CN102824756B - 一种从植物提取物中筛选甘油三酯酶抑制剂的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种从植物提取物中筛选甘油三酯酶抑制剂的方法,包括利用吸附载体进行酶的固定化,以及利用负载有酶的吸附载体从植物提取物中亲和选择分离出活性化合物。本发明运用中空纤维作为吸附载体,将先分离后筛选的传统活性筛选模式改进为先筛选鉴定后分离的新型活性筛选模式,大大减少了化合物制备分离的盲目性,可推广应用于天然产物或中药混合物中具有甘油三脂酶抑制活性的化合物的快速筛选。
Description
技术领域
本发明属于药物筛选与评价方法领域,涉及一种从植物提取物中筛选甘油三酯酶抑制剂的方法。
背景技术
甘油三酯是人体内含量最多的脂类,脂肪组织中的甘油三酯在一系列脂肪酶的作用下,分解生成甘油和脂肪酸,这一过程称为脂动员。脂动员生成的脂肪酸可释放入血,与白蛋白结合形成脂酸白蛋白运输至其它组织被利用;甘油被运输到肝脏,被甘油激酶催化生成3-磷酸甘油,进入糖酵解途径分解或用于糖异生。
在脂动员过程中,催化由甘油三酯水解生成甘油二酯的甘油三酯酶是脂动员的限速酶。若能获得具有高效抑制剂抑制该酶的活性,就能有效降低糖尿病患者体内血糖含量。
天然产物中含有丰富的具有生物活性的成分,是开发新药候选化合物的巨大资源库。但是目前针对天然药物的开发并没有形成如化学药物开发那样的规模,其中最大的技术难度在于天然产物中活性化合物的筛选效率太低。常规方法大都采用有机溶剂对天然产物进行系统分离,制得的样品需要干燥、称量、溶解、配制、加样等一系列步骤后才能进行活性评价,存在耗时耗力等问题。因此,开发针对特定酶靶标活性化合物的快速分离与鉴定方法可以极大地提高天然产物中活性化合物发现的速度。
目前,基于亲和选择的活性化合物富集技术在天然产物活性成分筛选中的应用越来越多。这类方法包括亲和超滤法、亲和磁珠富集法、亲和细胞膜色谱法等。根据所采用的靶标固定方式不同,可将这些方法分为两类:溶液化酶和固定化酶。固定化酶的方法即采用各种不同介质将靶标蛋白或酶固定在其表面,从复杂混合样品中分离活性化合物,再通过液相色谱-质谱联用等手段分析固定介质上吸附的活性化合物,从而实现化合物的快速发现。
酶的固定化方法主要有吸附法、共价结合法、包埋法及交联法四大类。其中吸附法应用范围较广,包括物理吸附法和离子吸附法。其突出优势在于工艺简单,操作条件温和;不易破坏酶分子的高级结构以及活性中心的构象,酶回收率较高;载体选择范围大且大多廉价易得;吸附过程还能达到酶纯化的目的。
物理吸附法主要以高吸附能力的非水溶性材料为载体,如硅藻土、分子筛、硅胶、多孔玻璃、氧化铝、大孔吸附树脂等。中空纤维材料具有良好的吸附性能,能够将靶标蛋白或酶吸附在其中,从而很有潜力成为新的固定介质。然而,以往研究从未将中空纤维应用于天然药物中活性化合物的发现中。
发明内容
为解决上述技术问题,本发明提供了一种从植物提取物中筛选甘油三酯酶抑制剂的方法,使用该方法能快速筛选获得植物提取物中具甘油三脂酶抑制活性的化合物。
本发明的技术方案为:
一种从植物提取物中筛选甘油三酯酶抑制剂的方法,包括利用吸附载体进行酶的固定化,以及利用负载有酶的吸附载体从植物提取物中亲和选择分离出活性化合物,所述吸附载体为中空纤维。
本发明中采用中空纤维作为吸附载体是因为中空纤维的比表面积较大,能大大增加酶的吸附量,进而提高筛选效率,且吸附过程不会对酶的活性产生影响。
作为优选,所述吸附载体为聚丙烯中空纤维。聚丙烯中空纤维材料价格便宜,操作过程中不易折断损伤,使用方便,能够降低筛选成本、提高筛选效率。
优选的聚丙烯中空纤维的规格为300~400μm内径,80~120μm壁厚,0.1~0.3μm孔隙大小,40~60%孔隙率。
所述酶的固定化方法为:
(1)将中空纤维浸泡在乙醇中活化;
(2)取出中空纤维用去离子水清洗;
(3)活化好的中空纤维垂直放入酶溶液中,搅拌孵育。
所述酶溶液为甘油三酯酶溶液,使用的溶剂为水或磷酸缓冲液。
所述植物提取物的获取方法为:
(1)收集植物组织,使用乙醇水溶液回流提取,浓缩提取液得到样品A,此步骤的乙醇水溶液中,乙醇的体积百分比浓度优选70%;
(2)样品A上样于大孔树脂,使用体积比呈梯度分布的乙醇水溶液洗脱,合并目标洗脱液,浓缩得到样品B;
(3)样品B上样于阳离子交换树脂,使用体积比呈梯度分布的乙醇水溶液洗脱,合并目标洗脱液,浓缩即得到植物提取物。
作为优选,所述大孔树脂为D101大孔树脂。
作为优选,所述阳离子交换树脂为732型阳离子交换树脂。
为确保所述中空纤维能有效吸附甘油三酯酶,在活性化合物的亲和选择分离之前,要对吸附酶的中空纤维进行吸附质量考察,考察方法包括:电镜扫描、衰减全反射红外光谱测定或X光电子能谱分析。
以空白的中空纤维为对照,对吸附酶的中空纤维进行吸附质量考察时,作为一种实施方式,所述电镜扫描能从扫描影像中直观地考察甘油三酯酶的吸附情况。
作为另一种实施方式,所述衰减全反射红外光谱使用傅里叶变换红外光谱仪进行测定。与常规的红外光谱分析方法相比,衰减全反射分析不需要通过样品信号,而是通过样品表面的反射信号获得样品表层有机成分的结构信息,能够直接获得一些特殊样品(如纤维、塑料、橡胶等)的红外光谱。
作为第三种实施方式,所述X光电子能谱分析也是一种表面分析方法,该方法能提供样品表面的元素含量与形态,这是因为各种原子、分子的轨道电子结合能是一定的,因此,通过对样品产生的光子能量的测定,就可以了解样品中元素的组成。同时,元素所处的化学环境不同,其结合能会有微小的差别,进而引起化学位移的变化,因此,利用化学位移值就可以分析元素的化合价和存在形式。
在确保甘油三酯酶已吸附到中空纤维上后,即可进行活性化合物的亲和选择分离,其方法为:
(1)取植物提取物水溶液,加入吸附酶的中空纤维,进行孵育;
(2)取出经孵育的吸附酶的中空纤维,经磷酸缓冲液清洗、乙腈水溶液洗脱后,收集洗脱液进行活性成分的分析;
(3)根据分析鉴定结果,采用制备液相色谱获取活性化合物。
将所述植物提取物水溶液和吸附酶的中空纤维在适宜条件下进行孵育,植物提取物中的甘油三酯酶配体就与甘油三酯酶发生相互作用,被吸附在甘油三酯酶的表面,利用配体-受体间的亲和作用力,就可从植物提取物中特异性地分离出能与甘油三酯酶结合的目标化合物。
对植物提取物水溶液和吸附酶的中空纤维进行孵育时,作为优选,所述孵育时间为10~60min,孵育温度为15~37℃。
更优选的,所述孵育时间为30min,孵育温度为37℃。
用磷酸缓冲液对孵育后的中空纤维进行清洗时,作为优选,所述磷酸缓冲液的离子强度为50~1000mM,磷酸缓冲液的pH值为5.6~8.0。
更优选的,所述磷酸缓冲液的离子强度为50mM,磷酸缓冲液的pH值为6.8。
对结合在吸附酶的中空纤维上的活性化合物进行洗脱时,作为优选,所述乙腈水溶液中乙腈的体积百分比浓度为10%。
作为优选,所述乙腈水溶液洗脱次数为1~3次,更优选的,洗脱次数为3次。
作为优选,采用液相色谱-质谱联用法对洗脱液进行活性成分分析和分离。
使用上述方法分离得到三个活性化合物,分别为:槲皮素-3-O-阿拉伯糖基-(1→2)-半乳糖苷、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖醛酸和山奈酚-3-β-O-D-葡萄糖醛酸;进一步检测这三个活性化合物对甘油三酯酶的抑制活性,获得上述三个活性化合物对甘油三酯酶的半数抑制浓度分别为:66.7μM、94.0μM和43.7μM,抑制效果较好,可被应用于制备抗糖尿病药物。
本发明中的不同体积比浓度的乙醇和乙腈,如未作特殊说明,所使用的溶剂均为水。
与现有技术相比,本发明的有益效果为:
本发明提供的从植物提取物中筛选甘油三酯酶抑制剂的方法,运用中空纤维作为吸附载体,快速筛选获得了植物组织中具甘油三脂酶抑制活性的化合物,将先分离后筛选的传统活性筛选模式改进为先筛选鉴定后分离的新型活性筛选模式,大大减少了化合物制备分离的盲目性。可推广应用于天然药物或中药混合物中具有甘油三脂酶抑制活性的化合物的快速筛选。
附图说明
图1为空白中空纤维、吸附酶的中空纤维的衰减全反射红外谱图。
图2为吸附酶的中空纤维的扫描电镜图。
图3为基于中空纤维的植物提取物中甘油三酯酶抑制剂的筛选流程图。
图4a为荷叶提取物的液相色谱图。
图4b为荷叶提取物经吸附甘油三酯酶的中空纤维筛选后洗脱物的液相色谱图。
具体实施方式
下面结合附图,以荷叶提取物为例,对本发明作进一步详细说明。除荷叶提取物外,本发明也同样适用于从其他植物提取物中筛选甘油三酯酶抑制剂。
1、吸附甘油三酯酶的中空纤维制备
1)试剂及溶液配制:
猪胰腺甘油三酯酶(simga公司);
聚丙烯中空纤维,规格:内径335μm,壁厚100μm,孔隙0.2μm(杭州恒滤膜技术工程有限公司);
Bradford蛋白浓度测定试剂盒(碧云天公司)。
2)吸附甘油三酯酶的中空纤维制备
将50根6cm长的聚丙烯中空纤维浸泡在100%乙醇中活化1h后取出,用去离子水把附着的乙醇清洗干净;将10mL(0.1mg/mL)甘油三酯酶溶液加入到吸附容器里,将活化好的中空纤维垂直放入容器中,室温下搅拌孵育30min;Bradford法测定孵育液中剩余的蛋白量,计算每根中空纤维上吸附的酶量。
3)吸附酶的中空纤维质量考察
电镜分析:使用扫描式电子显微镜对空白中空纤维、吸附甘油三脂酶的中空纤维的表面分别进行扫描成像,检查中空纤维性状,可见纤维呈中空状,直径约为350μm,表明中空纤维能将酶吸附其中。吸附酶的中空纤维扫描电镜图像如图2所示。
衰减全反射分析:使用傅里叶变换红外光谱仪,测定空白中空纤维、吸附酶的中空纤维的衰减全反射红外光谱,测定结果如图1所示。由图可见,空白中空纤维(a)的衰减全反射红外图中在波数2800-3000cm-1处出现聚丙烯的特征吸收峰;而吸附酶的中空纤维(b)的衰减全反射红外图中除聚丙烯的特征吸收峰外,还在波数1650cm-1处出现了酰胺键的特征吸收峰,由此表明,甘油三酯酶已吸附到中空纤维上。
X光电子能谱分析:使用X光电子能谱分析仪分析空白中空纤维和吸附甘油三酯酶的中空纤维的X光电子衍射图谱。元素分析数据表明,甘油三酯酶吸附到中空纤维上后,碳元素的比例下降(82.4%→69.2%),氧元素的比例升高(17.6%→23.9%),氮元素(0→6.21%)和硫元素(0→0.7%)的比例上升。由此表明,甘油三酯酶已吸附到中空纤维上。
2、基于中空纤维的筛选条件研究
1)药品、试剂及溶液配制:
猪胰腺甘油三酯酶、4-甲基伞形酮油酸酯(simga公司);
聚丙烯中空纤维,规格:内径335μm,壁厚100μm,孔隙0.2μm(杭州恒滤膜技术工程有限公司);
橙皮苷(上海融禾生物医药有限公司)。
2)基于中空纤维的快速筛选条件优化
基于中空纤维的植物提取物中甘油三酯酶抑制剂的筛选流程如图3所示。为提高活性化合物的筛选效率,采用已确定具有甘油三酯酶抑制活性的阳性化合物橙皮苷考察该方法的筛选条件。
筛选方法的一般流程为:在2mL的离心管中,加入200μL的橙皮苷溶液(1mg/mL)和1.8mL的磷酸缓冲液(pH 7.4),垂直放入10根吸附甘油三酯酶的中空纤维,于一定温度孵育一定时间后,吸出孵育液。加入1mL磷酸缓冲液清洗中空纤维1-3次,最后加入10%乙腈溶液1mL洗脱结合的活性化合物,每次振摇10min,再合并洗脱液进行液相色谱-质谱联用分析。
分别对上述筛选过程中的5个因素进行考察,包括:洗脱次数(1、2、3次)、孵育时间(10、20、30、45、60min)、磷酸缓冲液的离子强度(50、150、300、500、1000mM)、磷酸缓冲液的pH值(5.6、6.2、6.8、7.4、8.0)、孵育温度(15℃、25℃、37℃)。
结果表明,经过3次洗脱,清洗液中已不含有橙皮苷,因此确定清洗次数为3次。当磷酸缓冲液的pH值为6.8时,洗脱液中橙皮苷的色谱峰面积最大,可见pH值为6.8有利于甘油三酯酶与橙皮苷的结合。随着离子强度从50mM增加到1000mM,洗脱出的橙皮苷峰面积逐渐减少,可见,离子强度低有利于甘油三酯酶与橙皮苷的结合,最终确定磷酸缓冲液的离子强度为50mM。孵育温度为37℃对甘油三酯酶与橙皮苷的结合最有利。孵育时间从10min增加到30min,洗脱出的橙皮苷峰面积也逐渐变大,继续增加孵育时间至45min和60min,橙皮苷峰面积不再发生变化,说明甘油三酯酶与橙皮苷的结合可能已经达到饱和状态。
最终优选的基于中空纤维的快速筛选条件为:
在2mL的离心管中,加入200μL的橙皮苷溶液(1mg/mL)和1.8mL的磷酸缓冲液(pH 7.4),垂直放入10根吸附甘油三酯酶的中空纤维,于37℃孵育30min后,吸出孵育液。加入1mL 50mM磷酸缓冲液(pH 6.8)清洗中空纤维3次,最后加入10%乙腈溶液1mL洗脱结合的活性化合物,取洗脱液进行液相色谱-质谱联用分析。
3、荷叶提取物中具有甘油三酯酶抑制活性的化合物筛选
1)获取荷叶提取物
取荷叶加70%乙醇回流提取2次,将提取液合并、浓缩,得到浓缩液A;浓缩液A上样于D101大孔树脂,分别用水、60%乙醇、95%乙醇洗脱,弃去水洗脱液,将60%乙醇和95%乙醇洗脱液合并、浓缩,得到浓缩液B;浓缩液B上样于732型阳离子交换树脂,分别用水、50%乙醇、95%乙醇洗脱,将水和50%乙醇洗脱液合并、浓缩至干,得荷叶提取物。
上述不同体积比浓度的乙醇,所采用的溶剂均为水。
2)活性化合物亲和选择分离
在2mL的离心管中,加入200μL的荷叶提取物水溶液(10mg/mL)和1.8mL的磷酸缓冲液(pH 7.4),垂直放入10根吸附酶的中空纤维,37℃孵育30min;吸出孵育液,加入1mL 50mM磷酸缓冲液(pH 6.8)清洗,共清洗3次;最后加入10%乙腈水溶液1mL洗脱结合化合物,振摇10min后,吸取洗脱液进行液质分析。
3)活性成分分析
使用液相色谱-质谱对活性成分进行分析。
其中,液相色谱参数如下:
色谱柱为Agilent Zorbax SB-C18柱250×4.6mm,5μm;
流动相A为0.1%甲酸-水,流动相B为乙腈;
梯度洗脱程序如下:0min,10%B;60min,50%B;80min,100%B;
流速为0.5mL/min;进样量:20μL;
柱温:30℃;检测器:二极管阵列检测器;波长扫描范围:190~400nm;检测波长:254nm。
质谱参数如下:
离子源:电喷雾(ESI)源,正负离子扫描模式;
质量扫描范围:m/z 100-2000;碰撞气:高纯氦;雾化气:高纯氮;电喷雾电压:-4.5kV;鞘气流速:30arb;辅助气流速:10arb;毛细管温度:350℃;毛细管电压:-15V。
分析结果如图4所示,荷叶提取物的液质图(负离子模式,图4a)中共有10个峰,分别为槲皮素-3-O-阿拉伯糖基-(1→2)-半乳糖苷、芦丁、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖醛酸、异鼠李素-3-O-β-D-芸香糖苷、山奈酚-3-β-O-D-葡萄糖醛酸、异鼠李素-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、异鼠李素-3-O-β-D-葡萄糖醛酸、香叶木素-7-葡萄糖苷、异鼠李素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸、槲皮素(表1)。
表1荷叶提取物的液相色谱-质谱分析数据
图4b是荷叶提取物经甘油三酯酶吸附中空纤维筛选后的洗脱物,含三个化合物,分别为槲皮素-3-O-阿拉伯糖基-(1→2)-半乳糖苷(峰1)、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖醛酸(峰3)、山奈酚-3-β-O-D-葡萄糖醛酸(峰5)。
4)活性成分制备
采用制备液相色谱制备上述3个活性成分。
取荷叶提取物适量,加甲醇溶解,10000r/min离心10min,取上清液经制备液相色谱分离得到3个黄酮类化合物。制备色谱的分离条件:色谱柱为制备柱Agilent Zorbax SB-C18柱250×21.2mm,7μm,流动相为水和乙腈,梯度洗脱程序如下:0min,10%乙腈-水;40min,50%乙腈-水;50min,60%乙腈-水;流速:10mL/min,柱温为室温,检测波长:203、254、280、320nm。收集保留时间为14.1min的色谱峰,减压回收溶剂,得槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖醛酸;收集保留时间为24min的色谱峰,减压回收溶剂,得槲皮素-3-O-阿拉伯糖基-(1→2)-半乳糖苷;收集保留时间为25.6min的色谱峰,减压回收溶剂,得山奈酚-3-β-O-D-葡萄糖醛酸。
5)活性成分IC50值测定
取分离得到的槲皮素-3-O-阿拉伯糖基-(1→2)-半乳糖苷、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖醛酸和山奈酚-3-O-β-D-葡萄糖醛酸,分别配制成浓度为1、5、10、50、100、250μg/mL的待测品溶液;各取20μL加入20μL浓度为1mg/mL的甘油三酯酶溶液,置于96孔板中,在37℃震荡混匀孵育10min;加20μL 0.1mM 4-甲基伞形酮油酸酯,在37℃震荡混匀孵育30min;再加入80μL碳酸氢钠溶液停止反应,在37℃震荡10min;分光光度法于405nm测定吸收值,计算甘油三酯酶抑制抑制活性。
测试结果表明,用吸附甘油三酯酶的中空纤维筛选得到的三个化合物,即槲皮素-3-O-阿拉伯糖基-(1→2)-半乳糖苷、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖醛酸和山奈酚-3-β-O-D-葡萄糖醛酸均具有甘油三酯酶抑制活性,其半数抑制浓度(IC50)值分别为66.7μM、94.0μM和43.7μM。
Claims (1)
1.一种从植物提取物中筛选甘油三酯酶抑制剂的方法,包括利用吸附载体进行酶的固定化,以及利用负载有酶的吸附载体从植物提取物中亲和选择分离出活性化合物,其特征在于,所述吸附载体为聚丙烯中空纤维;
所述酶的固定化方法为:
(1)将中空纤维浸泡在乙醇中活化;
(2)取出中空纤维用去离子水清洗;
(3)活化好的中空纤维垂直放入酶溶液中,搅拌孵育;
所述搅拌孵育的条件为:室温下搅拌孵育30min;
所述活性化合物的亲和选择分离的方法为:
(1)取植物提取物水溶液,加入吸附酶的中空纤维,进行孵育;
所述孵育时间为30min,孵育温度为37℃;
(2)取出经孵育的吸附酶的中空纤维,经磷酸缓冲液清洗、乙腈水溶液洗脱后,收集洗脱液进行活性成分的分析;
所述磷酸缓冲液的离子强度为50mM,磷酸缓冲液的pH值为6.8;所述乙腈水溶液中乙腈的体积百分比浓度为10%;
(3)根据分析鉴定结果,采用制备液相色谱获取活性化合物。
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- 2012-09-07 CN CN201210328036.3A patent/CN102824756B/zh active Active
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CN101852787A (zh) * | 2010-06-22 | 2010-10-06 | 山西医科大学 | 一种中药活性筛选方法 |
CN102565224A (zh) * | 2011-12-27 | 2012-07-11 | 山西医科大学 | 一种中药有效成分的筛选测定方法 |
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CN102824756A (zh) | 2012-12-19 |
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