CN102728101B - 一种固相萃取柱及其应用 - Google Patents

一种固相萃取柱及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN102728101B
CN102728101B CN201110087990.3A CN201110087990A CN102728101B CN 102728101 B CN102728101 B CN 102728101B CN 201110087990 A CN201110087990 A CN 201110087990A CN 102728101 B CN102728101 B CN 102728101B
Authority
CN
China
Prior art keywords
solid
methyl alcohol
column
flow velocity
minutes
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201110087990.3A
Other languages
English (en)
Other versions
CN102728101A (zh
Inventor
杨莉
祁萌
王峥涛
耿放
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Shanghai University of Traditional Chinese Medicine
Original Assignee
Shanghai University of Traditional Chinese Medicine
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Shanghai University of Traditional Chinese Medicine filed Critical Shanghai University of Traditional Chinese Medicine
Priority to CN201110087990.3A priority Critical patent/CN102728101B/zh
Publication of CN102728101A publication Critical patent/CN102728101A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN102728101B publication Critical patent/CN102728101B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Landscapes

  • Other Investigation Or Analysis Of Materials By Electrical Means (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)

Abstract

本发明公开了一种固相萃取柱，包括玻璃柱和填料，所述填料为羟丙基葡聚糖凝胶Sephadex LH-20。所述的固相萃取柱可应用于生物样品的前处理，尤其可应用于血清、尿液及组织匀浆中的分子量相近的中、小分子的同时富集及分析检测。本发明的固相萃取柱可以有效排除干扰，保证待测物分析的高灵敏度、强专属性、高准确度，对于生物体代谢组学研究以及疾病的检测具有良好的指导意义。另外，本发明的固相萃取柱可反复使用，几乎不存在死吸附的现象，而且装填容易，操作简单，在生物样品分析中具有较强的应用价值。

Description

一种固相萃取柱及其应用
技术领域
本发明涉及一种固相萃取柱及其应用，具体说，是涉及一种凝胶固相萃取柱及其在生物样品前处理中的应用。
背景技术
由于生物样品的成分复杂，基质干扰严重，因此对生物样品中的内源性物质分析检测，一直被分析工作者所关注。一般所采取的生物样品前处理方法包括有机溶剂沉淀法(OSP)、液液萃取(LLE)、固相萃取(SPE)、固相微萃取(SPME)等。其中固相萃取以其操作简单、回收率高、重复性好、较绿色环保等特点而被广泛应用。
固相萃取根据吸附剂的不同可分为反相固相萃取、正相固相萃取、离子交换固相萃取和吸附固相萃取四种，需要根据所要检测的化合物的性质来选择不同吸附剂的固相萃取柱。固相萃取法，是主要通过固相填料对样品组分的选择性吸附及解吸过程，实现对样品的分离、纯化和富集，其主要目的在于降低样品基质干扰，提高检测灵敏度。为了方便，固相萃取一般使用固相萃取小柱，根据不同的需求有各种规格，常见的有1ml、6ml和10ml。但在具体使用中，这种方法存在如下问题：
1)预装固相萃取柱不可反复使用，使用进口固相萃取柱的成本很高；
2)要根据目标化合物的极性及溶解度选择合适的固相萃取柱和洗脱溶剂，具体洗脱过程需要进行大量前期文献考察和实验摸索；
3)若目标化合物与吸附剂形成共价键，则在洗脱时可能会因与吸附剂死吸附而无法洗脱下来；
4)使用时萃取流速低，影响样品处理效率，需要外界给予一定的压力；
5)无法同时富集分子量大小相似的化合物。
在固相萃取法中最常用的填料是颗粒型硅胶或键合相的硅胶。传统的颗粒型填料为了能实现较高的吸附效率，减少样品的损失，其填料的颗粒较小，而小的颗粒粒度却会引起高的柱压，吸附时间长，因此不能用于快速高效分离和富集。
发明内容
本发明针对上述现有技术所存在的缺陷和问题，提供一种具有操作简单、成本低、灵敏度高、能快速高效分离和富集分子量相近的中、小分子化合物等优点的固相萃取柱及其在生物样品前处理中的应用。
为实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：
一种固相萃取柱，包括玻璃柱和填料，其特征在于：所述填料为羟丙基葡聚糖凝胶Sephadex LH-20。
所述玻璃柱的长径比推荐为1∶1～30∶1，较佳为10∶1～20∶1，最佳为15∶1。
本发明提供的固相萃取柱在生物样品前处理中的应用，主要是起分离和富集分子量相近的中、小分子化合物的作用。
所述的生物样品包括但不仅限于体液和组织匀浆，所述的体液主要是指血清和尿液。
所述的分子量相近的中、小分子化合物主要是指血管紧张素类寡肽化合物、磷脂类化合物、胆汁酸类化合物和氨基酸类化合物。
所述的固相萃取柱在生物样品前处理中的应用，包括如下步骤：
a)制作固相萃取柱；
b)将生物样品溶液注入柱中，待样品溶液全部渗入固定相后，注入萃取液，根据目标分析物选取所要收集的萃取液的体积；
c)浓缩干收集的萃取液中的溶剂；
d)复溶目标物，进行高效液相色谱或高效液相色谱-质谱分离检测。
Sephadex LH-20凝胶的主要分离原理是分子筛，在反相溶剂中兼具反相分配的作用。由于Sephadex LH-20凝胶的分子筛作用，所以分子大的化合物保留弱，先被洗脱下来，分子小的化合物保留强，后被洗脱下来。本发明利用Sephadex LH-20凝胶的这一特性和固相萃取柱的优点，一方面可以分离生物样品中如蛋白质等大分子化合物，排除其干扰，另一方面可富集分子量相近的中、小分子化合物。因此，与现有技术相比，本发明的固相萃取柱可应用于血清、尿液及组织匀浆中的中、小分子的同时富集及分析检测，可以有效排除干扰，保证待测物分析的高灵敏度、强专属性、高准确度，对于生物体代谢组学研究以及疾病的检测具有良好的指导意义。另外，本发明的固相萃取柱可反复使用，几乎不存在死吸附的现象，而且装填容易，操作简单，在生物样品分析中具有较强的应用价值。
附图说明
图1是血清经本发明的固相萃取柱处理得到的血管紧张素类寡肽化合物的分析图谱。
图2是血清经本发明的固相萃取柱处理得到的磷脂类化合物的分析图谱。
图3是肝脏匀浆经本发明的固相萃取柱处理得到的胆汁酸类化合物的分析图谱。
图4是尿液经本发明的固相萃取柱处理得到的氨基酸类化合物的分析图谱。
具体实施方法
下面结合实施例对本发明做进一步详细、完整地说明，但并不限制本发明的内容。
实施例1：利用本发明的固相萃取柱处理血清中的血管紧张素类寡肽
取一个自制空心玻璃柱，长15厘米，内径1.0厘米，填装Sephadex LH-20凝胶，用甲醇不断洗脱，填实，作为固定相。
取血清1ml，加4ml甲醇，立即涡旋混匀，在4℃离心15分钟；取上清液4.5ml，氮气吹干后用0.5ml甲醇溶液复溶，再次在4℃离心15分钟；再取上清液缓慢上样至凝胶固相萃取柱，用甲醇不断洗脱，收集第3～9ml的洗脱流份。
浓缩干甲醇后，用含20mmol/L甲酸铵及0.1％(V∶V)甲酸的水溶液与乙腈按体积比为88∶12混合的溶液150μL复溶，在4℃高速离心(20000转/分钟)15分钟后取上清液，利用超高效液相色谱-质谱联用仪(UPLC-MS)进行分析，分析条件如下：
色谱条件：Waters，Acquity UPLC BEH C18(50×2.1mm)色谱柱，柱温50℃；流动相A为含0.1％(V∶V)甲酸的水溶液，流动相B为乙腈，梯度洗脱；流速为0.5ml/min；检测模式为正离子多反应监测；
质谱条件：采用电喷雾离子源，正离子多反应监测模式进行数据采集，离子源温度为120℃；去溶剂温度为400℃；氮气为去溶剂和锥孔气，流速分别为600L/h和50L/h；氩气为碰撞气，流速为0.15ml/min；毛细管电压为3.0千伏；锥孔电压为40伏；碰撞电压为5电子伏。
分析结果(检测到的峰面积)见表1所示。
表1 血清经不同处理方法得到的血管紧张素类寡肽的分析结果(以峰面积表示)
由表1可见：血清经本发明的固相萃取柱处理与经过有机溶剂蛋白沉淀法或反相固相萃取柱或阴阳离子交换固相萃取柱处理相比较，萃取液中待测物血管紧张素类寡肽的质谱响应明显增加，干扰基质明显减少，检测限范围明显增大，线性相关系数达到0.999以上，且操作简便，萃取液浓缩快速。分析检测得到的详细图谱见图1所示。
实施例2：利用本发明的固相萃取柱处理血清中的磷脂类化合物
取一个自制空心玻璃柱，长15厘米，内径1.0厘米，填装Sephadex LH-20凝胶，用甲醇不断洗脱，填实，作为固定相。
取血清1ml，加4ml甲醇，立即涡旋混匀，在4℃离心15分钟；取上清液4.5ml，氮气吹干后用0.5ml甲醇溶液复溶，再次在4℃离心15分钟；再取上清液缓慢上样至凝胶固相萃取柱，用甲醇不断洗脱，收集第6～10ml的洗脱流份。
浓缩干甲醇后，用含10mmol/L醋酸铵及0.1％(V∶V)甲酸的水溶液与乙腈按体积比为60∶40混合的溶液150μL复溶，在4℃高速离心(20000转/分钟)15分钟后取上清液，利用超高效液相色谱-质谱联用仪(UPLC-MS)进行分析，分析条件如下：
色谱条件：Waters，Acquity UPLC HSS T3(100×2.1mm)色谱柱，柱温50℃；流动相A为含10mmol/L醋酸铵及0.1％(V∶V)甲酸的水溶液与乙腈按体积比为60∶40混合的溶液，流动相B为异丙醇，梯度洗脱；流速为0.3ml/min；检测模式为正离子多反应监测；
质谱条件：采用电喷雾离子源，正离子多反应监测模式进行数据采集，离子源温度为120℃；去溶剂温度为350℃；氮气为去溶剂和锥孔气，流速分别为650L/h和50L/h；氩气为碰撞气，流速为0.15ml/min；毛细管电压为3.4千伏；锥孔电压为35伏；碰撞电压为25电子伏。
分析检测得到的详细图谱见图2所示。
实施例3：利用本发明的固相萃取柱处理肝脏匀浆中的胆汁酸类化合物
取一个自制空心玻璃柱，长15厘米，内径1.0厘米，填装Sephadex LH-20凝胶，用甲醇不断洗脱，填实，作为固定相。
取肝脏0.2mg，加1ml甲醇匀浆，均浆液再加4ml甲醇，立即涡旋混匀，在4℃离心15分钟；取上清液4.5ml，氮气吹干后用0.5ml甲醇溶液复溶，再次在4℃离心15分钟；再取上清液缓慢上样至凝胶固相萃取柱，用甲醇不断洗脱，收集第6～10ml的洗脱流份。
浓缩干甲醇后，用含5mmol/L醋酸铵及0.1％(V∶V)甲酸的水溶液与甲醇按体积比为45∶55混合的溶液150μL复溶，在4℃高速离心(20000转/分钟)15分钟后取上清液，利用超高效液相色谱-质谱联用仪(UPLC-MS)进行分析，分析条件如下：
色谱条件：Waters，Acquity UPLC BEH C18(100×2.1mm)色谱柱，柱温50℃；流动相A为含5mmol/L醋酸铵及0.1％(V∶V)甲酸的水溶液，流动相B为甲醇，梯度洗脱；流速为0.3ml/min；检测模式为负离子选择离子监测；
质谱条件：采用电喷雾离子源，负离子选择离子监测进行数据采集，离子源温度为120℃；去溶剂温度为300℃；氮气为去溶剂和锥孔气，流速分别为500L/h和50L/h；毛细管电压为2.9千伏；锥孔电压为39伏。
分析检测得到的详细图谱见图3所示。
实施例4：利用本发明的固相萃取柱处理尿液中的氨基酸类化合物
取一个自制空心玻璃柱，长15厘米，内径1.0厘米，填装Sephadex LH-20凝胶，用甲醇不断洗脱，填实，作为固定相。
取尿液1ml，加5ml甲醇，立即涡旋混匀，在4℃离心15分钟；取上清液4.5ml，氮气吹干后用0.5ml甲醇溶液复溶，再次在4℃离心15分钟；再取上清液缓慢上样至凝胶固相萃取柱，用甲醇不断洗脱，收集第8～12ml的洗脱流份。
浓缩干甲醇后，用含5mmol/L醋酸铵及0.1％(V∶V)甲酸的水溶液与乙腈按体积比为30∶70混合的溶液150μL复溶，在4℃高速离心(20000转/分钟)15分钟后取上清液，利用超高效液相色谱-质谱联用仪(UPLC-MS)进行分析，分析条件如下：
色谱条件：TOSOH，TSK-GEL AMIDE-80(50×2.0mm)色谱柱，柱温45℃；流动相A为含5mmol/L醋酸铵及0.1％(V∶V)甲酸的水溶液，流动相B为乙腈，梯度洗脱；流速为0.15ml/min；检测模式为正离子多反应监测；
质谱条件：采用电喷雾离子源，正离子多反应监测模式进行数据采集，离子源温度为120℃；去溶剂温度为300℃；氮气为去溶剂和锥孔气，流速分别为500L/h和50L/h；氩气为碰撞气，流速为0.15ml/min；毛细管电压为3.2千伏；锥孔电压为20伏；碰撞电压为15电子伏。
分析检测得到的详细图谱见图4所示。

Claims (2)

1.一种利用固相萃取柱处理血清中的血管紧张素类寡肽的方法，其特征在于：
取一个自制空心玻璃柱：长15厘米、内径1.0厘米，填装Sephadex LH-20凝胶，用甲醇不断洗脱，填实，作为固定相；
取血清1mL，加4mL甲醇，立即涡旋混匀，在4℃离心15分钟；取上清液4.5mL，氮气吹干后用0.5mL甲醇溶液复溶，再次在4℃离心15分钟；再取上清液缓慢上样至凝胶固相萃取柱，用甲醇不断洗脱，收集第3～9mL的洗脱流份；
浓缩干甲醇后，用含20mmol/L甲酸铵及体积百分比为0.1％的甲酸水溶液与乙腈按体积比为88：12形成的混合溶液150μL复溶，在4℃、20000转/分钟离心15分钟后取上清液，利用超高效液相色谱-质谱联用仪进行分析，分析条件如下：
色谱条件：
Waters，Acquity UPLC BEH C18，50×2.1mm色谱柱；
柱温50℃；
流动相A为体积百分比为0.1％的甲酸水溶液，流动相B为乙腈，梯度洗脱；
流速为0.5mL/min；
检测模式为正离子多反应监测；
质谱条件：
采用电喷雾离子源，正离子多反应监测模式进行数据采集，离子源温度为120℃；
去溶剂温度为400℃；
氮气为去溶剂和锥孔气，流速分别为600L/h和50L/h；
氩气为碰撞气，流速为0.15mL/min；
毛细管电压为3.0千伏；
锥孔电压为40伏；
碰撞电压为5电子伏。
2.一种利用固相萃取柱处理血清中的磷脂类化合物的方法，其特征在于：
取一个自制空心玻璃柱：长15厘米、内径1.0厘米，填装Sephadex LH-20凝胶，用甲醇不断洗脱，填实，作为固定相；
取血清1mL，加4mL甲醇，立即涡旋混匀，在4℃离心15分钟；取上清液4.5mL，氮气吹干后用0.5mL甲醇溶液复溶，再次在4℃离心15分钟；再取上清液缓慢上样至凝胶固相萃取柱，用甲醇不断洗脱，收集第6～10mL的洗脱流份；
浓缩干甲醇后，用含10mmol/L醋酸铵及体积百分比为0.1％的甲酸水溶液与乙腈按体积比为60：40形成的混合溶液150μL复溶，在4℃、20000转/分钟离心15分钟后取上清液，利用超高效液相色谱-质谱联用仪进行分析，分析条件如下：
色谱条件：
Waters，Acquity UPLC HSS T3，100×2.1mm色谱柱；
柱温50℃；
流动相A为含10mmol/L醋酸铵及体积百分比为0.1％的甲酸水溶液与乙腈按体积比为60：40形成的混合溶液，流动相B为异丙醇，梯度洗脱；
流速为0.3mL/min；
检测模式为正离子多反应监测；
质谱条件：
采用电喷雾离子源，正离子多反应监测模式进行数据采集，离子源温度为120℃；
去溶剂温度为350℃；
氮气为去溶剂和锥孔气，流速分别为650L/h和50L/h；
氩气为碰撞气，流速为0.15mL/min；
毛细管电压为3.4千伏；
锥孔电压为35伏；
碰撞电压为25电子伏。
CN201110087990.3A 2011-04-08 2011-04-08 一种固相萃取柱及其应用 Active CN102728101B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201110087990.3A CN102728101B (zh) 2011-04-08 2011-04-08 一种固相萃取柱及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201110087990.3A CN102728101B (zh) 2011-04-08 2011-04-08 一种固相萃取柱及其应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN102728101A CN102728101A (zh) 2012-10-17
CN102728101B true CN102728101B (zh) 2015-01-07

Family

ID=46984832

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201110087990.3A Active CN102728101B (zh) 2011-04-08 2011-04-08 一种固相萃取柱及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN102728101B (zh)

Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103613612B (zh) * 2013-11-29 2016-04-27 翁源广业清怡食品科技有限公司 一种高纯度磷脂酰胆碱的制备方法
CN109382079B (zh) * 2017-08-10 2021-05-11 中国石油化工股份有限公司 一种葡聚糖凝胶整体吸附萃取搅拌棒及其制备方法与应用
CN110174469B (zh) * 2019-04-24 2022-04-08 山东省海洋资源与环境研究院 海藻中oa、dtx1和dtx2三种腹泻性贝毒的检测方法
CN111521705B (zh) * 2020-05-05 2021-04-20 大连润生康泰医学检验实验室有限公司 一种血清中胆汁酸的富集方法
CN112574979A (zh) * 2020-12-14 2021-03-30 北京华创精科生物技术有限公司 一种血浆的凝胶处理设备及方法

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1504754A1 (en) * 2002-05-10 2005-02-09 Suntory Limited Gallocatechin gallate-containing composition
CN101348493A (zh) * 2008-09-02 2009-01-21 海南数尔药物研究有限公司 高纯度药物及其制备方法
CN101824071A (zh) * 2006-03-31 2010-09-08 中国农业大学 源自胶原蛋白的抗氧化肽及其用途

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101257330B1 (ko) * 2008-02-06 2013-04-23 바이오콘 리미티드 펩타이드 정제 방법

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1504754A1 (en) * 2002-05-10 2005-02-09 Suntory Limited Gallocatechin gallate-containing composition
CN101824071A (zh) * 2006-03-31 2010-09-08 中国农业大学 源自胶原蛋白的抗氧化肽及其用途
CN101348493A (zh) * 2008-09-02 2009-01-21 海南数尔药物研究有限公司 高纯度药物及其制备方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
蔡根生,牛恩美,唐振华.Sephadex LH20凝胶过滤法分离孕酮受体与DCC法比较.《生殖与避孕》.1985,第5卷(第2期),第1页左栏第3-4段、第3页第2段第13行. *

Also Published As

Publication number Publication date
CN102728101A (zh) 2012-10-17

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN101550207B (zh) 磁性分子印迹聚合物的制备及在复杂样品前处理中的应用
US10317377B2 (en) Monolithic column chromatography
Li et al. Separation and purification of chlorogenic acid by molecularly imprinted polymer monolithic stationary phase
Hu et al. Solid-phase extraction of esculetin from the ash bark of Chinese traditional medicine by using molecularly imprinted polymers
CN1330399C (zh) 基于纳米纤维的固相微萃取器
Zhang et al. Preparation of micropipette tip-based molecularly imprinted monolith for selective micro-solid phase extraction of berberine in plasma and urine samples
CN102728101B (zh) 一种固相萃取柱及其应用
Li et al. Purification of antibiotics from the millet extract using hybrid molecularly imprinted polymers based on deep eutectic solvents
Wang et al. Natural cotton fibers as adsorbent for solid-phase extraction of polycyclic aromatic hydrocarbons in water samples
CN105536746B (zh) 一种固相微萃取胶囊及其在检测饮料中酚类环境雌激素的应用
CN103901129A (zh) 一种磁分离-气相色谱检测十种有机磷农药方法
CN104826598A (zh) 一种新型分离介质磁性羟基葫芦[8]脲的制备及应用
CN104280485A (zh) 一种同步提取和净化土壤中多种氯代多环芳烃的方法
CN104193875B (zh) 己烯雌酚磁性分子印迹聚合物的制备方法及其应用
CN102507297A (zh) 微波辅助索氏固相萃取联用装置、方法及应用
CN106770730A (zh) 一种甲基汞和乙基汞测定方法
Zheng et al. Novel bimodal porous N-(2-aminoethyl)-3-aminopropyltrimethoxysilane-silica monolithic capillary microextraction and its application to the fractionation of aluminum in rainwater and fruit juice by electrothermal vaporization inductively coupled plasma mass spectrometry
CN103301820B (zh) 核-壳型罗丹明b分子印迹固相萃取磁性材料及其制备方法和应用
CN101334386B (zh) 扶正化淤植物药血浆苦杏仁苷的测定方法
Guo et al. Molecularly imprinted solid-phase extraction of matrine from radix Sophorae tonkinensis
Xia et al. An online field-assisted micro-solid-phase extraction device coupled with high-performance liquid chromatography for the direct analysis of solid samples
Guo et al. Preparation of molecularly imprinted adsorptive resin for trapping of ligustrazine from the traditional Chinese herb Ligusticum chuanxiong Hort.
CN207913283U (zh) 苯基键合硅胶固相萃取柱
Zhao et al. Quantitative determination of amphetamine-type stimulants in sewage and urine by hybrid monolithic column solid-phase microextraction coupled with UPLC-QTRAP MS/MS
CN103520955B (zh) 一种分子印迹整体搅拌吸附棒及其制备方法

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant