CN107543746A - 一种植物样品中三类不同化学性质的内源性植物激素的前处理方法及定量检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种植物样品中三类不同化学性质的内源性植物激素的前处理方法及定量检测方法，1)在植物样品中定量加入多种内源性植物激素的同位素内标，然后以溶剂提取得到样品溶液；2)以TiO₂材料和硼亲和材料对步骤1)所得样品溶液进行除杂，进而得到植物样品中多种内源性植物激素的待测溶液；3)将所得植物样品中多种内源性植物激素的待测溶液通过分析仪器采集响应数据，进而采用内标法同时定量测定植物样品中的多种内源性植物激素。本发明方法，可实现少量植物组织中不同化学性质的三类低含量的内源性植物激素的富集纯化，并实现同时定量检测，准确性高。

Description

一种植物样品中三类不同化学性质的内源性植物激素的前处 理方法及定量检测方法

技术领域

本发明涉及一种植物样品中三类不同化学性质内源性植物激素的前处理方法及定量检测方法，属于分析化学领域。

背景技术

植物激素在植物生长、发育的各个阶段发挥着极其重要的作用。同时、准确的定量植物组织中多种植物激素，有助于了解植物激素的生理功能和调控网络。但是，由于植物提取液中基质复杂、含量极低且化学性质各异，使得同时测定植物样品中多种植物激素具有较大困难。

目前已报道的植物中多种植物激素的前处理方法所针对的分析物大多为酸性植物激素、碱性植物激素中的一种或者几种。现有专利ZL 2012 1 0486507.3和ZL 2013 10131422.8是专门针对油菜素甾醇(BRs)的分析检测。由于BRs类激素化学结构性质相似，且都含有顺式羟基，针对这一类物质的性质，有了上述专利所述的前处理方案。但是对于化学性质不同于油菜素甾醇(BRs)的其他类植物激素，用上述方案则无法实现。目前，同时分析酸性植物激素、碱性植物激素和油菜素甾醇仍然十分困难。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是针对上述现有技术存在的不足而提供一种植物样品中三类不同化学性质的内源性植物激素的前处理方法及定量检测方法，可同时实现低含量的三类不同化学性质的内源性植物激素的富集纯化，并实现同时定量检测，方法简单快速，准确性高。

本发明为解决上述提出的问题所采用的技术方案为：

一种植物样品中三类不同化学性质的内源性植物激素的前处理方法，主要步骤如下：

1)在植物样品中定量加入多种内源性植物激素的同位素内标，然后以溶剂提取得到样品溶液；

2)以二氧化钛(TiO₂)材料和硼亲和磁性纳米颗粒材料为净化介质对步骤1)所得样品溶液进行除杂，进而得到植物样品中三类不同化学性质的内源性植物激素的待测溶液，从而实现植物样品中多种内源性植物激素的样品前处理。

优选地，所述步骤2)为：以二氧化钛(TiO₂)材料富集三类不同化学性质的内源性植物激素，之后加入含有硼亲和材料在溶液中对油菜素甾醇(即中性植物激素)进行萃取，所得萃取过后的溶液即为植物样品中酸性和碱性内源性植物激素的待测溶液；对吸附在硼亲和材料上的油菜素甾醇进行解吸，所得解吸液即为植物样品中内源性油菜素甾醇的待测溶液，从而实现植物样品中三类不同化学性质的内源性植物激素的样品前处理。

进一步优选地，所述步骤2)为：(a)除去步骤1)所得样品溶液中的溶剂，得到样品渣；然后所得样品渣加入溶剂B复溶，得到复溶后的样品溶液；(b)将所得复溶后的样品溶液中加入TiO₂材料进行富集三类不同化学性质的内源性植物激素，弃去溶液，得到富集有三类不同化学性质的内源性植物激素的TiO₂材料；(c)将步骤(b)所得TiO₂材料分散于溶剂C中，加入硼亲和材料对油菜素甾醇进行萃取，所得萃取过后的溶液即为植物样品中酸性和碱性内源性植物激素的待测溶液；(d)将吸附有油菜素甾醇硼亲和材料溶于解吸液D中，对油菜素甾醇进行解吸，所得解吸液即为植物样品中内源性油菜素甾醇的待测溶液。

其中，溶剂B为可以溶解样品渣，且分析物在TiO₂材料富集过程中有较好的回收率，例如乙腈等。所述溶剂C能破坏亲水作用和配位作用，例如甲醇、乙腈及其与水的混合溶液；步骤(c)中进行对油菜素甾醇萃取同时，可以解吸酸性和碱性内源性植物激素同时进行，也可以分开进行，若同时进行时，则溶剂C为甲醇、乙腈及其与水的混合溶液，需加入少量氨水，调节pH至8.5-10；溶液D为可以破坏硼亲和作用的溶剂，释放被捕获的含有顺式羟基的油菜素甾醇，例如本发明所使用的含有双氧水的乙腈溶液等等。

按上述方案，所述植物样品为油菜花、拟南芥等等含有内源性植物激素的植物样品。

按上述方案，所述植物样品为粉末状，如可以预先采用液氮冷冻后研磨至粉末状。

按上述方案，所述三类不同化学性质的内源性植物激素主要包括含有羧基的酸性植物激素(包括生长素类、赤霉素类、茉莉酸类和脱落酸类等)，以碱基腺嘌呤为骨架结构的碱性植物激素(例如细胞分裂素类)以及在酸碱中不易电离的中性植物激素(即油菜素甾醇)中的一种或多种。

优选地，所述三类不同化学性质的内源性植物激素主要包括吲哚-3-乙酸(IAA)，脱落酸(ABA)，茉莉酸(JA)，赤霉素1(GA1)，赤霉素3(GA3)，赤霉素4(GA4)，赤霉素7(GA7)，赤霉素12(GA12)，赤霉素24(GA24)，赤霉素53(GA53)等含有羧基的酸性植物激素；异戊烯基腺嘌呤(iP)，异戊烯基腺嘌呤核苷(iPR)，异戊烯基腺嘌呤-9-糖苷(iP9G)，反式玉米素(tZ)，反式玉米素核苷(tZR)，反式玉米素-9-糖苷(tZ9G)，双氢玉米素(DHZ)，双氢玉米素核苷(DHZR)等以碱基腺嘌呤为骨架结构的碱性植物激素；以及28-降油菜素内酯(28-norBL),28-降油菜素甾酮(28-norCS)，28-高油菜素内酯(28-homoBL)，油菜素内酯(BL)，油菜素甾酮(CS)等含有顺式羟基的中性植物激素。

按上述方案，根据需要加入相应的同位素内标，主要为[²H₂]IAA,[²H₆]ABA,[²H₂]GA1,[²H₂]GA3,[²H₂]GA4,[²H₂]GA12,[²H₂]GA24,[²H₂]GA53,[²H₃]BL,[²H₃]CS,[²H₆]iP,[²H₆]iPR,[²H₆]iP9G,[²H₅]tZ,[²H₅]tZR,[²H₅]tZ9G,[²H₃]DHZ,[²H₃]DHZR等等。待测多种内源性植物激素与之相对应的内标如表1所示。

按上述方案，步骤1)中所述溶剂为甲醇、乙腈、异丙醇、氯仿、二氯甲烷、乙酸乙酯、正己烷、乙醚、丙酮或甲酸等中的一种或几种按任意比例的混合物。溶剂的作用是：在有效地提取出分析物的前提下，尽可能少地提取杂质等干扰物。

按上述方案，步骤1)中所述溶剂提取的温度为-25～-15℃，时间范围为6～12h。

按上述方案，所述的TiO₂材料为含有TiO₂纳米颗粒的磁性材料、粉末型材料、填充柱或整体柱等中的一种或几种。

按上述方案，所述的硼亲和材料为含有硼酸基团的硅胶颗粒、磁性材料、无定型材料、凝胶、填充柱或整体柱等中的一种或几种。所述的硼亲和材料主要由含有硼酸的单体与交联剂制备而成，其中交联剂为乙二醇二甲基丙烯酸酯，二乙烯基苯等等，含有硼酸的单体为3-丙烯酰胺基苯硼酸，4-N,N-二甲基苯硼酸，4-乙烯基苯硼酸等等。例如，硼亲和材料为4-N,N-二甲基苯硼酸-乙二醇二甲基丙烯酸酯共聚物、3-丙烯酰胺基苯硼酸-乙二醇二甲基丙烯酸酯共聚物等等以及它们的磁性材料、硅胶颗粒、磁性材料、无定型材料、凝胶、填充柱或整体柱等。

按上述方案，所述加入TiO₂材料后富集的温度为室温，时间为1min或者大于1min。富集过程中可以采用涡旋或者振荡等方式以保证富集均匀充分。

按上述方案，所述加入硼亲和材料后萃取的温度为室温，时间为5min或者大于5min。萃取过程中可以采用涡旋或者振荡等方式以保证萃取均匀充分。

本发明在上述前处理方法的基础上还提供一种植物样品中三种不同化学性质的内源性植物激素的定量检测方法，将前处理方法所得植物样品中三种不同化学性质的内源性植物激素的待测溶液通过分析仪器采集响应信号或者数据，进而采用内标法同时定量测定植物样品中的三种不同化学性质的内源性植物激素。

按上述方案，所述分析仪器可以采用液相色谱-光学检测器、液相色谱-质谱仪联用、毛细管电泳-光学检测器联用、毛细管电泳-质谱仪联用等。优选地，所述分析仪器采用高效液相色谱-电喷雾-三重四级杆串联质谱。

具体地，一种植物样品中多种内源性植物激素的定量检测方法，主要步骤如下：

1)在植物样品中定量加入多种内源性植物激素的同位素内标，然后以溶剂提取得到样品溶液；

2)以TiO₂料为和硼亲和材料作为净化介质对步骤2)所得样品溶液进行纯化，进而得到植物样品中多种内源性植物激素的待测溶液；

3)配置不同浓度梯度的含有多种内源性植物激素标准样品的溶液，并定量加入多种内源性植物激素的同位素内标，然后对所配置好的标准样品溶液进行超高效液相色谱-串联质谱(UPLC-MS/MS)分析得到色谱图，然后将每个物质(即每种内源性植物激素)的色谱图峰面积积分，除以与之相应的内标的峰面积，对相应物质(即每种内源性植物激素)的浓度作线性回归，制得标准曲线；

4)将所得植物样品中多种内源性植物激素的待测溶液通过超高效液相色谱-串联质谱(UPLC-MS/MS)分析采集色谱图；进而将色谱图中每个物质(即每种内源性植物激素)的峰面积积分，除以与之相应的内标的峰面积，采用步骤3)所得标准曲线同时定量测定植物样品中的三种不同化学性质的内源性植物激素。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

1、本发明能够实现同一份植物样品中三种不同化学性质内源性植物激素的前处理和同时定量检测，简单快速，准确性高。

2、本发明在TiO₂富集中，实现酸性、碱性和中性油菜素甾醇的同时富集；之后，以硼亲和材料为萃取介质，实现中性油菜素甾醇的选择性再富集，从而达到进一步的纯化的目的，三种不同化学性质内源性植物激素通过两步前处理即可分离开来，为后续定量检测三种不同化学性质内源性植物激素提供了必要前提。

3、本发明能采用的前处理方案，方法简单、易操作，减少了目标分析物在前处理中的损失；同时，采用分离更加高效的超高效液相系统，可以分离众多分子量相同的植物激素的检测。

4、与背景技术中所提到的现有技术相比，本发明可以同时实现酸性、碱性和中性油菜素甾醇在内的植物激素的分析检测，而不是仅适用于一类植物激素或者两类的检测。

附图说明

图1为本发明方法中，硼亲和材料可以选择性萃取含有顺式羟基的油菜素甾醇，而不萃取含有顺式羟基的细胞分裂素核苷的条件优化。其中，(A)，萃取溶液中乙腈含量对萃取效率的影响；(B)萃取溶液中pH值对萃取效率的影响。

图2为本发明中，经过前处理所得含有油菜素甾醇的待测溶液的总离子流图。其中，(A)为标准品经过本发明前处理步骤所得样品总离子流图；(B)为加标实际样品仅经过一步TiO₂处理后所得样品总离子流图；(C)为实际样品加标后，经过本发明样品前处理步骤所得的制备样总离子流图。

图3为本发明法前处理过程中细胞分裂素和油菜素甾醇的回收率。其中，(A)为经过TiO₂材料和硼亲和材料除杂后，细胞分裂素的回收率；(B)在硼亲和材料萃取后，油菜素甾醇的回收率。

图4为本发明所检测到三类内源性植物激素的色谱图。

具体实施方式

为了更好地理解本发明，下面结合实施例进一步对本发明的所提供技术方案中的关键技术作进一步的说明，但本发明不仅仅局限于下面的实施例。

本发明中，所述的TiO₂材料为含有TiO₂纳米颗粒的磁性材料、粉末型材料、填充柱或整体柱等中的一种或几种；所述的硼亲和材料为含有硼酸基团的硅胶颗粒、磁性材料、无定型材料、凝胶、填充柱或整体柱等中的一种或几种。符合上述条件的TiO₂材料、硼亲和材料均能适用于本发明，对于TiO₂材料而言，主要为了利用其含有的TiO₂纳米颗粒，对于硼亲和材料而言，主要为了利用含有的硼酸基团，而优选采用磁性硼亲和材料、磁性TiO₂材料，其原因在于易于利用磁场等分离。下述实施例中采用的磁性TiO₂材料、硼亲和磁性纳米颗粒的制备方法分别如下，但不限于以下的制备方法。

磁性TiO₂的制备过程如下：将按照文献合成的四氧化三铁(Fe₃O₄)磁性纳米颗粒均匀分散在一个含有100mL 0.1mol/L的氟钛酸铵((NH₄)₂TiF₆)，0.3mol/L的硼酸(H₃BO₃)的聚四氟乙烯容器中；然后，将敞口的容器放置在真空干燥箱中，除去磁颗粒表面的气体；之后盖紧盖子，将容器放置在35℃的摇床中震荡16h，得到固体产物；所得固体产物用水清洗5次后在120℃的烘箱烘干；将烘干后的固体放置于马弗炉中，以1℃min^-1的升温速率升到300℃，并保持2h，之后待自然冷却到室温，得到的Fe₃O₄/TiO₂的复合材料，即磁性TiO₂材料。

磁性硼亲和材料的制备过程如下：先取4-N,N-二甲基苯硼酸(0.25g)加入一个装有搅拌棒的500mL圆底烧瓶中，再向烧瓶中倒入200mL乙腈/吡啶(50/1，v/v)，搅拌使得4-N,N-二甲基苯硼酸充分溶解；之后，将按照文献制备的含有双键的3-巯丙基三乙氧基硅烷修饰的四氧化三铁(Fe₃O₄)磁性颗粒(0.5g)，乙二醇二甲基丙烯酸酯(2.25g)和偶氮二异丁腈(0.020g)相继加入圆底烧瓶中，加热30min使得溶液沸腾；之后，在2h内将烧瓶中的乙腈蒸出一半，待溶液冷却到室温后，在磁场辅助下将其中的固体即磁性硼亲和材料(即磁性的4-N,N-二甲基苯硼酸-乙二醇二甲基丙烯酸酯共聚物)从溶液中分离出来，并用水和甲醇清洗数次，在60℃真空干燥箱中干燥，备用。

实施例1

一种植物样品中多种内源性植物激素的前处理方法，主要步骤如下：

(1)油菜花(约为100mg)在液氮的冷冻下，使用研钵研磨至粉末状，转移至1.5mL的离心管中，准确加入1.0ng[²H₂]IAA，1.0ng[²H₆]ABA，0.4ng[²H₂]GA1，0.4ng[²H₂]GA3，0.4ng[²H₂]GA4，0.4ng[²H₂]GA12，0.4ng[²H₂]GA24，0.4ng[²H₂]GA53，1.0ng[²H₃]BL，1.0ng[²H₃]CS，和0.1ng的[²H₆]iP，[²H₆]iPR，[²H₆]iP9G，[²H₅]tZ，[²H₅]tZR，[²H₅]tZ9G，[²H₃]DHZ和[²H₃]DHZR做内标；然后向该离心管中加入1.0mL的乙腈，并涡旋均匀，置于-20℃的冰箱过夜提取(12h)，而后在1000rpm，0℃的条件下，离心20min，取上清液至新的1.5mL离心管中，即为样品溶液；

(2)(a)除去步骤(1)所得样品溶液中的溶剂，用乙腈复溶；

(b)将所得复溶后的样品溶液加入到含有50mg的TiO₂磁性纳米颗粒于2mL的玻璃瓶中，涡旋1分钟进行富集，弃去溶液，加入1mL乙腈涡旋1min，之后将溶液弃去，得到富集有三类不同化学性质的内源性植物激素的磁性TiO₂材料；

(c)向步骤(b)所得富集有植物激素磁性TiO₂中加入20mg硼亲和磁性纳米颗粒，共同分散于1mL的含有1％氨水(v/v)和20％乙腈(ACN，v/v)的水溶液中，在涡旋5min后(此过程中，三类不同化学性质的内源性植物激素被从磁性TiO₂材料上解吸下来，而解吸下来的油菜素甾醇又重新被硼亲和磁性纳米颗粒吸附)，在磁铁的辅助下取出磁性材料并收集液体。

其中，所得液体即为含有酸性和碱性内源性植物激素的解吸液，然后转移至1.5mL的离心管中，在氮气下吹干，之后复溶于50μL的30％甲醇(v/v)中，得到植物样品中酸性和碱性内源性植物激素的待测溶液；

(d)吸附有油菜素甾醇的硼亲和磁性纳米颗粒(与磁性TiO₂材料混和在一起)连续用1.0mL50％乙腈水溶液(v/v)和乙腈清洗，之后用含有3％双氧水的乙腈水溶液(即1mL30％的双氧水加入到9mL的乙腈中)涡旋5min，以达到解吸油菜素甾醇的目的；将含有油菜素甾醇的解吸液在氮气保护下吹干有机溶剂，之后加入20μL的甲醇，得到植物样品中内源性油菜素甾醇的待测溶液。

分别采用TiO₂磁性纳米颗粒和硼亲和磁性纳米颗粒的两步萃取过程中，通过硼亲和萃取条件优化(pH值和待测溶液中乙腈ACN含量)，可实现油菜素甾醇的选择性萃取(见图1)。第二步的硼亲和磁性纳米颗粒萃取过程中，在1％氨水(v/v)和20％乙腈(v/v)条件下，实现了油菜素甾醇的选择性萃取，而同样含有顺式羟基的细胞分裂素核苷则不被萃取。在该萃取过程中，细胞分裂素(包括含有顺式羟基的细胞分裂素核苷)的回收率在60％-100％，而油菜素内脂的回收率在90％以上(如图3所示)。

将上述方法与文献报道方法的总离子流对比，如图2所示。与文献法相比，本发明可大大降低样品的基质，其基质与标准品类似，表明本发明具有良好的选择性除杂效果。

一种植物样品中多种内源性植物激素的定量检测方法，主要步骤如下：

1)配置不同浓度梯度的标准样品溶液(浓度范围如表1所示)，并加入1.0ng[²H₂]IAA，1.0ng[²H₆]ABA，0.4ng[²H₂]GA1，0.4ng[²H₂]GA3，0.4ng[²H₂]GA4，0.4ng[²H₂]GA12，0.4ng[²H₂]GA24，0.4ng[²H₂]GA53，1.0ng[²H₃]BL，1.0ng[²H₃]CS，和0.1ng的[²H₆]iP，[²H₆]iPR，[²H₆]iP9G，[²H₅]tZ，[²H₅]tZR，[²H₅]tZ9G，[²H₃]DHZ和[²H₃]DHZR作为内标；

2)对步骤1)配置好的标准溶液进行超高效液相色谱-串联质谱(UPLC-MS/MS)分析，得如图1所示的色谱图，然后将每个物质的色谱图峰面积积分，除以与之相应的内标的峰面积，对相应物质的浓度作线性回归，制得标准曲线(如表1所示)；

3)将本实施例前处理方法所得不同油菜花的植物激素的待测溶液(即植物样品中酸性和碱性内源性植物激素的待测溶液、植物样品中内源性油菜素甾醇的待测溶液)通过超高效液相色谱-串联质谱(UPLC-MS/MS)分析采集色谱图；进而将色谱图中每个物质的峰面积积分，除以与之相应的内标的峰面积，采用步骤2)所得标准曲线同时定量测定植物样品中的多种内源性植物激素，测得不同水稻组织部位的植物激素含量如图1所示。

表1分析物的工作曲线

本实施例待测植物样品中检测到的三类内源性植物激素色谱图见图4。

为了验证本方法的准确度，本发明考察了加标回收率(详见表2)，之后按照所述的方法进行处理与测定，得出不同加标浓度的回收率在85.0％-116.2％之间，表明本发明所提供方法的准确性。连续5次重复处理与测定，计算各自的回收率的相对标准偏差(RSD)在2.7％-16.1％之间，结果表明该方法稳定可靠。

表2方法的稳定度和准确度

综上所述，本发明能采用一步前处理的方案，可实现三类不同化学性质的低含量的内源性植物激素的富集纯化，并后续可实现性质各异的植物激素的同时定量检测，方法准确性高，完全跳出了现有技术中一种前处理及其定量检测方法仅能针对一类植物激素的局限。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明创造构思的前提下，还可以做出若干改进和变换，这些都属于本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种植物样品中三类不同化学性质的内源性植物激素的前处理方法，其特征在于主要步骤如下：

1)在植物样品中定量加入多种内源性植物激素的同位素内标，然后以溶剂提取得到样品溶液；

2)以二氧化钛材料和硼亲和磁性纳米颗粒材料为净化介质对步骤1)所得样品溶液进行除杂，进而得到植物样品中三类不同化学性质的内源性植物激素的待测溶液，从而实现植物样品中多种内源性植物激素的样品前处理。

2.根据权利要求1所述的一种植物样品中三类不同化学性质的内源性植物激素的前处理方法，其特征在于所述步骤2)具体为：以二氧化钛材料富集三类不同化学性质的内源性植物激素，之后加入含有硼亲和材料在溶液中对油菜素甾醇进行萃取，所得萃取过后的溶液即为植物样品中酸性和碱性内源性植物激素的待测溶液；对吸附在硼亲和材料上的油菜素甾醇进行解吸，所得解吸液即为植物样品中内源性油菜素甾醇的待测溶液，从而实现植物样品中三类不同化学性质的内源性植物激素的样品前处理。

3.根据权利要求1所述的一种植物样品中三类不同化学性质的内源性植物激素的前处理方法，其特征在于所述植物样品为油菜花、拟南芥样品。

4.根据权利要求1所述的一种植物样品中三类不同化学性质的内源性植物激素的前处理方法，其特征在于所述植物样品为粉末状。

5.根据权利要求1所述的一种植物样品中三类不同化学性质的内源性植物激素的前处理方法，其特征在于所述三类不同化学性质的内源性植物激素主要包括含有羧基的酸性植物激素，以碱基腺嘌呤为骨架结构的碱性植物激素，以及在酸碱中不易电离的中性植物激素中的一种或多种。

6.根据权利要求1所述的一种植物样品中三类不同化学性质的内源性植物激素的前处理方法，其特征在于所述含有羧基的酸性植物激素包括生长素类、赤霉素类、茉莉酸类和脱落酸类植物激素；以碱基腺嘌呤为骨架结构的碱性植物激素主要包括细胞分裂素类植物激素，中性植物激素主要为含有顺式羟基的油菜素甾醇类植物激素。

7.根据权利要求1所述的一种植物样品中三类不同化学性质的内源性植物激素的前处理方法，其特征在于步骤1)中所述溶剂为甲醇、乙腈、异丙醇、氯仿、二氯甲烷、乙酸乙酯、正己烷、乙醚、丙酮或甲酸等中的一种或几种按任意比例的混合物；溶剂提取的温度为-25～-15℃，时间范围为6～12h。

8.根据权利要求1或2所述的一种植物样品中三类不同化学性质的内源性植物激素的前处理方法，其特征在于所述加入TiO₂材料后富集的温度为室温，时间为1min或者大于1min；所述加入硼亲和材料后萃取的温度为室温，时间为5min或者大于5min。萃取过程中可以采用涡旋或者振荡等方式以保证萃取均匀充分。

9.一种植物样品中三种不同化学性质的内源性植物激素的定量检测方法，其特征在于主要步骤如下：

1)在植物样品中定量加入多种内源性植物激素的同位素内标，然后以溶剂提取得到样品溶液；

2)以二氧化钛材料和硼亲和磁性纳米颗粒材料为净化介质对步骤1)所得样品溶液进行除杂，进而得到植物样品中三类不同化学性质的内源性植物激素的待测溶液，从而实现植物样品中多种内源性植物激素的样品前处理；

3)将前处理方法所得植物样品中三种不同化学性质的内源性植物激素的待测溶液通过分析仪器采集响应信号或者数据，进而采用内标法同时定量测定植物样品中的三种不同化学性质的内源性植物激素。

10.一种植物样品中多种内源性植物激素的定量检测方法，其特征在于主要步骤如下：

1)在植物样品中定量加入多种内源性植物激素的同位素内标，然后以溶剂提取得到样品溶液；

2)以TiO₂料为和硼亲和材料作为净化介质对步骤2)所得样品溶液进行纯化，进而得到植物样品中多种内源性植物激素的待测溶液；

3)配置不同浓度梯度的含有多种内源性植物激素标准样品的溶液，并定量加入多种内源性植物激素的同位素内标，然后对所配置好的标准样品溶液进行超高效液相色谱-串联质谱分析得到色谱图，然后将每种内源性植物激素的色谱图峰面积积分，除以与之相应的内标的峰面积，对相应内源性植物激素的浓度作线性回归，制得标准曲线；

4)将所得植物样品中多种内源性植物激素的待测溶液通过超高效液相色谱-串联质谱分析采集色谱图；进而将色谱图中每种内源性植物激素的峰面积积分，除以与之相应的内标的峰面积，采用步骤3)所得标准曲线同时定量测定植物样品中的三种不同化学性质的内源性植物激素。