CN107462651A

CN107462651A - 基于钛固定化磁微球的生物样品中磷酸化合物的富集方法

Info

Publication number: CN107462651A
Application number: CN201610384845.4A
Authority: CN
Inventors: 段更利; 郁颖佳; 李嫣; 徐琛; 朱嘉俊; 龙佳坤
Original assignee: Fudan University
Current assignee: Fudan University
Priority date: 2016-06-02
Filing date: 2016-06-02
Publication date: 2017-12-12

Abstract

本发明属分析化学领域，涉及利用钛固定化磁微球萃取技术从生物样品中富集磷酸化合物的方法。该方法采用钛固定化磁微球的功能化磁性复合材料，在提取富集过程通过外部磁场的施加达到快速分离；对钛固定化磁微球活化后上样，采用一定的溶剂清洗和洗脱，提取生物样品中的磷酸化合物，经氮吹浓缩，以一定的溶剂复溶后用高效液相串联质谱或气相串联质谱分析，测定生物样品中磷酸化合物的含量。使用后的钛固定化磁微球经再生溶剂清洗后可重复使用。本方法具有萃取速度快、效率高、选择性好、操作简便、安全无污染、可重复使用的优点。本法与色谱质谱分析法联用，可用于准确测定生物样品中磷酸化合物的含量。

Description

基于钛固定化磁微球的生物样品中磷酸化合物的富集方法

技术领域

本发明属分析化学领域，涉及生物样品中磷酸化合物的富集方法，具体涉及一种利用钛固定化磁微球萃取技术从生物样品中富集磷酸化合物的方法。

背景技术

现有技术公开了有关样品前处理是复杂样品分析过程中必不可少的操作步骤，其直接影响着分析方法的灵敏度、选择性、可靠性、分析速度等，因此，复杂样品的样品前处理已成为当今分析化学的重要研究领域之一。

研究显示，由于血浆、体液等生物样品因其样品组成复杂、目标对象含量低等特点使其前处理显得尤为重要。传统的生物样品前处理技术有蛋白沉淀法、液液提取法等，这些技术非常成熟，但其萃取效率低、杂质去除不完全等缺陷的存在也一直无法避免。

固相萃取技术（Solid phase extraction, SPE）是八十年代中期开始发展起来的一种样品前处理技术，由液固萃取和柱液相色谱技术相结合发展而来。SPE基于液-固色谱理论，采用选择性吸附、选择性洗脱的方式对样品进行分离、纯化和浓缩，其提取过程可近似地看作是一种简单的色谱过程。与传统的前处理技术相比SPE可以显著提高分析物的回收率，更有效地将分析物与干扰组分分离，减少样品前处理过程，操作上更为简单省时省力。目前被广泛应用在医药、食品、环境、商检、化工等领域。

近年来，对传统固相萃取技术进行技术革新所得的磁性固相萃取技术（Magneticsolid phase extraction, MSPE）是分离富集领域的革命性技术。MSPE即是以磁性或可磁化的功能性材料作为吸附剂的一种分散固相萃取技术。

同样基于液-固色谱理论，在MSPE过程中，磁性吸附剂不直接填充到吸附柱中，而是被添加到样品的溶液或者悬浮液中，将目标分析物吸附到分散的磁性吸附剂表面，在外部磁场的作用下，目标分析物随吸附剂一起迁移，最终通过合适的溶剂洗脱被测物质，从而与样品的基质分离开。MSPE技术可以减少有害有机溶剂的使用，简化繁琐的样品洗脱步骤，易于实现自动化，并且可以对样品中的痕量化合物进行高倍的富集。与传统SPE相比，磁性材料颗粒可完全暴露于待测体系中，并与之充分接触，因此可在短时间内实现从大体积的复杂样品中吸附和萃取目标化合物。材料本身所具有的磁性特质，可以非常容易地通过外加磁场使其从待测体系中分离和被收集，避免了繁琐的过滤或离心过程。

MSPE因其具有操作简便快速、处理效率高、适用范围广等突出优势，已经成为痕量分析物的预富集的热门技术，并在各种类型复杂样品前处理应用过程中显示出了良好的应用潜力。

MSPE技术的核心在于获取功能化的磁性材料，随着相关研究对功能化磁性材料的不断开发，形成了包括表面嫁接有机小分子、表面包覆碳或无机氧化物、表面嫁接或包覆聚合物、载体表面或孔道内负载磁性纳米粒子、载体骨架内掺入磁性纳米粒子、物理共混法制备磁性功能材料在内的6种有效方法。目前的研究热点在于合成更多有用的功能化磁性材料，以实现高效的样品前处理进而满足复杂样品分析的要求，特别是设计合成对复杂基质中目标物具有专一吸附能力的磁性材料。

基于现有技术的基础，本申请的发明人拟提供一种新的更为具有选择性好、可重复使用、专属性强、快速便捷的生物样品中磷酸化合物的富集方法，尤其是一种基于钛固定化磁微球的生物样品中磷酸化合物的富集方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种钛固定化磁微球萃取技术用于生物样品中磷酸化合物的富集方法，该方法简便，快速，萃取效率高，重现性好，回收率高，安全环保。可用于准确测定生物样品中磷酸化合物的含量。

本发明中基于钛固定化磁微球磁性复合材料的固相萃取技术的原理，利用其所具备的磁性，整个提取富集过程可通过外部磁场的施加而达到快速分离的目的，其提取方法包含上样、清洗、洗脱、富集四个步骤，使用过的磁性材料经洗涤后可重复使用多次。

本发明所采用的钛固定化磁微球（Fe₃O₄@PD-Ti⁴⁺ microspheres）是一类对磷酸基团有特异性吸附作用的功能化磁性复合材料，其外层包覆的Ti⁴⁺在酸性环境下能通过阴阳离子相互作用而吸附含PO₄ ^2-基团的物质，其后在碱性环境下，所吸附的含PO₄ ^2-物质能被洗脱下来。

具体而言，本发明的目的通过下述技术方案实现：

采用一种新型的钛固定化磁微球的功能化磁性复合材料，利用其所具备的磁性，整个提取富集过程可通过外部磁场的施加而达到快速分离的目的。对钛固定化磁微球进行活化后上样，采用一定的溶剂进行清洗和洗脱，以提取生物样品中的磷酸化合物，并经氮吹浓缩，以一定的溶剂复溶后用高效液相串联质谱或气相串联质谱分析，测定生物样品中磷酸化合物的含量。使用后的钛固定化磁微球经再生溶剂清洗后可重复使用多次。

本发明中，针对钛固定化磁微球萃取效率的影响因素有磁微球浓度，提取时间，洗脱溶剂的体积及洗脱时间等因素进行选择确定；

本发明上述富集生物样品中磷酸化合物的方法中，加入的活化溶剂是酸性混合溶剂，溶剂体积为200 ~ 2000 μl，活化次数1~ 5次；

本发明上述富集生物样品中磷酸化合物的方法中，样品上样量为100 ~ 2000 μl，涡旋时间为10~60 min；

本发明上述富集生物样品中磷酸化合物的方法中，加入的清洗溶剂是酸性混合溶剂，溶剂体积为200 ~ 2000 μl，清洗次数1~ 5次；

本发明上述富集生物样品中磷酸化合物的方法中，加入的洗脱溶剂为碱性混合溶剂，溶剂体积为10 ~ 100 μl，涡旋时间为10~60 min；

本发明上述富集生物样品中磷酸化合物的方法中，使用的再生溶剂为酸性混合溶剂，溶剂体积为200 ~ 2000 μL，清洗次数1~ 5次；

经试验，结果显示，本发明的富集生物样品中磷酸化合物的方法简便、准确、可靠，快速，萃取效率高，重现性好，回收率高，安全环保。可用于准确测定生物样品中磷酸化合物的含量。钛固定化磁微球萃取技术适用于复杂样品体系的前处理，能为磷酸化合物的提取富集提供技术支持。

本发明提供了一种新的更为简便快速的磷酸化合物的富集方法，其中采用的钛固定化磁微球萃取技术是集萃取、浓缩、解吸于一体的实验技术，具有选择性好、可重复使用、专属性强、快速便捷的优点，其在复杂样品体系的前处理中具有一定的应用前景，能为磷酸化合物的提取富集提供技术支持。

附图说明

图1为钛固定化磁微球合成路径及结构示意图。

图2为钛固定化磁微球萃取技术操作步骤示意图。

具体实施方式

实施例1 钛固定化磁微球在小鼠血浆异戊烯焦磷酸检测中的应用

仪器与材料：

仪器：Agilent 1200高效液相色谱仪；AB SCIEX 4500三重四极杆质谱仪；氮吹装置；XW-80A涡旋混合器；TGL-16G台式离心机；磁铁。

材料：三氟乙酸、碳酸氢铵、三乙胺、氨水、乙腈、甲醇；三蒸水；异戊烯焦磷酸标准品、磷酸-5’-吡哆醛标准品；小鼠血浆样品。

样品前处理：

取2 mg/ml钛固定化磁微球200 μl，去除溶剂后，用600 μl酸性混合溶剂（50%乙腈+0.05%三氟乙酸）活化3次（每次200 μl）。在活化后的钛固定化磁微球中加入200 μl酸性混合溶剂与100 μl样品（含内标），涡旋30 min后去除溶剂，用600 μl酸性混合溶剂清洗3次，去除上清后加入20 μl 0.4 mol/L 氨水，涡旋30 min后去除固体。收集的洗脱液在40°C氮吹下挥干，用50 μl去离子水复溶，即得；

基质效应与加样回收率：

将对照品低、中、高三个不同浓度的试液进样，然后按照样品前处理方法进行钛固定化磁微球萃取，取复溶后的样品进行HPLC-MS/MS分析，计算基质效应以及提取回收率，基质效应为：(98.08 ± 2.83)% (n=3)，回收率分别为：(98.52 ± 3.08)% (n=3)；

重复性实验：

精密量取同一来源的小鼠血浆样品100 μl，按照样品前处理方法进行钛固定化磁微球萃取，取复溶后的样品进行HPLC-MS/MS分析，重复测定三次，RSD为2.98%。

Claims

1.基于钛固定化磁微球的生物样品中磷酸化合物的富集方法，其特征在于，采用钛固定化磁微球的功能化磁性复合材料，利用其磁性，在提取富集过程通过外部磁场的施加达到快速分离的目的；对钛固定化磁微球进行活化后上样，采用一定的溶剂进行清洗和洗脱，提取生物样品中的磷酸化合物，并经氮吹浓缩，以一定的溶剂复溶后用高效液相串联质谱或气相串联质谱分析，测定生物样品中磷酸化合物的含量。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，该方法中，采用酸性混合溶剂为活化溶剂，其溶剂体积为200 ~ 2000 μl，活化次数1~ 5次。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，该方法中，样品上样量为100 ~ 2000 μl，涡旋时间为10~60 min。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：该方法中，采用酸性混合溶剂为清洗溶剂，溶剂体积为200 ~ 2000 μl，清洗次数1~ 5次。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：该方法中，采用碱性混合溶剂为洗脱溶剂，溶剂体积为10 ~ 100 μl，涡旋时间为10~60 min。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，该方法中，采用酸性混合溶剂为再生溶剂，溶剂体积为200 ~ 2000 μl，清洗次数1~ 5次。