CN106018599B - 一种基于沸石吸附的抗阿尔兹海默症药物的筛选方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于沸石吸附的抗阿尔兹海默症药物的筛选方法，该方法基于沸石的亲和选择‑液质谱筛选，通过将乙酰胆碱酯酶吸附到沸石上，对药用植物提取物中的乙酰胆碱酯酶抑制剂进行筛选。本发明对影响吸附的因素，如:沸石类型、溶液pH值、吸附时间、吸附温度等因素进行了系统优化，并且还对筛选药物的影响因素，如：孵育液pH、孵育液离子强度、孵育液温度、孵育时间等因素进行了系统优化，建立了能高效、正确、灵敏、重复性高的筛选抗阿尔兹海默症成分的方法，具有重要的应用价值。
Description
技术领域
本发明涉及一种药物的筛选方法，具体涉及一种筛选效率高、基于沸石吸附的抗阿尔兹海默症药物的筛选方法。
背景技术
目前，基于亲和选择-质谱的方法在药用植物活性成分筛选中的应用越来越多，该法通过靶标亲和选择，发现混合物中的靶标结合物，然后对结合物进行鉴定，可以大大加快筛选的过程。这些方法包括亲和超滤法、磁珠法、涡流色谱法、亲和细胞膜色谱法等。根据选用靶点存在的状态，可以将这些方法分为两类：溶液化酶和固定化酶。固定化酶的方法可以模拟膜粘连的酶或蛋白真实存在的环境，并且可以快速与筛选对象进行分离(如磁珠法)，但是，并不是所有酶都适合进行固定，有些酶固定之后可能会失去活性。溶液化酶方法需要离心机或泵来施加压力，使溶液通过分离膜。有些化合物可能会吸附分离膜上，从而导致假阳性的结果。
发明内容
发明目的：本发明的目的在于提供一种基于沸石吸附的抗阿尔兹海默症药物的筛选方法，该方法通过将乙酰胆碱酯酶吸附到沸石上，然后和待筛选的药物共孵育，先用PBS缓冲液清洗，再用变性清洗液进行变性洗脱，最后对变性洗脱物进行液质分析、鉴定。筛选出具有抗阿尔兹海默症的药物。本发明提供的方法，筛选效率高，筛选准确度高，灵敏度高，对于新的抗阿尔兹海默症药物的筛选具有重要应用价值。
技术方案，为实现以上目的，本发明采取的技术方案为：
一种基于沸石吸附的抗阿尔兹海默症药物的筛选方法，包括以下步骤：
(1)将沸石和靶标蛋白一起混合、孵育，应用物理吸附技术在沸石表面上吸附靶标蛋白得到吸附靶标蛋白的沸石，然后将未吸附的靶标蛋白分离，得到吸附靶标蛋白的沸石；
(2)将步骤(1)得到的吸附靶标蛋白的沸石和待筛选的药物混合、孵育；孵育结束后先用PBS缓冲液清洗，再用变性清洗液进行变性洗脱；
(3)对步骤(2)的变性洗脱物进行液质分析，获取靶标结合物的相关信息，筛选出具有抗阿尔兹海默症作用的药物。
作为优选方案，以上所述的基于沸石吸附的抗阿尔兹海默症药物的筛选方法，步骤(1)沸石和靶标蛋白孵育条件为：pH值为8.0，孵育温度为25℃，孵育时间为20min。
作为优选方案，以上所述的基于沸石吸附的抗阿尔兹海默症药物的筛选方法，步骤(2)所述的变性清洗液为乙腈水溶液或甲醇水溶液。
作为优选方案，以上所述的基于沸石吸附的抗阿尔兹海默症药物的筛选方法，步骤(2)孵育结束后先用PBS缓冲液清洗4次，变性清洗液为体积浓度50％的甲醇水溶液。
作为优选方案，以上所述的基于沸石吸附的抗阿尔兹海默症药物的筛选方法，步骤(2)将吸附靶标蛋白的沸石和待筛选的药物在37℃下孵育20min。
作为优选方案，以上所述的基于沸石吸附的抗阿尔兹海默症药物的筛选方法，步骤(2)将吸附靶标蛋白的沸石和待筛选的药物，混合，加入PBS缓冲液，使溶液的pH值在7.4时进行孵育。
作为优选方案，以上所述的基于沸石吸附的抗阿尔兹海默症药物的筛选方法，步骤(2)将吸附靶标蛋白的沸石和待筛选的药物，混合，加入PBS缓冲液，使溶液的的离子强度为10mM，pH值在7.4时进行孵育。
作为优选方案，以上所述的基于沸石吸附的抗阿尔兹海默症药物的筛选方法，其特征在于，所述的沸石为β型沸石。
一种基于沸石吸附的抗阿尔兹海默症药物的筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)称取延胡索粉末，加入水中，回流提取，得提取液，过滤，得滤液，离心，吸取上清液，得延胡索提取液，备用；
(2)将乙酰胆碱酯酶溶解在PBS缓冲液中，加入沸石，加入PBS缓冲液，搅拌，调节溶液的pH值为8.0，在25℃条件下孵育20min，应用物理吸附技术在沸石表面上吸附乙酰胆碱酯酶得到吸附乙酰胆碱酯酶的沸石，然后将未吸附的乙酰胆碱酯酶溶液吸除，得到吸附乙酰胆碱酯酶的沸石；
(3)将步骤(1)提取得到的延胡索提取液和步骤(2)得到的吸附乙酰胆碱酯酶的沸石混合，加入PBS缓冲液，使离子强度为10mM，pH值为7.4，37℃孵育20分钟，离心吸出孵育液，加入PBS缓冲液清洗沸石四次，最后加入体积浓度为50％甲醇水溶液洗脱沸石，吸取50％甲醇水溶液洗脱液，进行液质分析。
作为优选方案，以上所述的基于沸石吸附的抗阿尔兹海默症药物的筛选方法，其特征在于，液质分析条件为：4.6mm×150mm，5μm的Kromasil C18柱，流动相：A相为用甲酸调制pH3.5的10mM醋酸铵溶液，B相为乙腈；梯度洗脱：0min，5％B；5min，15％B；10min，20％B；20min，25％B；30min，100％B；35min，100％B，流速0.6mL·min－1，柱温30℃，进样体积5μL；
液质分析参数：正离子模式，毛细管温度325℃，离子源电压+4.5kV，喷雾气压379.21kPa，去簇电压+60V，加热气压379.21kPa，离子源温度550℃，一级质谱扫描范围m/z100-1500，二级质谱激活类型CID。
有益效果：本发明提供的基于沸石吸附的抗阿尔兹海默症药物的筛选方法具有以下优点：
本发明提供的基于沸石吸附的抗阿尔兹海默症药物的筛选方法工艺设计合理，通过大量实验筛选出最佳的孵育温度、孵育时间、孵育时溶液的pH和离子强度和变性清洗液。
本发明可应用于筛选和评价天然产物以及化学合成药物中阿尔兹海默症治疗作用物质。与传统紫外筛选方法相比，可显著提高筛选效率、缩短筛选时间，并且能够发现化合物之间的协同效应。同时，本发明的筛选方法具有快速、准确、重现性好、灵敏度高等特征。
附图说明
图1为不同类型沸石在不同的孵育时间、pH值及温度下对乙酰胆碱酯酶吸附影响的曲线图。
图2为不同清洗次数对沸石上吸附的化合物的清洗情况的柱状图。
图3为不同变性洗脱液对吸附在沸石上的乙酰胆碱酯酶清洗情况的柱状图。
图4为在不同的pH值、孵育时间、离子强度和温度下乙酰胆碱酯酶对黄连碱溶液吸附情况的柱状图。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐明本发明，应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，在阅读了本发明之后，本领域技术人员对本发明的各种等价形式的修改均落于本申请所附权利要求所限定的范围。
以下实施例所用试剂：
乙酰胆碱酯酶(sigma，EC3.1.1.7)，乙酰硫代胆碱(sigma)，黄连碱、四氢非洲防己碱、原阿片碱、别隐品碱、延胡索乙素、黄连碱、紫堇碱、小檗碱、脱氢紫堇碱、非洲防己碱、四氢黄连碱、紫堇灵、去氢海罂粟碱、四氢小檗碱(成都瑞芬思生物科技有限公司)，盐酸巴马汀(上海源叶生物科技有限公司)，沸石(天津市实铅化工有限公司)，加兰他敏(天津美仑生物技术有限公司)。
以下实施例所用仪器：AB Sciex 5600液质联用仪器(AB Sciex公司)。
实施例1 吸附乙酰胆碱酯酶沸石的制备方法优选
1、实验方法：
将5ml配制好的乙酰胆碱酯酶溶液(2mg/ml)，溶解在200mM pH8.0的PBS缓冲液中，将5mg沸石放入缓冲液中，轻轻地搅拌，每隔一定时间取出20μl孵育液，用Bradford法测定孵育液中剩余的蛋白量。
分别对影响吸附的3个因素进行考察：首先取不同类型的沸石(Y型，ZSM-5型，Beta型)和一定量的乙酰胆碱酯酶溶液(5mL，2mg/mL)进行孵育，考察不同类型沸石对吸附的影响。其次，考察不同pH值(5.8，6.2，6.8，7.2和8.0)的PBS缓冲液对吸附的影响。第三，考察不同孵育温度(25℃、30℃、37℃、45℃)对乙酰胆碱酯酶吸附的影响。
然后使用X光谱衍射、透射电镜、扫描电镜、红外、激光粒径仪对乙酰胆碱酯酶吸附沸石进行性状表征。
2、实验结果：
2.1 乙酰胆碱酯酶吸附的沸石的电镜图表明沸石表面布满白色物质是因为吸附了乙酰胆碱酯酶。
2.2 乙酰胆碱酯酶吸附沸石红外图谱表明，沸石吸附乙酰胆碱酯酶后出现新的酰胺带(1640cm-1)，表明沸石成功地吸附了乙酰胆碱酯酶。
2.3 不同类型沸石、孵育时间、pH及温度对乙酰胆碱酯酶吸附的影响，如图1的结果表明：吸附过程中的四个参数，分别为不同类型的沸石、吸附时间、缓冲液的pH以及吸附温度。最优条件为选取β型沸石作为吸附材料，孵育时间20min，缓冲液pH为8.0，孵育温度为25℃。
实施例2 基于沸石吸附的抗阿尔兹海默症药物的筛选方法的各因素研究
1、实验方法
1.1 将5ml配制好的乙酰胆碱酯酶溶液(2mg/ml)，溶解在200mM pH8.0的PBS缓冲液中，将5mg沸石放入缓冲液中，轻轻地搅拌，25℃下孵育20min，吸除溶液，用PBS缓冲液冲洗沸石，得到吸附乙酰胆碱酯酶的沸石。
1.2 在离心管中，加入20μL的黄连碱溶液(1mg/mL)，加入步骤1.1制备得到的吸附乙酰胆碱酯酶的沸石0.025mg，加入200μL的PBS缓冲液，调节溶液到不同的pH值(5.7，6.2，6.8，7.4，8.0)和不同的离子强度(10、50、100、200、500、1000mM)、然后在不同的孵育温度(20、25、30、37、45℃)下，水浴孵育不同的时间(5、10、20、30、40min)，分别吸出孵育液，加入200μL的PBS缓冲液清洗沸石(1、2、3、4、5次)，最后加入不同的变性洗脱溶剂(10％、30％、50％、70％、90％乙腈-水溶液(v/v)及10％、30％、50％、70％、90％甲醇-水溶液)洗脱结合化合物，吸取洗脱液进行液质分析。
2、实验结果
2.1 清洗次数和变性洗脱溶剂的条件优化考察结果
清洗的目的在于排除没有键合或非特异性的化合物产生的干扰，对不同的清洗次数进行考察，结果表明，如图2所示，清洗四次可以足够消除未吸附的化合物。
如图3的所示，变性洗脱将吸附在沸石上的乙酰胆碱酯酶清洗下来，结果表明，50％(v/v)甲醇—水洗脱溶剂洗脱效率优于其他洗脱溶剂。
2.2 pH值，孵育时间，离子强度和温度的条件优化考察结果
溶液的pH值对酶活性有影响，pH值的变化可能改变电荷使它经受不住催化从而不能吸附到沸石材料上，乙酰胆碱酯酶的等电点是5.0，黄连碱的PKa值为10.7，乙酰胆碱酯酶在5.7～8.0之间带负电荷，黄连碱在5.7～8.0之间带正电荷，静电吸引力增加了乙酰胆碱酯酶和黄连碱之间的反应，如图4中A所示，pH在7.4时，反应程度最大。
孵育时间的长短是影响反应的因素之一，如图4中B所示，最佳孵育时间为20min，孵育时间增加会不利于反应的进行，20min孵育时间已达到饱和。
如图4中C所示，PBS缓冲液浓度从10mM增加到1000mM，黄连碱抑制率下降，可能是由于乙酰胆碱表面电荷中和了过多的PBS，导致黄连碱与乙酰胆碱酯酶之间的静电作用减少，因此，10mM的PBS浓度最适宜。
酶是一种催化剂，减少反应所需的活化能，提高温度能减少活化能，但也可能使酶变性，如图4中D所示，37℃最为适宜。
实施例3 延胡索提取物中抗阿尔兹海默症成分的筛选
1、实验方法
1.1、称取1g延胡索粉末，加入50ml水，回流1h，过滤，滤液13400rpm离心10min，吸取上清液备用。
1.2、将5ml配制好的乙酰胆碱酯酶溶液(2mg/ml)，溶解在200mM pH8.0的PBS缓冲液中，将5mg沸石放入缓冲液中，轻轻地搅拌，25℃下孵育20min，吸除溶液，用PBS缓冲液冲洗沸石，得到吸附乙酰胆碱酯酶的沸石。
1.3、在1.5mL的离心管中，加入步骤1提取得到的20μL的延胡索提取物溶液(10mg/mL)和步骤2得到的吸附乙酰胆碱酯酶的沸石，加入180μL的PBS缓冲液(使离子强度为10mM，pH值为7.4)，37℃孵育20分钟，离心吸出孵育液，加入200μLPBS缓冲液清洗沸石四次，最后加入体积浓度为50％甲醇-水溶液(v/v)200μL洗脱结合化合物，振摇10分钟后，吸取洗脱液进行液质分析。另设变性乙酰胆碱酯酶吸附沸石作为对照，排除特异性结合。
液质分析条件：液相条件：Kromasil C18柱(4.6mm×150mm，5μm)，流动相：用甲酸调制pH3.5的10mM醋酸铵溶液(A)和纯乙腈(B)，梯度洗脱(0min，5％B；5min，15％B；10min，20％B；20min，25％B；30min，100％B；35min，100％B)，流速0.6mL·min－1，柱温30℃，进样体积5μL。
液质分析参数：正离子模式，毛细管温度325℃，离子源电压+4.5kV，喷雾气压379.21kPa，去簇电压+60V，加热气压379.21kPa，离子源温度550℃，一级质谱扫描范围m/z100-1500，二级质谱激活类型CID。
2、实验结果
通过在线液-质联用技术筛选延胡索提取物中抗阿尔兹海默症成分，如表1所示，发现14个活性成分，其中10个成分的活性为首次发现。和基于磁珠的筛选方法相比，该方法不使用键合试剂，具有省钱、方便等优点。
表1 延胡索提取物中化合物对乙酰胆碱酯酶活性的抑制作用
本发明基于沸石的亲和选择-质谱筛选系统，通过将乙酰胆碱酯酶吸附到沸石上，对药用植物提取物中的乙酰胆碱酯酶抑制剂进行筛选。对影响吸附的因素，如：沸石类型、溶液pH值、吸附时间、吸附温度等因素进行了系统优化。并且还对筛选药物的影响因素，如：孵育液pH、孵育液离子强度、孵育液温度、孵育时间等因素进行了系统优化，建立了能高效、正确、灵敏、重复性高的筛选抗阿尔兹海默症成分的方法，具有重要的应用价值。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (1)
1.一种基于沸石吸附的抗阿尔兹海默症药物的筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)称取延胡索粉末，加入水中，回流提取，得提取液，过滤，得滤液，离心，吸取上清液，得延胡索提取液，备用；
(2)将乙酰胆碱酯酶溶解在PBS缓冲液中，加入沸石，加入PBS缓冲液，搅拌，调节溶液的pH值为8.0，在25℃条件下孵育20min，应用物理吸附技术在沸石表面上吸附乙酰胆碱酯酶得到吸附乙酰胆碱酯酶的沸石，然后将未吸附的乙酰胆碱酯酶溶液吸除，得到吸附乙酰胆碱酯酶的沸石；
(3)将步骤(1)提取得到的延胡索提取液和步骤(2)得到的吸附乙酰胆碱酯酶的沸石混合，加入PBS缓冲液，使离子强度为10mM，pH值为7.4，37℃孵育20分钟，离心吸出孵育液，加入PBS缓冲液清洗沸石四次，最后加入体积浓度为50％甲醇水溶液洗脱沸石，吸取50％甲醇水溶液洗脱液，进行液质分析；
液质分析条件为：4.6mm×150mm，5μm的Kromasil C18柱，流动相：A相为用甲酸调制pH3.5的10mM醋酸铵溶液，B相为乙腈；梯度洗脱：0min，5％B；5min，15％B；10min，20％B；20min，25％B；30min，100％B；35min，100％B，流速0.6mL·min-1，柱温30℃，进样体积5μL；
液质分析参数：正离子模式，毛细管温度325℃，离子源电压+4.5kV，喷雾气压379.21kPa，去簇电压+60V，加热气压379.21kPa，离子源温度550℃，一级质谱扫描范围m/z100-1500，二级质谱激活类型CID。
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