CN106290635B - 一种基于磁珠分离的抗黑色素生成的药物筛选方法 - Google Patents

一种基于磁珠分离的抗黑色素生成的药物筛选方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种基于磁珠分离的抗黑色素生成的药物筛选方法，该方法采用磁性分离和化学信息采集(液质联用)技术，分析靶标蛋白结合物，用于药物抗黑色素生成作用的筛选和评价。本发明通过大量实验筛选出最佳的孵育温度、孵育时间、孵育时溶液的pH值、离子强度和变性清洗液。本发明与传统筛选方法相比，可显著提高筛选效率、缩短筛选时间，并且能够发现化合物之间的协同效应，能够用于大规模天然产物库或组合化学库的筛选，适合于在早期开展对于抗黑色素生成药物(包括化学合成药以及天然产物)的筛选和先导化合物的发现，具有快速、准确、重现性好等优点。

Description

一种基于磁珠分离的抗黑色素生成的药物筛选方法
技术领域
本发明涉及一种药物的筛选方法，具体涉及一种筛选效率高，基于磁珠分离的抗黑色素生成的药物筛选方法。
背景技术
皮肤的黑白主要取决于黑色素细胞合成黑色素的能力。在人的表皮基底层细胞间，分布着黑色素细胞，它含有的酪氨酸酶可以将酪氨酸氧化成多糖，中间再经过一系列的代谢过程，最后便可生成黑色素。黑色素生成越多，皮肤就越黝黑；反之，则皮肤就越白皙。
酪氨酸酶具有独特的双重催化功能，是生物体内黑色素合成的关键酶，与人的衰老有密切关系。其异常过量表达可导致人体的色素沉着性疾病。酪氨酸酶抑制剂可以治疗目前常见的色素沉着性皮肤病如雀斑、黄褐斑、老年斑。市场上流行的美白化妆品中的熊果苷、维生素C衍生物、曲酸及其衍生物、绿茶提取物、甘草提取物等中药提取物等均为酪氨酸酶抑制剂，主要是通过抑制酪氨酸酶的活性而达到抑制黑色素合成，进而发挥美白的作用。
很多药物筛选系统是基于荧光的在线或离线高通量筛选，尽管灵敏度高、选择性好，但是建立荧光筛选系统需要的时间较长，因为必须选择合适的荧光报告分子，这项工作成本高、耗时长，其次是荧光信号只代表了化合物的亲和性，没有化合物的化学信息，而化合物库中所含的杂质和降解产物经常呈现假阳性。近年来，使用质谱检测同时获得化学和生物学信息的方法非常普遍，可以降低假阳性和假阴性。使用超滤膜把蛋白结合物与未结合的化合物分离开，再进行质谱检测。这种方法会使很多未结合的化合物滞留在样品中，膜材料与蛋白和化合物的非特异性结合也会影响实验的准确性。另外有一种方法是把蛋白固定在柱子上作为固定相，使用洗脱溶剂把化合物按照与蛋白的结合强弱依次洗脱下来，但是所需要的洗脱溶剂与质谱的兼容性不好。还有一种方法是把蛋白固定在某种合适的载体上，与配体作用后，把不结合的部分洗脱掉，然后把结合配体洗脱出来。靶标蛋白可以共价形式固定在磁性颗粒表面，也可以通过His肽段以非共价的形式固定在非磁性硅材料上，后者适用的靶标范围更广。
表面结合官能团的顺磁性颗粒原来是被用来纯化蛋白的，如键合C8和C18可以分离肽段；键合单核苷酸可以研究DNA与药物的相互作用；键合抗体可以选择性分离所需的分析物或者干细胞。类似的，键合靶标蛋白可以用来筛选亲和性配体。Wainer等首次把热休克蛋白90α和人雌激素受体键合到了磁性材料上。Zhang等把酶固定在磁性颗粒上，对酶的抑制剂进行筛选。磁性材料的处理方法有手动和自动的液体处置系统、序列注射方法、微流控芯片设备。Lingeman等把人雌激素受体LBD结构域固定在磁珠上，建立了一个自动化的筛选系统。当然使用磁珠进行药物筛选存在着一定的局限性，首先是由于蛋白与磁珠共价结合后会可能改变蛋白与化合物的结合性能，其次，这种方法自动化过程相当费时，需要对流速、管径、压力、蛋白-磁珠比等多个因素进行优化。目前，选择酪氨酸酶作为药物靶标，通过应用磁珠键合技术，建立基于磁性分离的酪氨酸酶抑制剂筛选的方法尚无人报道。
发明内容
发明目的：本发明的目的在于提供一种工艺设计合理，采用磁性分离和化学信息采集(液质联用)技术，分析靶标蛋白结合物，用于抗黑色素生成药物的筛选和评价，本发明提供的方法，筛选效率高，筛选准确度高，对于抗黑色素生成药物的筛选具有重要应用价值。
技术方案，为实现以上目的，本发明采取的技术方案为：
一种基于磁珠分离的抗黑色素生成的药物筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：取活化磁珠加入酪氨酸酶溶液，震荡混合均匀，室温孵育，应用化学键合技术在磁珠上键合酪氨酸酶得到酪氨酸酶键合磁珠，然后将未键合的酪氨酸酶分离，将酪氨酸酶键合磁珠和待筛选的药物混合、孵育；孵育结束后先用PBS缓冲液清洗，再用变性清洗液进行变性洗脱，然后对变性洗脱物进行液质分析，获取靶标结合物的相关信息，筛选出具有抗黑色素生成作用的成分。
作为优选方案，以上所述的基于磁珠分离的抗黑色素生成的药物筛选方法，其特征在于，变性清洗液为乙腈水溶液或甲醇水溶液。
作为优选方案，以上所述的基于磁珠分离的抗黑色素生成的药物筛选方法，其特征在于，孵育结束后先用PBS缓冲液清洗4次，变性清洗液为体积浓度10％的乙腈水溶液。
作为优选方案，以上所述的基于磁珠分离的抗黑色素生成的药物筛选方法，其特征在于，将酪氨酸酶键合磁珠和待筛选的药物在温度为34.84℃，离子强度为193.67mM，pH为6.98条件下孵育30min。
一种基于磁珠分离的抗黑色素生成的药物筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)取一定体积磁珠，使用等体积的25mM MES缓冲溶液清洗2～3次，每次次10～15min，清洗后，加入等体积的50mg/ml EDC溶液和50mg/ml NHS溶液，混合均匀，在室温下缓慢震荡孵育，孵育后，放在磁铁上4～6min，移除上清液，再使用25mM的MES缓冲溶清洗，得到活化磁珠，备用；
(2)取步骤(1)得到的活化磁珠，加入酪氨酸酶溶液，震荡混合均匀，室温下孵育，孵育后，放在磁珠上4～6min，移除键合剩下的上清液，得到酪氨酸酶键合磁珠；
(3)取芍药苷，加入步骤(3)制备得到的酪氨酸酶键合磁珠，加入PBS缓冲液，放在振荡器上混匀，在34.84℃，离子强度为193.67mM，pH为6.98条件下孵育30min，然后放在磁铁上，使键合磁珠与溶液分开，先用PBS缓冲液清洗4次，再用10％乙腈的水溶液变性洗脱，变性洗脱液进行液质分析。
作为优选方案，以上所述的一种基于磁珠分离的抗黑色素生成的药物筛选方法，其特征在于，液质分析的液质参数为ESI负离子模式。
以上所述的一种基于磁珠分离的抗黑色素生成的药物筛选方法，液相条件为:XBridge C18柱(250mm×4.6mm，5μm)，流动相A相为0.1％甲酸水–B相为乙腈，梯度洗脱：0min，10％B；10min，15％B；25min，30％B；60min，100％B，流速1.0mL·min-1，柱温30℃，进样体积5μL。质谱条件:负离子模式，毛细管温度325℃，离子源电压－4.5kV喷雾气压379.21kPa，去簇电压－60V，加热气压379.21kPa，离子源温度550℃，一级质谱扫描范围m/z100-1500，二级质谱激活类型CID。
有益效果：本发明提供的基于磁珠分离的抗黑色素生成的药物筛选方法具有以下优点：
本发明提供的基于磁珠分离的抗黑色素生成的药物筛选方法工艺设计合理，通过大量实验筛选出最佳的孵育温度、孵育时间、孵育时溶液的pH和离子强度和变性清洗液。
本发明主要应用于筛选和评价天然产物以及化学合成药物中抗黑色素生成物质。与传统筛选方法相比，可显著提高筛选效率、缩短筛选时间，并且能够发现化合物之间的协同效应。同时，本筛选方法具有快速、准确、重现性好等特征。
附图说明
图1为磁珠表面键合蛋白的定量结果图。
图2为孵育时间的优化结果图。
图3为不同pH、离子强度和反应温度下孵育的3D响应面分析结果图。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐明本发明，应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，在阅读了本发明之后，本领域技术人员对本发明的各种等价形式的修改均落于本申请所附权利要求所限定的范围。
以下实施例所用试剂：
酪氨酸酶(蘑菇，EC:1.14.18.1，sigma)、芍药苷(成都瑞芬思生物技术有限公司)、磁珠(天津倍思乐色谱技术开发中心)、1-乙基-3-(3-二甲氨丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC，sigma)、2-(N-吗啡啉)乙磺酸(MES，sigma)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS，sigma)。
实施例所用仪器：AB Sciex 5600Q-TOF高分辨质谱仪(AB Sciex公司)
实施例1酪氨酸酶键合磁珠的制备
取一定体积磁珠，使用等体积的25mM MES(pH 6)溶液清洗两次，两次10min，在清洗后的磁珠上加入等体积的新鲜配制的EDC溶液和NHS溶液(50mg/ml)，混合均匀，在室温下缓慢震荡孵育30min。孵育后，把管子放在磁铁上4min，移除上清液，最后使用25mM MES(pH6)溶液清洗两次，备用。
分别取25、50、75、100、125、150μL活化磁珠各1份，加入100μL酪氨酸酶(1mg/ml)溶液，震荡混合均匀，在室温孵育过夜。孵育后，把管子放在磁珠上4min，移除键合剩下的上清液，使用Bradford法测定其中蛋白含量。键合磁珠加入100μL 0.5％BSA溶液震荡15min后移去清洗液，使用Bradford法测定其中蛋白含量。
并使用X光谱衍射、透射电镜、振动磁性测定仪、红外、粒径分布对酪氨酸酶键合磁珠和空白磁珠进行性状表征。
X衍射的磁珠的主峰，如2.9706，2.5322，2.1008，1.7122，1.6146和1.4837，与标准Fe3O4XRD谱匹配。键合磁珠的最大饱和磁化程度(54.3emu·g-1)比空白磁珠的最大饱和磁化程度(79.4emu·g-1)小一些，因为在键合磁珠表面有酪氨酸酶包覆。
磁珠表面键合蛋白的定量结果：通过磁珠的数量不同，来确定酪氨酸酶结合疗效与酪氨酸酶恒定量的最优比例。如图1所示，恒定酪氨酸酶的量为100μg，125μl磁珠键合率最高，达到99％。
磁珠的红外光谱图，酪氨酸酶的红外光谱图和酪氨酸酶键合磁珠的红外光谱图分析表明：酪氨酸酶与磁珠键合后在1653cm-1出现的新的酰胺带，说明通过酰胺键连接产生共轭。
以上结果说明本发明得到的酪氨酸酶键合磁珠符合要求。
实施例2基于磁珠分离的抗黑色素生成的药物筛选方法的各因素研究
(1)以芍药苷为模型药物，对变性洗脱溶剂进行优化
取取以上实施例1制备得到的20μL酪氨酸酶键合磁珠，加入芍药苷对照品溶液20μL(0.1mg/ml)和160μLPBS缓冲液(pH7.4)混合，孵育30min，孵育完成后，用200μL PBS缓冲液清洗4次，洗脱液进液相分析，最后，分别以体积浓度10％、30％、50％、70％和90％乙腈-水溶液(v/v)及体积浓度10％、30％、50％、70％和90％甲醇-水溶液(v/v)进行变性洗脱，取变性洗脱液进行液相分析。
(2)以芍药苷为模型药物，对孵育时间进行优化
取以上实施例1制备得到的20μL酪氨酸酶键合磁珠，加入芍药苷对照品溶液20μL(0.1mg/ml)和160μL PBS缓冲液(pH7.4)混合，在10、20、30、45、60、70、80min后孵育，孵育完成后，用200μL PBS缓冲液清洗4次，再用50％乙腈-水溶液(v/v)进行变性清洗，取变性洗脱液进行液相分析。
(3)以芍药苷为模型药物，使用Box-Behnken实验设计对孵育温度、离子强度、pH同时进行优化。
取实施例1制备得到的20μL酪氨酸酶键合磁珠，加入20μL芍药苷对照品溶液(0.1mg/ml)和160μL PBS缓冲液混合，在不同温度下孵育30min，孵育完成后，用200μL PBS缓冲液清洗4次，再用10％乙腈-水溶液(v/v)进行变性清洗，取变性洗脱液进行液相分析。具体参见表1。.
表1.Box-Behnken实验设计表
(4)各因素筛选结果
(4.1)变性洗脱溶剂优化结果
清洗的目的在于排除没有键合或非特异性的化合物产生的干扰，本发明通过大量实验对不同的清洗次数进行考察，结果表明，先用PBS缓冲液清洗4次可以足够消除未键合的化合物。变性洗脱液可以将键合在磁珠上的酪氨酸酶清洗下来，结果表明，10％(v/v)乙腈—水洗脱溶剂洗脱效率优于其它洗脱溶剂。
(4.2)孵育时间的优化结果
孵育时间考察结果如图2所示，30min的孵育时间后，酪氨酸酶的结合位点已经达到饱和，因此优选孵育时间为30分钟。
(4.3)孵育pH、离子强度和反应温度的3D响应面分析结果
芍药苷和酪氨酸酶键合磁珠的相互作用主要是静电相互作用，离子强度和pH是影响静电相互作用的主要因素。如图3中的A所示，酪氨酸酶的等电点约为4.7，当溶液pH大于酪氨酸酶的等电点，酪氨酸酶键合磁珠表面带负电荷，有利于与带正电荷的芍药苷(pKa11.52±0.70)相互作用。如图3中的B所示，孵育温度超过40℃会减少芍药苷的峰面积。如图3中的C所示，PBS的离子强度在255mM附近，芍药苷峰面积较大。通过3D响应面分析，得到磁珠与酪氨酸酶的键合的最优条件为：温度为34.84℃，离子强度为193.67mM，pH为6.98。
实施例3三白汤成分中抗黑色素生成药物的筛选
(1)取一定体积磁珠，使用等体积的25mM MES缓冲溶液清洗2次，每次次10min，清洗后，加入等体积的50mg/ml EDC溶液和50mg/ml NHS溶液，混合均匀，在室温下缓慢震荡孵育，孵育后，放在磁铁上4min，移除上清液，再使用25mM的MES缓冲溶清洗，得到活化磁珠，备用；
(2)取步骤(1)得到的活化磁珠125μl，加入酪氨酸酶100μg，震荡混合均匀，室温下孵育，孵育后，放在磁珠上4min，移除键合剩下的上清液，得到酪氨酸酶键合磁珠；
(3)称取5g白芍、5g白术、5g白茯苓和3g蜜炙甘草，加入150mL水，回流2h，过滤，滤液蒸干水分得粉末，取粉末配成20mg/mL，在13400rpm下离心10min，吸取上清液，备用。
取上清液20μL，加入步骤(2)制备得到的酪氨酸酶键合磁珠20μL，再加入160μLPBS缓冲液至200μL，放在振荡器上混匀，孵育30min。然后放在磁铁上，使磁珠与溶液分开，吸取溶液为wash1，在磁珠上再加入200μL PBS溶液，重复上述操作，吸取溶液为wash2，第三次清洗的吸取溶液为wash3，第四次清洗的吸取溶液为wash4。最后一次清洗使用含10％乙腈-水溶液，吸取的溶液为wash5，洗脱液进液质联用分析。(液相条件:Kromasil C18柱(4.6mm×150mm，5μm)，流动相A(0.1％甲酸-水)-B(乙腈)，梯度洗脱(0min，5％B；5min，15％B；10min，20％B；20min，25％B；30min，100％B；35min，100％B)，流速0.6mL·min－1，柱温30℃，进样体积5μL。质谱条件:负离子模式，毛细管温度325℃，离子源电压－4.5kV喷雾气压379.21kPa，去簇电压－60V，加热气压379.21kPa，离子源温度550℃，一级质谱扫描范围m/z100-1500，二级质谱激活类型CID)。
(5)本发明建立基于磁性分离的酪氨酸酶抑制活性筛选系统，并用传统的活性筛选方法对筛选结果进行验证，本发明建立的筛选系统的结果确实可信。与传统的基于96孔板的酪氨酸酶抑制剂筛选方法相比，该筛选系统的优点是能够快速的发现活性化合物，并能通过在线液-质联用技术同时获得活性化合物的化学信息，确定了15种酪氨酸酶抑制剂，其中有9种酪氨酸酶抑制剂为首次报道，包括苯甲酰芍药苷、芍药交酯、苯甲酰氧芍药甙、没食子酰芍药苷、氧化芍药苷、芍药内酯苷、芒柄花甙、牡丹皮苷C、丹皮酚新甙，如表2所示。
表2单体成分对酪氨酸酶活性的抑制作用
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (1)

1.一种基于磁珠分离的抗黑色素生成的药物筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)取一定体积磁珠，使用等体积的25mM MES缓冲溶液清洗2～3次，每次10～15min，清洗后，加入等体积的50mg/ml EDC溶液和50mg/ml NHS溶液，混合均匀，在室温下缓慢震荡孵育，孵育后，放在磁铁上4～6min，移除上清液，再使用25mM的MES缓冲溶清洗，得到活化磁珠，备用；
(2)取步骤(1)得到的活化磁珠，加入酪氨酸酶溶液，震荡混合均匀，室温下孵育，孵育后，放在磁珠上4～6min，移除键合剩下的上清液，得到酪氨酸酶键合磁珠；
(3)取芍药苷，加入步骤(3)制备得到的酪氨酸酶键合磁珠，加入PBS缓冲液，放在振荡器上混匀，在34.84℃，离子强度为193.67mM，pH为6.98条件下孵育30min，然后放在磁铁上，使键合磁珠与溶液分开，先用PBS缓冲液清洗4次，再用10％乙腈的水溶液变性洗脱，变性洗脱液进行液质分析；
液质分析的液质参数为ESI负离子模式；
液相条件为:XBridge C18柱，250mm×4.6mm，5μm，流动相A相为0.1％甲酸水–B相为乙腈，梯度洗脱：0min，10％B；10min，15％B；25min，30％B；60min，100％B，流速1.0mL·min-1，柱温30℃，进样体积5μL；质谱条件：负离子模式，毛细管温度325℃，离子源电压-4.5kV，喷雾气压379.21kPa，去簇电压-60V，加热气压379.21kPa，离子源温度550℃，一级质谱扫描范围m/z100-1500，二级质谱激活类型CID。
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