CN101672831A - 总芸苔素含量的液相色谱测定方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种总芸苔素含量的液相色谱测定方法，属于色谱分析检测技术领域。它包括苯硼酸类物标准品溶液的配制；芸苔素类物标准溶液的配制；天然芸苔素类物试样溶液的配制；在适当的条件下，使苯硼酸类物与所有具有邻羟基的芸苔素进行衍生化反应。本发明较好地解决了从天然物质中提取的芸苔素类物中芸苔素总量的测定，对科学地指导科研、生产和应用具有很大的意义和价值。适合对从天然物质中提取的芸苔素类物中芸苔素总量的测定。

Description

总芸苔素含量的液相色谱测定方法

所属技术领域

本发明涉及一种植物生长调节剂含量的液相色谱测定方法，尤其是芸苔素的液相色谱测定方法，属于色谱分析检测技术领域。

背景技术

目前，芸苔素类物是植物生长调节剂类物质，有促进植物细胞伸长、分裂、提高结实率和全面调节植物生长发育的作用。对粮、棉、油、麻、果、菜及食用菌有明显的增产效果，目前国内外在农业生产中均已广泛应用。天然芸苔素类物由于其来源于自然，具有高效、无毒、无污染的优点，是今后绿色农药的发展方向。

从天然物质中提取的芸苔素是一类物质，目前国内外已发现并认可的天然芸苔素已有近50多种，总称为芸苔素类物，时至今日，迫切需要一种能较准确地测定其总量的检测方法，但由于目前尚不能准确测其总量，因而对商品的生产和应用带来很大的盲目性，是不利的。

国内外有人报导了芸苔素的测定方法，如：“高效液相色谱法测定22S，23S，23R表高油菜素内酯”；“高效液相色谱法测定槟榔花粉中的芸苔素内酯”；“丙酰芸苔素内酯的气相色谱分析”：“Anal ChimActa，1990；228(1)；101”；“AnalSci，1988；4(5)；533；CA，109；226035W”等。总结如下：他们都是将芸苔素类物中的某一种物质，如：芸苔素内酯(BR)、表芸苔素内酯(ep-BR)、表高芸苔素内酯(BR-120)、丙酰芸苔素内酯、扁豆甾醇内酯、高扁豆甾醇内酯、栗甾酮等衍生化后，使用色谱法测定(气相色谱或液相色谱)，使用的检测器有：紫外检测器、荧光检测器、电化学检测器等。在衍生化方面，使用下列衍生化试剂：1-氰基异吲哚-2-间-苯硼酸、9一菲硼酸、二甲氨基萘-5-磺酰硼酸、二茂铁硼酸、萘硼酸和苯硼酸等，其方法的特点是：测定芸苔素衍生化后生成的芸苔素衍生物的量，来对该种芸苔素定量。

另外，国内外目前应用的这类方法，对组分相对单一的产品，如：用合成方法生产的某一种芸苔素原药和产品或用提取方法得到的某一种芸苔素的分析来说是适用的，方法准确，结果令人满意，但只能测定该种芸苔素的含量。对从天然物质中提取的芸苔素类物来说，是不适用的，原因很简单，从天然物质中提取的芸苔素是多种芸苔素的混合物，组分可能多达几种到数十种，想用上述测定单一含量的方法来测定其总含量是不可能的，也是不现实和无操作性的，目前市面上还无所有上述各芸苔素标准品的成品。

发明内容

为了克服现有芸苔素类物中总芸苔素含量不能准确测定的不足，本发明提供一种利用液相色谱测定芸苔素类物衍生化后剩余的衍生化试剂的量，来对芸苔素类物的总量进行定量的方法。

本发明解决此技术问题所采用的技术方案是：总芸苔素含量的液相色谱测定方法，所用仪器、试剂、色谱条件、样品处理、测定及计算步骤如下：

仪器：

高效液相色谱仪；手动进样器；紫外-可见光检测器；数据处理机；

试剂：

甲醇或乙腈；乙酸乙酯(A.R)；芸苔素类物标准品；苯硼酸类物标准品；天然芸苔素类物和制剂；

色谱条件：

色谱柱：6.0mm I.d.×150mm不锈钢柱，内装填料；

流动相组成体积比：甲醇(乙腈)∶水＝60～90∶40～10；

流速：0.7～1ml/min；

检测波长：UV222～270nm；

柱温：室温；

样品处理：

(1)苯硼酸类物标准品溶液的配制：

准确称取10.0mg苯硼酸类物标准品M1，用甲醇或乙酸乙酯溶解后，转入25ml容量瓶中，用甲醇或乙酸乙酯定容为V1；

(2)芸苔素类物标准品溶液的配制：

准确称取15.0mg芸苔素类物标准品M2，准确称取10.0mg苯硼酸类物标准品M1，一并放入烧杯中，用甲醇或乙酸乙酯溶解后，转入25ml容量瓶中，于80℃水浴反应0.5h，冷却后，用甲醇或乙酸乙酯定容为V2；

(3)天然芸苔素类物试样溶液的配制：

固体试样配制：准确称取10.0mg苯硼酸类物标准品M1，按样品∶苯硼酸类物＝1.0～2.0∶1的比例，准确称取粉状样品M3，一并放入烧杯中，用甲醇或乙酸乙酯溶解后，转入25ml容量瓶中，于80℃水浴反应0.5h，冷却后，用甲醇或乙酸乙酯定容为V3；

液体试样配制：准确吸取1.0～2.0ml液体样品M3放入烧杯中，在80℃水浴中蒸发至干，然后准确称取10.0mg苯硼酸类物标准品M1加入烧杯中，用甲醇或乙酸乙酯溶解后，转入25ml容量瓶中，于80℃水浴反应0.5h，冷却后，用甲醇或乙酸乙酯定容为V3；

苯硼酸类物峰面积与质量关系的确定：

(1)在色谱条件相同的情况下，准确吸取0.50ml苯硼酸类物标准品溶液V4，放入10ml容量瓶中，用甲醇或乙酸乙酯稀释至刻度V5，摇匀，取10μl进样V6，进行液相色谱测定，测出苯硼酸类物峰面积S1；

(2)与苯硼酸类物标准品质量M1相当的峰面积Z1为：

$Z1=\frac{S1\×V5\×V1}{V6\×V4}=\frac{S1\×10\×25}{10\×10^{-3}\×0.5}=S1\×50\×{10}^3$

苯硼酸类物峰面积与芸苔素类物标准品的质量关系：

(1)在色谱条件相同的情况下，准确吸取0.50ml芸苔素类物标准品溶液V7，放入10ml容量瓶中，用甲醇或乙酸乙酯稀释至刻度V8，并摇匀，取10μl进样V9，进行液相色谱测定，测出剩余苯硼酸类物的峰面积S2；

(2)剩余的苯硼酸类物的总峰面积Z2为：

$Z2=\frac{S2\×V8\×V2}{V9\×V7}=\frac{S2\×10\×25}{10\×10^{-3}\×0.5}=S2\×50\×{10}^3$

(3)芸苔素类物标准品质量M2所消耗苯硼酸类物的总峰面积Z3为：

$Z3=Z1-Z2=(S1-S2)\×50\×{10}^3$

(4)芸苔素类物标准品质量M2与苯硼酸类物的峰面积的关系R1为：

$R1=\frac{M2}{Z3}=\frac{M2}{(S1-S2)\×50\×{10}^3}=\frac{M2}{(S1-S2)}\×2\×{10}^{-5}$

苯硼酸类物峰面积与天然芸苔素类物试样溶液的质量关系：

(1)在色谱条件相同的情况下，准确吸取0.50ml天然芸苔素类物试样溶液V10，放入10ml容量瓶中，用甲醇或乙酸乙酯稀释至刻度V11，摇匀，取10μl进样V12，进行液相色谱测定，测出剩余苯硼酸类物的峰面积S3；

(2)天然芸苔素类物试样溶液剩余苯硼酸类物的总峰面积Z4为：

$Z4=\frac{S5\×V11\×V3}{V12\×V10}=\frac{S3\×10\×25}{10\×10^{-3}\×0.5}=S3\×50\×{10}^3$

(3)天然芸苔素类物试样溶液中芸苔素类物消耗苯硼酸类物的总峰面积Z5为：

$Z5=Z1-Z4=(S1-S3)\×50\×{10}^3$

(4)天然芸苔素类物试样溶液中芸苔素类物相当于芸苔素类物标准品的质量A为：

$A=R1\×Z5=\frac{M2\×2\×{10}^{-5}}{(S1-S2)}\×(S1-S3)\×50\×{10}^3=\frac{M2\×(S1-S3)}{(S1-S2)}$

天然芸苔素类物试样中总芸苔素类物含量，按下式计算：

$X=\frac{A}{M3}=\frac{M2\×(S1-S3)}{M3\×(S1-S2)}$

式中：

X-试样中总芸苔素类物含量，mg/g(固体样)或mg/ml(液体样)；

M2-芸苔素类物标准品的质量，mg；

M3-天然芸苔素类物试样的质量，g(固体样)或ml(液体样)；

S1-苯硼酸类物标准品溶液测定中苯硼酸类物的峰面积；

S2-芸苔素类物标准品溶液测定中剩余的苯硼酸类物的峰面积；

S3-天然芸苔素类物试样溶液测定中剩余的苯硼酸类物的峰面积。

本发明用测定芸苔素类物衍生化后剩余的衍生化试剂的量，来测定芸苔素类物总量。衍生化试剂为苯硼酸类物，此类物质能与芸苔素类物产生定量的衍生化反应。

本发明的有益效果是，较好地解决了从天然物质中提取的芸苔素类物中芸苔素总量的测定，对科学地指导科研、生产和应用具有很大的意义和价值。

具体实施方式

实施方式一：

仪器：为日本岛津LC-6A高效液相色谱仪；7125手动进样器；C-R3A紫外-可见光检测器；数据处理机；

试剂：甲醇(色谱试剂)；芸苔素类物标准品为芸苔素内酯(BR)标准品；苯硼酸类物标准品为苯硼酸标准品，天然芸苔素类物和制剂；

色谱条件：

色谱柱：6.0mm I.d.×150mm不锈钢柱，内装

填料；

流动相组成体积比：甲醇∶水＝80∶20；流动相经0.5μm滤膜过滤后使用；

流速：0.7～1ml/min；

检测波长：UV 222nm；

柱温：室温；

样品处理：按发明内容中的步骤进行：

按样品处理(1)苯硼酸类物标准品溶液的配制方法，制成苯硼酸标准品溶液备用；

按样品处理(2)芸苔素类物标准品溶液的配制方法，制成BR标准品溶液备用；

按样品处理(3)天然芸苔素类物试样溶液的配制方法中固体试样配制方法，准确称取10.0mg苯硼酸标准品和准确称取12.0mg粉状样品，一并放入烧杯中，用甲醇溶解后，转入25ml容量瓶中，于80℃水浴反应0.5h，冷却后，用甲醇定容，制成天然芸苔素类物试样溶液备用；

在色谱条件相同的情况下，准确吸取0.50ml苯硼酸标准溶液，放入10ml容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，取10μl进样，进行液相色谱测定，测出苯硼酸的峰面积S1＝1417989.9；

在色谱条件相同的情况下，准确吸取0.50ml BR标准品溶液，放入10ml容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，取10μl进样，进行液相色谱测定，测出BR标准品溶液剩余的苯硼酸的峰面积S2＝1007867.0；

在色谱条件相同的情况下，准确吸取0.50ml天然芸苔素类物试样溶液，放入10ml容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，取10μl进样，进行液相色谱测定，测出天然芸苔素类物试样溶液剩余的苯硼酸的峰面积S3＝983630.6；

总芸苔素类物含量，按下式计算(以BR表示)：

$X=\frac{M2\×(S1-S3)}{M3\×(S1-S2)}=\frac{15.0\×(1417989.9-983630.6)}{12.0\×(1417989.9-1007867.0)}=\frac{15.0\×434359.3}{12.0\×410122.9}=1.32\mathrm{mg}/g$

实施方式二：

仪器、色谱条件同实施方式一；

试剂：甲醇(色谱试剂)；芸苔素类物标准品为表芸苔素内酯(ep-BR)标准品；苯硼酸类物标准品为苯硼酸标准品，天然芸苔素类物和制剂；

样品处理：按发明内容中的步骤进行：

按样品处理(1)苯硼酸类物标准品溶液的配制方法，制成苯硼酸标准品溶液备用；

按样品处理(2)芸苔素类物标准品溶液的配制方法，准确称取15.0mgep-BR标准品和准确称取10.0mg苯硼酸标准品，一并放入烧杯中，用甲醇溶解后，转入25ml容量瓶中，于80℃水浴反应0.5h，冷却后，用甲醇定容，制成ep-BR标准品溶液备用；

按样品处理(3)天然芸苔素类物试样溶液的配制方法中液体试样配制方法，准确吸取1.50ml液体样品放入烧杯中，在80℃水浴中蒸发至于，然后准确称取10.0mg苯硼酸标准品加入烧杯中，用甲醇溶解后，转入25ml容量瓶中，于80℃水浴反应0.5h，冷却后，用甲醇定容，制成天然芸苔素类物试样溶液备用；

在色谱条件相同的情况下，准确吸取0.50ml苯硼酸标准品溶液，放入10ml容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，取10μl进样，进行液相色谱测定，测出苯硼酸的峰面积S1＝1417635.2；

在色谱条件相同的情况下，准确吸取0.50ml ep-BR标准溶液，放入10ml容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，取10μl进样，进行液相色谱测定，测出ep-BR标准品溶液剩余的苯硼酸的峰面积S2＝1005934.2；

在色谱条件相同的情况下，准确吸取0.50ml天然芸苔素类物试样溶液，放入10ml容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，取10μl进样，进行液相色谱测定，测出天然芸苔素类物试样溶液剩余的苯硼酸的峰面积S3＝1062543.5；

总芸苔素类物含量，按下式计算(以ep-BR计)：

$X=\frac{M2\×(S1-S3)}{M3\×(S1-S2)}=\frac{15.0\×(1417635.2-1062543.5)}{1.50\×(1417635.2-1005934.2)}=\frac{15.0\×434359.3}{1.50\×411701.0}=8.62\mathrm{mg}/\mathrm{ml}.$

Claims (5)

1、一种总芸苔素含量的液相色谱测定方法，其特征在于，所用仪器、试剂、色谱条件、样品处理、测定及计算步骤如下：

仪器：

高效液相色谱仪；手动进样器；紫外-可见光检测器；数据处理机；

试剂：

甲醇或乙腈；乙酸乙酯(A.R)；芸苔素类物标准品；苯硼酸类物标准品；

天然芸苔素类物和制剂；

色谱条件：

色谱柱：6.0mm I.d.×150mm不锈钢柱，内装CLC-C₁₈填料；

流动相组成体积比：甲醇(乙腈)∶水＝6090∶40～10；

流速：0.7～1ml/min；

检测波长：UV 222～270nm；

柱温：室温；

样品处理：

(1)苯硼酸类物标准品溶液的配制：

准确称取10.0mg苯硼酸类物标准品M1，用甲醇或乙酸乙酯溶解后，转入25ml容量瓶中，用甲醇或乙酸乙酯定容为V1；

(2)芸苔素类物标准品溶液的配制：

准确称取15.0mg芸苔素类物标准品M2，准确称取10.0mg苯硼酸类物标准品M1，一并放入烧杯中，用甲醇或乙酸乙酯溶解后，转入25ml容量瓶中，于80℃水浴反应0.5h，冷却后，用甲醇或乙酸乙酯定容为V2；

(3)天然芸苔素类物试样溶液的配制：

固体试样配制：准确称取10.0mg苯硼酸类物标准品M1，按样品∶苯硼酸类物＝1.0～2.0∶1的比例，准确称取粉状样品M3，一并放入烧杯中，用甲醇或乙酸乙酯溶解后，转入25ml容量瓶中，于80℃水浴反应0.5h，冷却后，用甲醇或乙酸乙酯定容为V3；

液体试样配制：准确吸取1.0～2.0ml液体样品M3放入烧杯中，在80℃水浴中蒸发至干，然后准确称取10.0mg苯硼酸类物标准品M1加入烧杯中，用甲醇或乙酸乙酯溶解后，转入25ml容量瓶中，于80℃水浴反应0.5h，冷却后，用甲醇或乙酸乙酯定容为V3；

苯硼酸类物峰面积与质量关系的确定；

(1)在色谱条件相同的情况下，准确吸取0.50ml苯硼酸类物标准品溶液V4，放入10ml容量瓶中，用甲醇或乙酸乙酯稀释至刻度V5，摇匀，取10μl进样V6，进行液相色谱测定，测出苯硼酸类物峰面积S1；

(2)与苯硼酸类物标准品质量M1相当的峰面积Z1为：

$Z1=\frac{S1\×V5\×V1}{V6\×V4}=\frac{S1\×10\×25}{10\×{10}^{-3}\×0.5}=S1\×50\×{10}^3$

苯硼酸类物峰面积与芸苔素类物标准品的质量关系：

(1)在色谱条件相同的情况下，准确吸取0.50ml芸苔素类物标准品溶液V7，放入10ml容量瓶中，用甲醇或乙酸乙酯稀释至刻度V8，并摇匀，取10μl进样V9，进行液相色谱测定，测出剩余苯硼酸类物的峰面积S2；

(2)剩余的苯硼酸类物的总峰面积Z2为：

$Z2=\frac{S2\×V8\×V2}{V9\×V7}=\frac{S2\×10\×25}{10\×{10}^{-3}\×0.5}=S2\×50\×{10}^3$

(3)芸苔素类物标准品质量M2所消耗苯硼酸类物的总峰面积Z3为：

Z3＝Z1-Z2＝(S1-S2)×50×10³

(4)芸苔素类物标准品质量M2与苯硼酸类物的峰面积的关系R1为：

$R1=\frac{M2}{Z3}=\frac{M2}{(S1-S2)\×50\×{10}^3}=\frac{M2}{(S1-S2)}\×2\×{10}^{-5}$

苯硼酸类物峰面积与天然芸苔素类物试样溶液的质量关系：

(1)在色谱条件相同的情况下，准确吸取0.50ml天然芸苔素类物试样溶液V10，放入10ml容量瓶中，用甲醇或乙酸乙酯稀释至刻度V11，摇匀，取10μl进样V12，进行液相色谱测定，测出剩余苯硼酸类物的峰面积S3；

(2)天然芸苔素类物试样溶液剩余苯硼酸类物的总峰面积Z4为：

$Z4=\frac{S3\×V11\×V3}{V12\×V10}=\frac{S3\×10\×25}{10\×{10}^{-3}\×0.5}=S3\×50\×{10}^3$

(3)天然芸苔素类物试样溶液中芸苔素类物消耗苯硼酸类物的总峰面积Z5为：

Z5＝Z1-Z4＝(S1-S3)×50×10³

(4)天然芸苔素类物试样溶液中芸苔素类物相当于芸苔素类物标准品的质量A为：

$A=R1\×Z5=\frac{M2\×2\×{10}^{-5}}{(S1-S2)}\×(S1-S3)\×50\×{10}^3=\frac{M2\×(S1-S3)}{(S1-S2)}$

天然芸苔素类物试样中总芸苔素类物含量，按下式计算：

$X=\frac{A}{M3}=\frac{M2\×(S1-S3)}{M3\×(S1-S2)}$

式中：

X-试样中总芸苔素类物含量，mg/g(固体样)或mg/ml(液体样)；

M2-芸苔素类物标准品的质量，mg；

M3-天然芸苔素类物试样的质量，g(固体样)或ml(液体样)；

S1-苯硼酸类物标准品溶液测定中苯硼酸类物的峰面积；

S2-芸苔素类物标准品溶液测定中剩余的苯硼酸类物的峰面积；

S3-天然芸苔素类物试样溶液测定中剩余的苯硼酸类物的峰面积。

2、根据权利要求1所述的总芸苔素含量的液相色谱测定方法，其特征在于，所述的苯硼酸类物是硼酸的一类有机物，它们包括：1-氰基异吲哚-2-间-苯硼酸、9一菲硼酸、二甲氨基萘-5-磺酰硼酸、二茂铁硼酸、萘硼酸、苯硼酸或苯硼酸的类似物。

3、根据权利要求1所述的总芸苔素含量的液相色谱测定方法，其特征在于，所述的芸苔素类物是芸苔素内酯(BR)、表芸苔素内酯(ep-BR)、表高芸苔素内酯(BR-120)、扁豆甾醇内酯、高扁豆甾醇内酯、28-高芸苔素内酯、去甲芸苔素内酯、栗甾酮、扁豆甾酮、芸苔素甾酮。

4、根据权利要求1所述的总芸苔素含量的液相色谱测定方法，其特征在于，所述的试样是从天然物质中提取的芸苔素类物和由其配成的制剂。

5、根据权利要求1所述的总芸苔素含量的液相色谱测定方法，其特征在于，用测定芸苔素类物衍生化后剩余的衍生化试剂的量，来测定芸苔素类物总量。