CN106153768B - 鹅膏毒肽分子印迹材料用于α-amanitin和β-amanitin的固相萃取方法 - Google Patents

鹅膏毒肽分子印迹材料用于α-amanitin和β-amanitin的固相萃取方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了鹅膏毒肽分子印迹材料用于α‑amanitin和β‑amanitin的固相萃取方法，包括以下步骤：S1：合成以N‑乙酰色氨酸丙酰胺为模板分子的鹅膏毒肽分子印迹材料；S2：样品预处理：提取待测样品中的α‑amanitin和β‑amanitin，得到待测液；S3：固相萃取：向待测液中加入S1中制备得到的鹅膏毒肽分子印迹材料，震荡后，分离鹅膏毒肽分子印迹材料；S4：用一定体积的洗脱溶剂洗脱鹅膏毒肽分子印迹材料中的α‑amanitin和β‑amanitin，收集洗脱液；S5：用HPLC测定洗脱液中α‑amanitin和β‑amanitin的浓度。本发明建立了鹅膏毒肽分子印迹材料萃取与HPLC联用的检测方法，并通过鹅膏毒肽分子印迹材料对复杂样品中α‑amanitin和β‑amanitin进行富集，减少基体干扰和提高方法的灵敏度、准确度、精密度和选择性，进而大大提高检测α‑amanitin和β‑amanitin的灵敏度。

Description

鹅膏毒肽分子印迹材料用于α-amanitin和β-amanitin的固相 萃取方法
技术领域
本发明涉及固相萃取领域，尤其涉及一种鹅膏毒肽分子印迹材料用于α-amanitin和β-amanitin的固相萃取方法。
背景技术
我国群体性蘑菇中毒事件时有发生，社会关注度极高。蘑菇中毒大多数是因误食有毒的鹅膏菌。鹅膏菌毒素以鹅膏毒肽为主，我国鹅膏毒肽经分离鉴定的有9种，其中α-鹅膏毒肽含量最高毒性最强，β-鹅膏毒肽次之。鹅膏毒肽中毒患者若不及时诊断抢救，多在2-8天内以肝功能衰竭致死。
然而，蘑菇样品中α-amanitin和β-amanitin的含量很低，因此需要富集样品中痕量α-amanitin和β-amanitin组分，减少基体干扰和提高方法的灵敏度、准确度、精密度和选择性，进而大大提高检测α-amanitin和β-amanitin的灵敏度。
目前，现代分析方法中样品前处理技术方法准则是批量大、速度快、自动化程度高、成本低、劳动强度低、试剂消耗少、方法准确可靠、有利于人体健康和环境保护，这些都是评价样品前处理技术的发展趋势。而传统样品前处理技术如液液萃取、C18柱或混合柱固相萃取等方法分离富集等，普遍存在效率低、费时、有毒有机溶剂用量大及操作较繁琐等问题，因此发展高效、快速、简单、绿色的样品前处理技术尤为重要。生物样品如尿液、血浆、组织等样品组成复杂，存在基体干扰的多样性和复杂性，因而还需要发展高亲和力、高选择性的样品前处理技术，以实现痕量或超痕量待测组分的分离与富集。
固相萃取(SPE)是20世纪70年代由液固萃取与柱液相色谱技术相结合发展起来的样品分离技术，其将分离与浓缩合为一体，通过使用不同的选择性溶剂洗脱出杂质与目标物质，达到分离目的。传统SPE的目标物与吸附剂之间的作用力是非特异性的，通常需对萃取和洗脱条件进行仔细选择，而且对不同基质的分离与分析物需要选择不同的柱填料，从而限制了SPE的进一步发展。分子印迹聚合物(MIP)独特的选择性和亲和力适应了这一发展要求。由于模板选择的多样性，使得分子印迹聚合物能广泛应用于物质的分离和分析过程，其对于目标物质的高度选择性也是普通SPE所不能比拟的。分子印迹固相萃取的操作模式分为在线模式和离线模式。在线模式指的是将分子印迹固相萃取柱与其它仪器相连。目前分子印迹固相萃取采用最多的还是离线模式，这种模式比在线操作简单，可选用的溶剂较多，因此有更高的富集倍数和较好的选择性。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中的缺点和不足，提供一种鹅膏毒肽分子印迹材料用于α-amanitin和β-amanitin的固相萃取方法。
本发明是通过以下技术方案实现的：鹅膏毒肽分子印迹材料用于α-amanitin和β-amanitin的固相萃取方法，包括以下步骤：
S1：合成以N-乙酰色氨酸丙酰胺为模板分子的鹅膏毒肽分子印迹材料；
S2：样品预处理：提取待测样品中的α-amanitin和β-amanitin，得到待测液；
S3：固相萃取：向待测液中加入S1中制备得到的鹅膏毒肽分子印迹材料，震荡后，分离鹅膏毒肽分子印迹材料；
S4：用一定体积的洗脱溶剂洗脱鹅膏毒肽分子印迹材料中的α-amanitin和β-amanitin，收集洗脱液；
S5：用HPLC测定洗脱液中α-amanitin和β-amanitin的浓度。
相对于现有技术，本发明的鹅膏毒肽分子印迹材料用于α-amanitin和β-amanitin的固相萃取方法，建立了鹅膏毒肽分子印迹材料萃取与HPLC联用的检测方法，并通过鹅膏毒肽分子印迹材料对复杂样品中α-amanitin和β-amanitin进行富集，减少基体干扰和提高方法的灵敏度、准确度、精密度和选择性，进而大大提高检测α-amanitin和β-amanitin的灵敏度。
进一步，所述鹅膏毒肽分子印迹材料的制备方法包括以下步骤：
S11：将模板分子N-乙酰色氨酸丙酰胺与功能单体3-巯基丙酸、交联剂、溶剂混匀；
S12：将二氧化硅表面进行巯基化处理；
S13：将S12处理得到的二氧化硅加入S11制得的混合溶液中，功能单体与模板分子交联聚合；
S14：用洗脱液将模板分子从聚合后的二氧化硅表面洗脱，干燥，得到鹅膏毒肽分子印迹材料；
其中，S13中的聚合条件为：用碱将聚合反应液pH调至7～9，40℃～50℃下反应6～12h。
进一步，所述S11中交联剂为乙二醇二甲基丙烯酸酯；所述溶剂为二甲基亚砜。
进一步，所述S11中模板分子、功能单体、交联剂的摩尔比例为0.2:1:2。
进一步，所述S11中还包括辅助交联剂，所述辅助交联剂为季戊四醇四-3-巯基丙酸酯，所述辅助交联剂与交联剂的摩尔比例为9:4。
进一步，所述S2中样品为蘑菇样品，样品预处理包括以下步骤：
S21：将蘑菇样品烘干至恒重；
S22：向S21处理后的蘑菇样品中加入50％的甲醇溶液，然后震荡24h；
S23：将S22震荡后的甲醇溶液离心，取上清液；在离心得到的沉淀中加入与S22中同体积的甲醇溶液，重复S22然后再离心，取上清液；将两次上清液合并，除去甲醇溶剂；
S24：将S23处理后的液体用0.45μm的滤膜过滤，得到待测液。
进一步，所述S3中，鹅膏毒肽分子印迹材料在样品待测液中的分散浓度为5-20g/L。
进一步，所述S4中的洗脱液为体积比为9:1的甲醇-乙酸溶剂。
进一步，所述S5中HPLC的检测条件为：色谱柱为C18柱；流动相：A为0.02M乙酸铵水溶液，B为0.02M乙酸铵乙腈溶液，流动相为A与B体积比为6：4的混合溶剂；流速0.7mL/min；紫外检测波长为302nm；进样量20μL。
进一步，所述S12中将二氧化硅表面进行巯基化处理包括以下步骤：
S12a：取二氧化硅微球，超声分散于去离子水中，加入甲醇，超声分散；
S12b：向S12a得到的反应液中加入甘油后继续超声，超声后通入氮气；
S12c：取(3-巯丙基)-三乙氧基硅烷与甲醇混合均匀后倒入S12b得到的反应液中，搅拌使其混合均匀；
S12d：向S2c中的反应液中加入的氨水，于85℃、氮气保护下反应1h后，停止氮气保护后再反应5h；
S12e：反应完毕后离心收集巯基功能化的二氧化硅微球，用无水乙醇和去离子水分别洗涤，干燥即得到表面巯基化的二氧化硅微球。
为了更好地理解和实施，下面结合附图详细说明本发明。
附图说明
图1是本发明的鹅膏毒肽分子印迹材料的制备过程示意图。
图2是在待测样品中加入鹅膏毒肽分子印迹材料前(a)和后再解吸的溶液(b)的液相色谱图。
具体实施方式
本发明公开的鹅膏毒肽分子印迹材料用于α-amanitin和β-amanitin的固相萃取方法，包括以下步骤：
S1：合成以N-乙酰色氨酸丙酰胺为模板的鹅膏毒肽分子印迹材料。
S2：样品预处理：提取待测样品中的α-amanitin和β-amanitin，得到待测液。
S3：固相萃取：向待测液中加入S1中制备得到的鹅膏毒肽分子印迹材料，萃取后，分离鹅膏毒肽分子印迹材料。
S4：用一定体积的洗脱溶剂洗脱鹅膏毒肽分子印迹材料中的α-amanitin和β-amanitin，收集洗脱液。
S5：用HPLC测定洗脱液中α-amanitin和β-amanitin的浓度。
在本实施例中，所述S1中的鹅膏毒肽分子印迹材料的制备方法包括以下步骤：
S11：将模板分子N-乙酰色氨酸丙酰胺与功能单体3-巯基丙酸、交联剂、溶剂混匀；
S12：将二氧化硅表面进行巯基化处理；
S13：将S12处理得到的二氧化硅加入S11制得的混合溶液中，功能单体与模板分子交联聚合；
S14：用洗脱液将模板分子从聚合后的二氧化硅表面洗脱，干燥，得到鹅膏毒肽分子印迹材料。
其中，S11中模板分子、功能单体、交联剂的摩尔比例优选0.2:1:2。所述S11中交联剂为乙二醇二甲基丙烯酸酯，所述溶剂为二甲基亚砜。所述S11中还包括辅助交联剂，所述辅助交联剂为季戊四醇四-3-巯基丙酸酯，所述辅助交联剂与交联剂的摩尔比例为9:4。S13中的聚合条件为：用碱将聚合反应液pH调至7～9，40℃～50℃下反应6～12h。
在本实施例中，所述S2中的样品为蘑菇样品，样品预处理包括以下步骤：
S21：将蘑菇样品烘干至恒重；
S22：向S21处理后的蘑菇样品中加入50％的甲醇溶液，然后震荡24h；
S23：将S22震荡后的甲醇溶液离心，取上清液；在离心得到的沉淀中加入与S22中同体积的甲醇溶液，重复S22然后再离心，取上清液；将两次上清液合并，除去甲醇溶剂；
S24：将S23处理后的液体用0.45μm的滤膜过滤，得到待测液。
在本实施例中，所述S3中，鹅膏毒肽分子印迹材料在样品待测液中的分散浓度为5-20g/L，优选15g/L。所述S4中的洗脱液为体积比为9:1的甲醇-乙酸溶剂。所述S5中HPLC的检测条件优选：色谱柱为C18柱；流动相：A为0.02M乙酸铵水溶液，B为0.02M乙酸铵乙腈溶液，流动相为A与B体积比为6：4的混合溶剂；流速0.7mL/min；紫外检测波长为302nm；进样量20μL。
相对于现有技术，本发明的鹅膏毒肽分子印迹材料用于α-amanitin和β-amanitin的固相萃取方法，建立了鹅膏毒肽分子印迹材料萃取与HPLC联用的检测方法，并通过鹅膏毒肽分子印迹材料对复杂样品中α-amanitin和β-amanitin进行富集，减少基体干扰和提高方法的灵敏度、准确度、精密度和选择性，进而大大提高检测α-amanitin和β-amanitin的灵敏度。
实施例1：鹅膏毒肽分子印迹材料的制备
本实施例对用于α-amanitin和β-amanitin的固相萃取的鹅膏毒肽分子印迹材料的制备方法进行详细的描述。
请参阅图1，其是本发明的鹅膏毒肽分子印迹材料的制备过程示意图。所述鹅膏毒肽分子印迹材料的制备方法包括以下步骤：
S11：将模板分子N-乙酰色氨酸丙酰胺与功能单体3-巯基丙酸、交联剂乙二醇二甲基丙烯酸酯、辅助交联剂季戊四醇四-3-巯基丙酸酯和二甲基亚砜溶剂混匀。在本实施例中，所述模板分子、功能单体、交联剂的摩尔比例优选0.2:1:2。所述辅助交联剂与交联剂的摩尔比优选9:4。
S12：将二氧化硅表面进行巯基化处理。具体的如下：
S12a：取4.0g二氧化硅微球，超声分散于5mL去离子水中，加入120mL甲醇，超声分散；
S12b：向S12a得到的反应液中加入120mL甘油后继续超声，超声后通入氮气；
S12c：取4mL的(3-巯丙基)-三乙氧基硅烷与40mL甲醇混合均匀后倒入S12b得到的反应液中，搅拌使其混合均匀；
S12d：向S2c中的反应液中加入10mL的氨水，于85℃、氮气保护下反应1h后，停止氮气保护后再反应5h；
S12e：反应完毕后，离心收集巯基功能化的二氧化硅微球，用无水乙醇和去离子水分别洗涤3次，干燥即可得到表面巯基化的二氧化硅微球。
实施例2：样品预处理
在本实施例中，所述样品为蘑菇样品，具体的预处理方法包括以下步骤：
S21：将蘑菇样品烘干至恒重。
S22：取5.0g烘干至恒重的蘑菇样品，加入25mL的体积分数为50％的甲醇溶液，置于摇床中在150r/min条件下震荡24h。
S23：将S22震荡后的甲醇溶液于10000r/min离心10min，取上清液；在离心得到的沉淀中再加入25mL的体积分数为50％的甲醇溶液，再震荡取上清液；将两次的上清液合并，旋转蒸发除去甲醇，得到蘑菇提取液。
S24：将S23处理后的提取液用0.45μm的滤膜过滤，得到待测液。
在本实施例中，所述样品预处理步骤中加入各种溶剂的体积不局限于此。
实施例3
在本实施例中，将实施例1中制备得到的鹅膏毒肽分子印迹材料用于实施例2中得到的样品待测液中的α-amanitin和β-amanitin的固相萃取，包括以下步骤：
S1：用实施例1所述方法制备得到鹅膏毒肽分子印迹材料。
S2：用实施例2所述方法得到的样品待测液。
S3：取S1中的鹅膏毒肽分子印迹材料10mg，加入到S2中得到的1mL的样品待测液中，萃取10h后，分离鹅膏毒肽分子印迹材料。
S4：用体积比为9:1的甲醇-乙酸混合溶剂作为洗脱溶剂，洗脱S3中分离得到的鹅膏毒肽分子印迹材料中的α-amanitin和β-amanitin，收集洗脱液。
S5：用HPLC测定洗脱液中α-amanitin和β-amanitin的浓度，所述HPLC检测的条件优选为：液相色谱分析柱(Diamonsil C18(2),150mmⅹ4.6mm I.D.Dikma Technologies)流动相：A为0.02M乙酸铵水溶液，B 0.02M乙酸铵乙腈溶液，AB之比为6：4(v/v)；流速0.7mL/min；紫外检测器检测波长设定在302nm；进样量20μL。
请参阅图2，其是在待测样品中加入鹅膏毒肽分子印迹材料前(a)和后再解吸的溶液(b)的液相色谱图。从图中可知，加入印迹材料后再解吸的溶液中能明显分辨出α-amanitin和β-amanitin，说明印迹材料对α-amanitin和β-amanitin具有特定的固相萃取作用。
实施例4
本实施例与实施例3步骤大体相同，不同之处在于S3中鹅膏毒肽分子印迹材料、样品待测液的用量及萃取的时间。
具体的，S3中：取S1中的鹅膏毒肽分子印迹材料14mg，加入到S2中得到的1.5mL的样品待测液中，萃取12h后，分离鹅膏毒肽分子印迹材料。
实施例5
本实施例与实施例3步骤大体相同，不同之处在于S3中鹅膏毒肽分子印迹材料、样品待测液的用量及萃取的时间。
具体的，S3中：取S1中的鹅膏毒肽分子印迹材料16mg，加入到S2中得到的2mL的样品待测液中，萃取13h后，分离鹅膏毒肽分子印迹材料。
实施例6
本实施例与实施例3步骤大体相同，不同之处在于S3中鹅膏毒肽分子印迹材料、样品待测液的用量及萃取的时间。
具体的，S3中：取S1中的鹅膏毒肽分子印迹材料15mg，加入到S2中得到的1mL的样品待测液中，萃取14h后，分离鹅膏毒肽分子印迹材料。
效果实施例
对实施例2中制备得到的样品提取液进行不同浓度的加标处理，然后按照所述固相萃取方法对加标样品进行分析得出下表，α-amanitin在三个浓度梯度下的加标回收率分别为83.9％-85.8％，β-amanitin在两个浓度梯度下的加标回收率76.3％-80.2％。结果表明，这种方法对于复杂样品中α-和β-amanitin萃取结果是准确可信的。
表1样品待测液中α-amanitin和β-amanitin的加标回收率平均值(n＝3)
本发明并不局限于上述实施方式，如果对本发明的各种改动或变形不脱离本发明的精神和范围，倘若这些改动和变形属于本发明的权利要求和等同技术范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变形。

Claims (9)

1.鹅膏毒肽分子印迹材料用于α-amanitin和β-amanitin的固相萃取方法，其特征在于，基于点击化学的分子印迹聚合物的制备方法，包括以下步骤：
S1：合成以N-乙酰色氨酸丙酰胺为模板分子的鹅膏毒肽分子印迹材料；
S2：样品预处理：提取待测样品中的α-amanitin和β-amanitin，得到待测液；
S3：固相萃取：向待测液中加入S1中制备得到的鹅膏毒肽分子印迹材料，震荡后，分离鹅膏毒肽分子印迹材料；
S4：用一定体积的洗脱溶剂洗脱鹅膏毒肽分子印迹材料中的α-amanitin和β-amanitin，收集洗脱液；
S5：用HPLC测定洗脱液中α-amanitin和β-amanitin的浓度；
所述鹅膏毒肽分子印迹材料的制备方法包括以下步骤：
S11：将模板分子N-乙酰色氨酸丙酰胺与功能单体3-巯基丙酸、交联剂、溶剂混匀；
S12：将二氧化硅表面进行巯基化处理；
S13：将S12处理得到的二氧化硅加入S11制得的混合溶液中，功能单体与模板分子交联聚合；
S14：用洗脱液将模板分子从聚合后的二氧化硅表面洗脱，干燥，得到鹅膏毒肽分子印迹材料；
其中，S13中的聚合条件为：用碱将聚合反应液pH调至7～9，40℃～50℃下反应6～12h。
2.根据权利要求1所述的鹅膏毒肽分子印迹材料用于α-amanitin和β-amanitin的固相萃取方法，其特征在于，所述S11中交联剂为乙二醇二甲基丙烯酸酯；所述溶剂为二甲基亚砜。
3.根据权利要求1所述的鹅膏毒肽分子印迹材料用于α-amanitin和β-amanitin的固相萃取方法，其特征在于，所述S11中模板分子、功能单体、交联剂的摩尔比例为0.2:1:2。
4.根据权利要求2所述的鹅膏毒肽分子印迹材料用于α-amanitin和β-amanitin的固相萃取方法，其特征在于，所述S11中还包括辅助交联剂，所述辅助交联剂为季戊四醇四-3-巯基丙酸酯，所述辅助交联剂与交联剂的摩尔比例为9:4。
5.根据权利要求1-4中任一权利要求所述的鹅膏毒肽分子印迹材料用于α-amanitin和β-amanitin的固相萃取方法，其特征在于，所述S2中样品为蘑菇样品，样品预处理包括以下步骤：
S21：将蘑菇样品烘干至恒重；
S22：向S21处理后的蘑菇样品中加入50％的甲醇溶液，然后震荡24h；
S23：将S22震荡后的甲醇溶液离心，取上清液；在离心得到的沉淀中加入与S22中同体积的甲醇溶液，重复S22然后再离心，取上清液；将两次上清液合并，除去甲醇溶剂；
S24：将S23处理后的液体用0.45μm的滤膜过滤，得到待测液。
6.根据权利要求5所述的鹅膏毒肽分子印迹材料用于α-amanitin和β-amanitin的固相萃取方法，其特征在于，所述S3中，鹅膏毒肽分子印迹材料在样品待测液中的分散浓度为15g/L。
7.根据权利要求1所述的鹅膏毒肽分子印迹材料用于α-amanitin和β-amanitin的固相萃取方法，其特征在于，所述S4中的洗脱液为体积比为9:1的甲醇-乙酸溶剂。
8.根据权利要求1所述的鹅膏毒肽分子印迹材料用于α-amanitin和β-amanitin的固相萃取方法，其特征在于，所述S5中HPLC的检测条件为：色谱柱为C18柱；流动相：A为0.02M乙酸铵水溶液，B为0.02M乙酸铵乙腈溶液，流动相为A与B体积比为6：4的混合溶剂；流速0.7mL/min；紫外检测波长为302nm；进样量20μL。
9.根据权利要求1所述的鹅膏毒肽分子印迹材料用于α-amanitin和β-amanitin的固相萃取方法，其特征在于，所述S12中将二氧化硅表面进行巯基化处理包括以下步骤：
S12a：取二氧化硅微球，超声分散于去离子水中，加入甲醇，超声分散；
S12b：向S12a得到的反应液中加入甘油后继续超声，超声后通入氮气；
S12c：取(3-巯丙基)-三乙氧基硅烷与甲醇混合均匀后倒入S12b得到的反应液中，搅拌使其混合均匀；
S12d：向S2c中的反应液中加入的氨水，于85℃、氮气保护下反应1h后，停止氮气保护后再反应5h；
S12e：反应完毕后离心收集巯基功能化的二氧化硅微球，用无水乙醇和去离子水分别洗涤，干燥即得到表面巯基化的二氧化硅微球。
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