CN109975085A - 一种植物样品中内源性油菜素甾醇的样品前处理方法及其采用的前处理固相材料 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种植物样品中内源性油菜素甾醇的样品前处理方法及其采用的前处理固相材料。该方法先以溶剂提取内源性油菜素甾醇，用吸附有硼亲和试剂的固相材料对所得提取溶液中的油菜素甾醇进行衍生和同步萃取，然后在解吸时同步引入盐诱导相转移萃取，进一步除去过量硼亲和试剂及亲水性杂质，进而实现了植物样品中内源性油菜素甾醇的选择性富集。该方法简单、快速、高灵敏、高通量，尤其在去除植物提取液内源性杂质方面表现出高选择性，可实现低含量的内源性油菜素甾醇的前处理，结合化学衍生，进而提高分析检测植物样品中内源性油菜素甾醇的灵敏度。
Description
技术领域
本发明涉及一种植物样品中内源性油菜素甾醇选择性富集的样品前处理方法及其前处理固相材料，属于分析化学领域。
背景技术
油菜素甾醇(brassinosteroids,BRs)是一类多羟基化的甾醇类化合物，在植物体内含量极低，但调控着植物的一系列生理学和代谢过程。近年来，关于油菜素甾醇的生理学机能，例如BRs的生物合成，降解以及代谢路径的研究收到广泛关注。但由于植物提取液中基质复杂且油菜素甾醇含量极低，这些研究的开展受到一定限制。因此，建立高效的样品前处理方法并结合灵敏的检测手段是内源性BRs检测的关键。
目前，基于液相色谱-质谱联用(LC-MS)的方法因其高灵敏度和高选择性已成为BR分析方法的主流，然而仍存在问题：
一是，植物基质复杂，干扰BR的检测。基于此，人们引入了多种前处理方法对BR进行萃取除杂。已报道的植物中油菜素甾醇的前处理方法包括液液萃取、固相萃取(SPE)、固相微萃取、磁固相萃取和固相分散微萃取等。这些方法大都利用材料与BR之间的疏水或亲水相互作用，选择性不佳。随后人们提出的利用硼亲和材料中的硼酸基团与BR顺式羟基间的硼亲和作用实现对BR的萃取。尽管选择性得到较大改善，但材料合成复杂繁琐，BR与材料间的解吸困难，往往需要引入双氧水等氧化剂。例如，CN2013101314228中对BR进行萃取时，需采用提前合成的苯硼酸磁性纳米材料，且需要采用解吸液对BR进行解吸，过程相对繁琐。
二是，由于BR的离子化效率不佳，在二级质谱中的诱导碰撞解离(CID)上的碎裂行为不佳，导致其在MS上的信号响应差，灵敏度低。基于此，人们引入化学衍生法，通过信号响应好的硼亲和试剂对BR进行衍生。此步骤往往在萃取之后，即增加了前处理步骤和时间。因为当采用SPE模式对BR进行萃取时，若将衍生萃取同步进行，可能会由于分子间碰撞不充分导致衍生化反应无法充分进行。随后原位衍生技术被提出，此技术能将衍生和萃取步骤同步进行。但依然存在问题：为了保证衍生化反应充分进行，一般会引入相对分析物大大过量的衍生化试剂，而这会对分析物的检测造成干扰。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是对现有的油菜素甾醇前处理方法进行改进，提供一种同时具备高灵敏度、高选择性、高通量且简便快速的植物样品前处理方法，实现内源性油菜素甾醇的样品前处理，进而提高分析检测植物样品中内源性油菜素甾醇的灵敏度。
本发明为解决上述提出的问题所采用的技术方案为：
一种植物样品中内源性油菜素甾醇的样品前处理方法，主要包括以下步骤：
1)在植物样品中定量加入多种内源性油菜素甾醇的同位素内标，然后以溶剂提取，得到样品溶液；
2)将步骤1)所得样品溶液中加入吸附有硼亲和试剂的固相材料，对样品溶液中的油菜素甾醇进行衍生和同步萃取；其中，所述吸附有硼亲和试剂的固相材料包括硼亲和试剂和固相基体材料两部分，硼亲和试剂与固相基体材料之间依靠强阳离子交换作用与疏水作用结合，硼亲和试剂的结构通式如式1或式2所示：
式1、式2中，Z为苯基或苯甲基，Y为仲胺、叔胺基团，A为季铵盐基团，X为卤素离子；
3)将步骤2)所得固相材料中加入解吸液和盐，对油菜素甾醇的衍生产物进行解吸和同步盐诱导相转移萃取，然后弃去下层解吸液以除去过量硼亲和试剂及亲水性杂质，收集上层解吸液，从而实现植物样品中多种内源性油菜素甾醇的样品前处理。
按上述方案，所述固体基体材料为含有阳离子交换基团的硅胶颗粒、磁性材料、无定型材料、凝胶、填充柱或整体柱等中的一种。
按上述方案，所述吸附有硼亲和试剂的固相材料可直接由固体基体材料置于含有硼亲和试剂的溶液中振荡吸附获得。进一步地，固体基体材料与含有硼亲和试剂的溶液的比例在1：1至100：1之间(mg/mL)；含有硼亲和试剂的溶液的浓度在0.5mg/mL至10mg/mL之间。
具体地，步骤1)的操作方法为：准确称量植物样品后将其置于研钵中，液氮冷冻研磨至粉末状后，加入[2H3]油菜素内酯、[2H3]油菜素甾酮和[2H3]香蒲甾醇等同位素内标。然后加入溶剂提取，静置，离心取上清液，得到未完全除杂的样品溶液。植物组织提取溶剂的作用是：在有效地提取出分析物的前提下，尽可能少地提取杂质等干扰物。该步骤中提取所用的溶剂主要选自甲醇、乙腈、异丙醇、氯仿、二氯甲烷、乙酸乙酯、正己烷、乙醚、丙酮或甲酸等中的一种或几种。
按上述方案，所述步骤1)所得样品溶液体积与加入吸附有硼亲和试剂的固相材料的质量比为1：50至1：5之间(mL/mg)。
按上述方案，步骤2)中加入吸附有硼亲和试剂的固相材料时加入部分水，并与步骤1)所得样品溶液混合，构成含水30～50％的溶液，以此解决材料与BR之间由于少量水存在时的亲水作用导致的萃取不稳定问题。
按上述方案，步骤3)所述解吸液是包括水、与水互溶的有机溶剂的混合溶液，水、与水互溶的有机溶剂之间体积比大约为9：10至19：20之间。解吸液的作用是：破坏已结合BR的硼亲和试剂与固体基体材料间的疏水作用，将BR衍生产物从固体基体材料上解吸下来。
按上述方案，步骤3)中，盐加入的质量与步骤3)所述解吸液总体积的比约为20：1至50：1之间(mg/mL)。其中，所述与水互溶的有机溶剂为丙酮、乙腈，乙醇、甲醇等。所述盐主要选自甲酸铵、乙酸铵、氯化钾、氯化钠、氯化钙、磷酸钙等中的一种或几种。盐的加入，可以破坏已结合BR的硼亲和试剂与固体基体材料间的离子交换作用，将BR衍生产物进一步从固体基体材料上解吸下来。同时，由于盐析效应解吸液将分层。此时BR衍生产物绝大部分溶于上层有机层，而过量硼亲和试剂(>70％)以及盐溶于下层水层，由此实现了衍生后同步解吸以及萃取除杂。
按上述方案，步骤3)中收集上层解吸液后，还包括去除上层解吸液中的有机溶剂，然后复溶，获得可以直接用于定量分析检测植物样品中内源性油菜素甾醇的待测溶液。
本发明在上述前处理方法的基础上还提供一种植物样品中内源性油菜素甾醇的定量分析检测方法，将前处理方法所得植物样品中内源性油菜素甾醇的待测溶液通过分析仪器采集响应信号或者数据，结合稳定同位素稀释和标准曲线法测定植物样品中内源性油菜素甾醇的含量。其中，所述分析仪器可以采用液相色谱-质谱仪联用、毛细管电泳-质谱仪联用等。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
1、本发明采用吸附有硼亲和试剂的固相材料，依靠疏水作用力和离子交换作用力。既能保证硼亲和试剂与固相材料间的紧密结合，又使得硼亲和试剂衍生BR后能轻松从固相材料上解吸下来，解吸简单方便，还能避免复杂硼亲和材料的合成。而采用常规硼亲和材料，需采用氧化剂如H2O2才能将BR从材料上解吸下来。H2O2有可能使BR氧化导致检测不准。
2、本发明中衍生和萃取是同步完成的。由于硼亲和衍生试剂被吸附在固相基体材料上，以上作为一个整体对BR进行萃取；而解吸时破坏的是硼亲和衍生试剂与固相基体材料上的作用力，因此BR衍生产物即在萃取之时就已生成。
3、本发明中在解吸时采用同步盐诱导相转移萃取，去除了70％过量的衍生化试剂，加之化学衍生，使得BR灵敏度提高4000倍。
4、本发明所述前处理方法可直接用于植物样品中内源性油菜素甾醇的定量分析检测，同时具有简单、快速、高灵敏度、高通量的优点。此外，本发明所述前处理方法在去除植物提取液内源性杂质方面表现出高选择性，可实现低含量的内源性油菜素甾醇的富集纯化和检测。
附图说明
图1为实施例的原理及流程图。
图2为实施例中盐诱导相转移萃取步骤除杂能力图，其中BBII为硼亲和试剂。(虚线表示盐诱导相转移萃取之后硼亲和试剂的含量，实线表示所有硼亲和衍生试剂的含量)，结果表明通过盐诱导相转移萃取，约70％过量硼亲和试剂被除去。
图3为实施例中解吸同步盐诱导相转移萃取与传统解吸方法(传统解吸方法为：加入少量盐使解吸液仍呈均一状态；之后该解吸液与材料充分接触，从而使分析物从材料上解吸下来)对比图。其中，图A为质谱信号响应对比，图B为回收率对比，结果表明采用本发明方法回收率高，质谱信号响应强。
图4为实施例中除杂能力对比图。其中，a是植物样品经本发明所述前处理方法所得的分析物信号响应，b是标准品溶液以本发明法处理后的分析物信号响应，c是植物样品直接经硼亲和试剂衍生后(即不采用本发明所述吸附有硼亲和试剂的固相材料)得到的分析物信号响应，结果表明采用本发明方法对于植物基质除杂效果好。
图5为实施例中检测到的内源性油菜素甾醇的多反应监控色谱图。其中图a为水稻地上部分样品；图b是水稻根样品；图c是拟南芥地上部分样品；图d是拟南芥花样品；图e是油菜花样品，结果表明本发明方法适用于多种植物样品的分析。
具体实施方式
为了更好地理解本发明，下面结合实施例进一步对本发明的所提供技术方案中的关键技术作进一步的说明，但本发明不仅仅局限于下面的实施例。
下述实施例所采用的硼亲和衍生试剂的制备过程如下：
将4-(溴甲基)苯硼酸(0.1g,0.5mmol)和异喹啉(0.25g,1.9mmol)的混合物在无水二乙醚中于室温下搅拌8h。之后，将固体沉淀产物用无水乙醚(3×10mL)洗涤并在60℃下真空干燥12h。最终得到的硼亲和衍生试剂2-(4-苯硼酸)异喹啉-2-溴化物(BBII)的结构如式3所示。
下述实施例这所采用的吸附有硼亲和试剂的固相材料的制备过程如下：
将1.0g商品化MCX SPE吸附材料(购于维泰克科技公司(武汉，中国))放入含有7mLBBII溶液(6mg/mL于乙腈：水体积比为6:4)的15mL离心管中，剧烈搅拌3min后，将混合物以10000×g离心3min。弃去上清液后，用7mL乙腈：水体积比为6:4的溶剂洗涤。最后，将所得固体材料在60℃下真空干燥以备使用。
图1为实施例的原理及流程图。首先，硼亲和标记试剂通过离子交换作用和疏水作用与商品化MCX基底材料结合，制成固相硼亲和衍生化试剂；随后，通过固相硼亲和衍生化试剂通过硼亲和相互作用抓取BR并对BR进行衍生。之后为了破坏硼亲和标记试剂与MCX之间的疏水作用，采用90％丙酮水溶液对衍生的BR进行解吸；为了破坏硼亲和衍生化试剂与MCX之间的离子交换作用，同时加入醋酸铵对衍生的BR进行解吸。醋酸铵对90％丙酮水溶液起到盐析作用，使得90％丙酮水溶液分为两层，上层为溶有BR衍生产物的有机相，下层为溶有过量衍生化试剂及亲水性杂质的水相；取出上层有机相即完成了解吸同步盐诱导相转移萃取步骤。本发明不仅仅局限于式3的硼亲和衍生化剂，所有符合式1和2的都能用于本发明。
实施例
一种植物样品中内源性油菜素甾醇的样品前处理方法，主要包括以下步骤：
1)准确称取20mg水稻叶，10mg水稻根，20mg拟南芥叶，3mg拟南芥花，3mg油菜花，分别液氮研磨至粉末状后，分别转移至1.5mL离心管中，加入同位素内标[2H3]油菜素内酯、[2H3]油菜素甾酮和[2H3]香蒲甾醇各0.1ng以及0.3mL乙腈混合均匀，放入4℃的冰箱内提取8小时，然后离心取上清液，得到五种样品溶液；五种样品溶液分别经后续步骤2)-4)处理，获得五种植物样品的待测溶液；
2)向步骤1)所得样品溶液中加入20mg吸附有硼亲和试剂的固相材料以及0.2mL水，然后剧烈震荡5min后，离心弃上清液，保留固相材料；
3)采用解吸液对步骤2)所得固相材料上的BR衍生产物进行解吸，解吸液为1.2mL的90％丙酮水溶液(体积比)，并向其中加入36mg醋酸铵固体。在剧烈震荡1min以达到解吸目的后，首先进行离心，所得离心溶液分为两层，上层为溶有油菜素甾醇衍生产物的有机相，下层为溶有硼亲和试剂的水相；
4)将步骤3)所得上层液体取出并吹干，由此完成了解吸同步盐析萃取，然后复溶于100μL 45％的乙腈水溶液中，获得可以直接用于定量分析检测植物样品中内源性油菜素甾醇的待测溶液。
一种植物样品中内源性油菜素甾醇分析的定量检测方法，主要步骤如下：
1)配置不同浓度梯度的标准样品溶液(浓度范围如表1所示)，并加入0.1ng[2H3]油菜素内酯、0.1ng[2H3]油菜素甾酮和0.1ng[2H3]香蒲甾醇作为内标；
2)向步骤1)配置好的标准溶液中分别加入吸附有硼亲和试剂的固相材料，对其中的BR及加入的内标进行衍生、萃取，剧烈震荡5min后，离心弃上清液，保留固相材料；采用解吸液对所得固相材料上的BR衍生产物进行解吸，解吸液为1.2mL的90％丙酮水溶液(体积比)，并向其中加入36mg醋酸铵固体，在剧烈震荡1min以达到解吸目的后，首先进行离心，随后分别取出上层液体取出并置于氮吹仪下吹干，45％(v/v)的乙腈水溶液复溶；
3)将步骤2)所得衍生并复溶后的标准溶液进行超高效液相色谱-串联质谱(UHPLC-MS/MS)分析，将得到的色谱图中每个标准品以及内标的峰面积进行积分，用标准溶液中各个浓度BR标准品的峰面积除以与之对应的内标的峰面积(油菜素内酯和28-高油菜素内酯共用[2H3]油菜素内酯作为内标；油菜素甾酮和28-高油菜素甾酮共用[2H3]油菜素甾酮作为内标；香蒲甾醇和6-脱氧油菜素甾酮共用[2H3]香蒲甾醇作为内标)，对相应物质的浓度作线性曲线，制得标准曲线(如表1所示)；
4)将本实施例前处理方法所得五种不同植物组织的植物激素的待测溶液通过超高效液相色谱-串联质谱(UHPLC-MS/MS)分析采集色谱图，进而将色谱图中每个物质的峰面积积分，除以与之对应的内标的峰面积，将所得峰面积比代入步骤2)所得标准曲线中，计算出响应浓度，再根据所用的植物质量，计算出植物激素在每克鲜重植物中的含量(如表3所示)。
表1.分析物的工作曲线
本实施例待测植物样品中检测到的三类内源性植物激素色谱图见图5。
为了验证本方法的准确度，本发明考察了加标回收率(详见表2)，之后按照所述的方法进行处理和测定，得出不同加标浓度的回收率在94.8％-112.3％之间，表明本发明所提供方法的准确性。对方法进行日间日内精密度考察，计算各自回收率的相对标准偏差在3.7％-15.8％之间，表明方法稳定可靠。
表2.方法的稳定性和准确度
表3.五种实际植物样品中内源性油菜素甾醇的含量
单位:ng/g鲜重
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明创造构思的前提下，还可以做出若干改进和变换，这些都属于本发明的保护范围。
Claims (11)
1.一种用于植物样品中内源性油菜素甾醇的样品前处理固相材料，其特征在于它为一种吸附有硼亲和试剂的固相材料，包括硼亲和试剂和固相基体材料两部分，硼亲和试剂与固相基体材料之间依靠强阳离子交换作用与疏水作用结合；其中，硼亲和试剂的结构通式如式1或式2所示：
式1、式2中，Z为苯基或苯甲基，Y为仲胺、叔胺基团，A为季铵盐基团，X为卤素离子。
2.根据权利要求1所述的一种用于植物样品中内源性油菜素甾醇的样品前处理固相材料，其特征在于所述固体基体材料为含有阳离子交换基团的硅胶颗粒、磁性材料、无定型材料、凝胶、填充柱或整体柱中的一种。
3.根据权利要求1所述的一种用于植物样品中内源性油菜素甾醇的样品前处理固相材料，其特征在于所述吸附有硼亲和试剂的固相材料直接由固体基体材料置于含有硼亲和试剂的溶液中吸附获得。
4.根据权利要求3所述的一种用于植物样品中内源性油菜素甾醇的样品前处理固相材料，其特征在于所说固体基体材料质量与含有硼亲和试剂的溶液体积的比例在(1～100)mg：1mL，含有硼亲和试剂的溶液的浓度在0.5～10mg/mL。
5.一种植物样品中内源性油菜素甾醇的样品前处理方法，其特征在于主要包括以下步骤：
1)在植物样品中定量加入多种内源性油菜素甾醇的同位素内标，然后以溶剂提取，得到样品溶液；
2)将步骤1)所得样品溶液中加入吸附有硼亲和试剂的固相材料，对样品溶液中的油菜素甾醇进行萃取和同步标记；其中，所述吸附有硼亲和试剂的固相材料为权利要求1所述的样品前处理固相材料；
3)将步骤2)所得固相材料中加入解吸液和盐，对油菜素甾醇的衍生产物进行解吸和同步盐诱导相转移萃取，弃去下层解吸液以除去过量硼亲和试剂及亲水性杂质，收集上层解吸液，从而实现植物样品中多种内源性油菜素甾醇的样品前处理。
6.根据权利要求5所述的一种植物样品中内源性油菜素甾醇的样品前处理方法，其特征在于所述步骤1)所得样品溶液体积与加入吸附有硼亲和试剂的固相材料的质量比为1mL：(5～50mg)。
7.根据权利要求5所述的一种植物样品中内源性油菜素甾醇的样品前处理方法，其特征在于步骤2)中加入吸附有硼亲和试剂的固相材料时加入部分水，并与步骤1)所得样品溶液混合，构成含水30～50wt％的溶液。
8.根据权利要求5所述的一种植物样品中内源性油菜素甾醇的样品前处理方法，其特征在于步骤3)所述解吸液是包括水、与水互溶的有机溶剂的混合溶液，水、与水互溶的有机溶剂之间体积比为9：10～19：20之间。
9.根据权利要求5所述的一种植物样品中内源性油菜素甾醇的样品前处理方法，其特征在于步骤3)中，盐加入的质量与步骤3)所述解吸液总体积的比为(20～50mg)：1mL。
10.根据权利要求5所述的一种植物样品中内源性油菜素甾醇的样品前处理方法，其特征在于步骤3)中收集上层解吸液后，还包括去除上层解吸液中的有机溶剂，然后复溶，获得直接用于定量分析检测植物样品中内源性油菜素甾醇的待测溶液。
11.一种植物样品中内源性油菜素甾醇的定量分析检测方法，其特征在于将权利要求10所述前处理方法所得植物样品中内源性油菜素甾醇的待测溶液通过分析仪器采集响应信号或者数据，结合稳定同位素和标准曲线法测定植物样品中内源性油菜素甾醇的含量。
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