保留时间 峰面积 分离度 理论板数
25℃ 18.1203 8.4310 0.91 9032
18.1420 8.4256 0.91 9158
30℃ 17.7611 8.4265 0.92 9217
17.7820 8.4322 0.92 9233
35℃ 17.3345 8.4219 0.92 9177
17.2928 8.4355 0.92 9159
结果表明，不同柱温对异佛司可林对保留时间、峰面积、分离度和理论板数的无明显影响，选择柱温30℃。
2.4进样量的选择
以同一供试品溶液，分别取10μl、20μl进样，考察进样量对保留时间、峰面积、分离度和理论板数的影响。
表2不同进样量考察结果
进样量 保留时间 峰面积 分离度 理论板数
10μl 17.753 4.2146 0.92 9277
17.763 4.2211 0.92 9257
20μl 17.7611 8.4265 0.92 9217
17.7820 8.4322 0.92 9233
结果表明，不同进样量对异佛司可林对保留时间、分离度和理论板数的无明显影响，进样量加倍则峰面积加倍，考虑到异佛司可林吸收度低，峰面积小，选择进样20μl。
根据试验结果，综合考虑到仪器、色谱柱、流动相的配制和温度等系统因素的影响，其柱效和分离度都有一定的影响，因而在异佛司可林与杂质达到分离的前提下，规定理论板数按异佛司可林峰计算应不低于5000。综合文献及本研究结果，综合多方面的原因，确定本方法学的色谱条件如下：
色谱条件与系统适用性试验用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；乙腈－0.1％三乙胺水溶液(用磷酸调pH至4.0)(40:60)为流动相；检测波长为210nm；柱温30℃；进样量20μl。理论塔板数按异佛司可林峰计算应不低于5000。
3供试品制备考察
3.1提取方法
3.1.1超声法
取胶囊10粒，倾出内容物，混匀，取约2.0g，精密称定，精密加入乙醇100ml，密塞，称定重量，超声提取(功率1200w，频率28kHz)60min，放冷，再称定重量，用乙醇补足减失的重量，滤过，取续滤液50ml，水浴蒸至约5ml，加入硅胶(100-200目)3.0g，拌匀，水浴蒸干，研匀，其余按质量标准正文含量测定项下操作。
3.1.2回流法
取胶囊10粒，倾出内容物，混匀，取约2.0g，精密称定，精密加入乙醇100ml，密塞，称定重量，水浴回流提取60min，放冷，再称定重量，用乙醇补足减失的重量，滤过，取续滤液50ml，水浴蒸至约5ml，加入硅胶(100-200目)3.0g，拌匀，水浴蒸干，研匀，其余按质量标准正文含量测定项下操作。
3.1.3直接研磨
取胶囊10粒，倾出内容物，混匀，取约1.0g，精密称定，加入硅胶(100-200目)3.0g，加入乙醇适量(约6ml)拌匀，水浴蒸干，研匀，其余按质量标准正文含量测定项下操作。
表3提取方法考察结果
Figure BDA0001213650190000051
结果可见，以上三种方法，所测得的鞘蕊苏胶囊含量基本相同，故选择最为简洁的直接研磨法作为供试品提取方法。
3.2纯化方法
3.2.1硅胶柱石油醚-乙酸乙酯(3:1)用量考察
供试品溶液制备，取胶囊10粒，倾出内容物，混匀，取约1.0g，4份，精密称定，分别加入硅胶(100-200目)3.0g，加入乙醇适量(约6ml)拌匀，水浴蒸干，研匀，照柱色谱法(《中国药典》2015年版四部附录0511)试验，移至硅胶柱上(100-200目硅胶，用量4g，柱内经1.5cm，湿法装柱)，用洗脱，洗脱剂用量分别为90ml、120ml、150ml、180ml，洗脱液移至含3％AgNO3硅胶柱上，其余按质量标准正文含量测定操作。
表4石油醚-乙酸乙酯(3:1)用量考察结果
Figure BDA0001213650190000052
结果可见，石油醚－乙酸乙酯(3:1)120ml异佛司可林基本洗脱完成全，为保险起见 此步选择石油醚－乙酸乙酯(3:1)150ml洗脱。
3.2.2 AgNO3硅胶柱石油醚-乙酸乙酯(2:1)用量考察
取胶囊10粒，倾出内容物，混匀，取约1.0g，3份，精密称定，分别加入硅胶(100-200目)3.0g，加入乙醇适量(约6ml)拌匀，水浴蒸干，研匀，照柱色谱法(《中国药典》2015年版四部附录0511)试验，移至硅胶柱上(100-200目硅胶，用量4g，柱内经1.5cm，湿法装柱)，石油醚-乙酸乙酯(3:1)150ml洗脱，收集洗脱液，移至含3％AgNO3硅胶柱上(取3％AgNO3硅胶5g，湿法装柱)，弃去流出液，用石油醚-乙酸乙酯(2:1)洗脱，洗脱剂用量分别为120ml、150ml、180ml，弃去洗脱液，各柱再用石油醚-乙酸乙酯(1:3)120ml洗脱，其余按质量标准正文含量测定项下操作。
表5石油醚-乙酸乙酯(2:1)用量考察结果
Figure BDA0001213650190000061
结果可见，石油醚－乙酸乙酯(3:1)120-180ml异佛司可林基本无洗脱，石油醚－乙酸乙酯(3:1)洗脱至150ml时，洗脱液已基本无色，此洗脱系统能去除的杂质基本洗脱完全，此步选择石油醚－乙酸乙酯(3:1)150ml洗脱。
3.2.3石油醚-乙酸乙酯(1:3)用量考察
取胶囊10粒，倾出内容物，混匀，取约1.0g，4份，精密称定，分别加入硅胶(100-200目)3.0g，加入乙醇适量(约6ml)拌匀，水浴蒸干，研匀，照柱色谱法(《中国药典》2015年版四部附录0511)试验，移至硅胶柱上(100-200目，用量4g，柱内经1.5cm，湿法装柱)，石油醚-乙酸乙酯(3:1)150ml洗脱，收集洗脱液，移至含3％AgNO3硅胶柱上(取3％AgNO3硅胶5g，湿法装柱)，弃去流出液，用石油醚-乙酸乙酯(2:1)150ml洗脱，再用石油醚-乙酸乙酯(1:3)洗脱，洗脱剂用量分别为90ml、120ml、150ml、180ml，收集洗脱液，水浴蒸干，其余按质量标准正文含量测定项下操作。
表6石油醚-乙酸乙酯(1:3)用量考察结果
Figure BDA0001213650190000071
结果可见，石油醚－乙酸乙酯(1:3)90-180ml洗脱各样品异佛司可林含量无明显差别，90ml异佛司可林已基本洗脱完全，为保险起见，此步选择石油醚－乙酸乙酯(1:3)120ml洗脱。
3.2.4 AgNO3硅胶用量的考察
按质量标准正文含量测定项下操作，制备供试品溶液3份，3％AgNO3硅胶分别为4g、5g、6g，含量测定。
表7 AgNO3硅胶用量考察结果
Figure BDA0001213650190000072
结果表明，3％AgNO3硅胶用量为4-6g时各样品异佛司可林含量无明显差别，此步选择3％AgNO3硅胶用量5g。
3.2.5 AgNO3占硅胶比例的考察
按质量标准正文含量测定项下操作，制备供试品溶液3份，AgNO3占硅胶比例分别为1％、2％、3％，含量测定。
表8 AgNO3占硅胶比例考察结果
Figure BDA0001213650190000073
Figure BDA0001213650190000081
结果表明，AgNO3占硅胶比例为1％时对异佛司可林的吸附稍差，AgNO3占硅胶比例为2％、3％时对异佛司可林吸附效果相当，考虑到AgNO3不稳定，此步选择AgNO3占硅胶比例为3％。
综上，供试品溶液的制备方法如下：
取胶囊10粒，倾出内容物，混匀，取约1.0g，精密称定，加入硅胶(100-200目)3.0g，加入乙醇适量(约6ml)拌匀，水浴蒸干，研匀，照柱色谱法(《中国药典》2015年版四部附录0511)试验，移至硅胶柱上(100-200目硅胶，用量4g，柱内经1.5cm，湿法装柱)，石油醚-乙酸乙酯(3:1)150ml洗脱，收集洗脱液，移至含3％AgNO3硅胶柱上(取3％AgNO3硅胶5g，湿法装柱)，弃去流出液，用石油醚-乙酸乙酯(2:1)150ml洗脱，弃去洗脱液，再用石油醚-乙酸乙酸(1:3)120ml洗脱，收集洗脱液，水浴蒸干，用甲醇溶解并转移至5ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，微孔滤膜过滤，即得。
4方法学考察
4.1色谱条件与系统适用性试验
色谱柱：C18(4.6mm×250mm，5μm)，流动相：乙腈－0.1％三乙胺水溶液(用磷酸调pH至4.0)(40:60)，流速：1.0ml/min，检测波长：210nm，柱温：30℃，进样量：20μl。在以上色谱条件下，异佛司可林的保留时间约18分钟，理论板数为8000左右，与其他杂质峰的分离度＞1.5，暂定理论板数(n)按异佛司可林峰计算应不低于5000。空白试验无干扰。
4.2对照品溶液的制备
精密称取经60℃减压干燥至恒重的异佛司可林对照品，加甲醇制成每1ml含0.15mg的溶液，即得。
4.3线性及其范围
由于样品含量波动较大，因此选择了6点测定标准曲线，采用等比稀释方式尽可能涵盖了含量范围。
精密称取异佛司可林对照品31.48mg于50ml容量瓶，加甲醇溶解并稀释至刻度，超声使溶解，得到对照品溶液①0.6296mg/ml，分别吸取对照品溶液5ml、20ml、5ml、5ml至10ml、50ml、25ml、50ml容量瓶中，分别加甲醇至刻度，摇匀，得对照品溶液②0.3148mg/ml、对照品溶液③0.25184mg/ml、对照品溶液④125.92μg/ml、对照品溶液⑤62.96μg/ml，吸取对照品溶液⑤5ml至10ml，加甲醇至刻度，摇匀得对照品溶液⑥31.48μg/ml，分别吸取上述对照品溶液20μl注入高效液相色谱仪，测定。以对照品浓度为横坐标，峰面积为纵坐标绘制标准曲线。
结果表明：异佛司可林对照品在31.48μg/ml～0.6296mg/ml范围内峰面积成良好线性关系。
表9线性范围考察
Figure BDA0001213650190000091
异佛司可林标准曲线：y＝48.756x-0.04506，R2＝0.99994
4.4定量限
考虑到鞘蕊苏胶囊含量波动，部分样品中异佛司可林含量较低，采用Ultimate－3000工作站进行了信噪比分析，确定了方法的定量限和检测限，取对照品溶液⑥2ml至10ml容量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，得对照品溶液⑦6.296μg/ml，吸取20μl注入高效液相色谱仪，测定，信噪比为28，计算定量限(10倍信噪比)为1.42μg/ml，检测限(3倍信噪比)为0.67μg/ml。
4.5稳定性
取鞘蕊苏胶囊(批号140902)，按“供试品溶液制备”项处理，在0h，2h，4h，6h，9h，12h吸取20μl注入高效液相色谱仪，测定含量。
表10稳定性试验结果
Figure BDA0001213650190000101
结果表明，在24h内供试品溶液异佛司可林的峰面积RSD均小于1％，说明供试品溶液在24小时内稳定。
4.6准确度
取已知异佛司可林含量的供试品粉末1.0g(批号：140902)3份，分别按照供试品含量的50％加对照品溶液③1.7ml，取已知异佛司可林含量的供试品粉末1.0g(批号：140902)共3份，分别按照供试品含量的100％加对照品溶液③3.4ml，取已知异佛司可林含量的供试品粉末1.0g(批号：140902)3份，分别按照供试品含量的200％加对照品溶液③6.7ml，按照供试品制备方法制备供试品溶液，吸取20μl注入高效液相色谱仪，测定，计算加样回收率，计算公式为：
回收率％＝(C–A)/B×100％
式中A为供试品异佛司可林含量，B为加入对照品量，C为实测值。
表11异佛司可林加样回收率结果
Figure BDA0001213650190000102
Figure BDA0001213650190000111
结果表明，在50％、100％、200％加样时，回收率RSD均小于3％，说明含量测定方法准确良好，符合规定。
4.7.1重复性
取供试品粉末(批号：140902)0.5g3份、1.0g3份、2.0g3份，分别按“供试品溶液制备”项处理，分别吸取20μl注入高效液相色谱仪，测定。
表12重复性试验结果
Figure BDA0001213650190000112
结果表明，供试品取样量为50％、100％、200％时，RSD为<3％，重复性良好，符合规定。
4.8耐用性
4.8.1不同色谱柱
选择色谱柱1(Thermo BETASIL C18 4.6×250mm5μm)、柱2(Phenomenx GenminiC18 4.6×250mm5μm)，对含量测定方法进行验证。
表13不同色谱柱试验结果
Figure BDA0001213650190000113
Figure BDA0001213650190000121
结果表明，该含量测定方法对不同反相C18色谱柱具有较好的适用性。
4.8.2不同仪器
选择仪器1Ultimate－3000、仪器Agilent-1100，对含量测定方法进行验证。
表14不同仪器精密度结果
Figure BDA0001213650190000122
结果表明，该含量测定方法对不同仪器具有较好的适用性。
附图说明
图1、异佛司可林对照品色谱图
图2、鞘蕊苏胶囊色谱图
图3、空白样品色谱图
图4、异佛司可林标准曲线：
具体实施方式：
以下通过实施例进一步说明本发明，但不作为对本发明的限制。
实施例1
一种鞘蕊苏胶囊的含量测定方法，所述方法包括以下步骤
步骤1、对照品溶液的制备：称取经60℃减压干燥至恒重的异佛司可林对照品，加乙 腈制成每1ml含0.15mg的溶液，即得。
步骤2、供试品溶液的制备：取鞘蕊苏胶囊10粒，倾出内容物，混匀，取约1.0g，精密称定，加入硅胶(100-200目)3.0g，加入乙醇适量(约6ml)拌匀，水浴蒸干，研匀，照柱色谱法(《中国药典》2010年版四部0511)试验，移至硅胶柱上(100-200目硅胶，用量4g，柱内经1.5cm，湿法装柱)，石油醚-乙酸乙酯(3:1)150ml洗脱，收集洗脱液，移至含3％AgNO3硅胶柱上(取3％AgNO3硅胶5g，湿法装柱)，弃去流出液，用石油醚-乙酸乙酯(2:1)150ml洗脱，弃去洗脱液，再用石油醚-乙酸乙酯(1:3)120ml洗脱，收集洗脱液，水浴蒸干，用甲醇溶解并转移至5ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，微孔滤膜过滤，即得。
步骤3、测定分别精密吸取对照品溶液及供试品溶液各20μl，注入液相色谱仪，得到色谱图，根据色谱图计算供试品溶液中有效成分异佛司可林的含量。
其中，色谱条件如下：
用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；乙腈－0.1％三乙胺水溶液(用磷酸调pH至4.0)(40:60)为流动相；检测波长为210nm。理论塔板数按异佛司可林峰计算应不低于5000。

Claims (1)

1.一种鞘蕊苏胶囊的含量测定方法，所述方法采用高效液相色谱法，包括以下步骤：
步骤1、对照品溶液的制备：称取经60℃减压干燥至恒重的异佛司可林对照品，加乙腈制成每1ml含0.15mg的溶液，即得，
步骤2、供试品溶液的制备：取鞘蕊苏胶囊10粒，倾出内容物，混匀，取约1.0g，精密称定，加入100-200目硅胶3.0g，加入乙醇适量拌匀，水浴蒸干，研匀，照《中国药典》2010年版四部0511柱色谱法试验，移至硅胶柱上，选用100-200目硅胶，用量4g，柱内径1.5cm，湿法装柱，以3:1＝石油醚-乙酸乙酯150ml洗脱，收集洗脱液，移至含3％AgNO3硅胶柱上，AgNO3硅胶5g，湿法装柱，弃去流出液，用2:1＝石油醚-乙酸乙酯150ml洗脱，弃去洗脱液，再用1:3＝石油醚-乙酸乙酯120ml洗脱，收集洗脱液，水浴蒸干，用甲醇溶解并转移至5ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，微孔滤膜过滤，即得，
步骤3、测定分别精密吸取对照品溶液及供试品溶液各20μl，注入液相色谱仪，得到色谱图，根据色谱图计算供试品溶液中有效成分异佛司可林的含量，
其中，色谱条件如下：
用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；40:60＝乙腈－0.1％三乙胺水溶液为流动相,用磷酸调pH至4.0；检测波长为210nm，理论塔板数按异佛司可林峰计算应不低于5000。
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