CN101824071A - 源自胶原蛋白的抗氧化肽及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一系列源自胶原蛋白的抗氧化肽，其具有如下之一的氨基酸序列：(1)Hyl-Cys；(2)Gln-Gly-Ala-Arg；(3)Leu-Gln-Gly-Met；(4)Leu-Gln-Gly-Met-Hyp。该抗氧化肽可以通过多肽仪化学方法合成，也可以通过将胶原蛋白水解，然后将获得的水解产物分离纯化而得。本发明的抗氧化肽的抗氧化作用很强，不仅可以替代BHT等用作食品的添加剂，而且可以作为活性功能性成分。该产品可以用于食品、保健品、化妆品、甚至动物食品和饲料等，应用范围极其广泛，社会效益和经济效益都很显著。本发明的抗氧化肽是2～5个氨基酸的抗氧化肽，分子量小，更易被消化道直接吸收。

Description

源自胶原蛋白的抗氧化肽及其用途

本申请是申请日为2006年3月31日、申请号为200610066895.4、发明名称为“源自胶原蛋白的抗氧化肽及其用途”的发明专利申请的分案申请。

技术领域

本发明涉及一系列源自胶原蛋白的抗氧化肽，和其作为抗氧化剂的用途。

背景技术

丁基羟基茴香醚(BHA)和2，6-二叔丁基对甲酚(BHT)等化学合成的抗氧化剂通常作为食品添加剂用在食品工业上，用于防止食品的氧化变色或者因氧导致的品质劣变。然而这些合成抗氧化剂由于对健康的潜在危害，在食品上的应用越来越受到限制。在最近的二十年里，人们把目光转向来自于动植物的天然的、安全的抗氧化剂。天然抗氧化剂不仅能够防止食品中油脂体系的氧化，而且可以防止人体内自由基的危害，延缓衰老导致的各种退化性疾病，如癌症、冠心病、糖尿病等等。已有一些报道发现蛋白质的水解物具有一定的抗氧化性。例如，在中国专利CN200510009423.0中公开了一系列源自蜂王浆的抗氧化肽，其为通过将蜂王浆用胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶进行酶处理，可以获得具有和维生素E同等程度的强抗氧化能力的抗氧化肽。但是这类天然抗氧化剂的原料来源非常有限，不利于它的广泛使用。

在文献1：《生物化学和分子生物学杂志》(2001)中，描述了采用系列酶解法，顺序添加碱性蛋白酶(Alcalase)、链霉蛋白酶E(pronase E)和胶原酶(collagenase)，在一个三步法循环膜反应器中进行水解，从牛皮中分离出三个含有9或10个氨基酸残基的抗氧化肽PI(Gly-Glu-Hyp-Gly-Pro-Hyp-Gly-Ala-Hyp)，PII(Gly-Pro-Hyp-Gly-Pro-Hyp-Gly-Pro-Hyp-Gly)和PIII(Gly-Pro-Hyp-Gly-Pro-Hyp-Gly-Pro-Hyp)。在文献2：J.Agric.FoodChem.2001，49，1984～1989中，公开了采用同样的系列酶解法，从阿拉斯加鳕鱼鱼皮中水解、分离出两个含有16和13个氨基酸残基的抗氧化肽P1(Gly-Glu-Hyp-Gly-Pro-Hyp-Gly-Pro-Hyp-Gly-Pro-Hyp-Gly-Pro-Hyp-Gly)和P2(Gly-Pro-Hyp-Gly-Pro-Hyp-Gly-Pro-Hyp-Gly-Pro-Hyp-Gly)。但是这些分离出的抗氧化肽的氨基酸残基的分子量比较大，在胃肠道中容易被消化系统的胃蛋白酶、胰蛋白酶及小肠蛋白酶进一步水解，失去抗氧化活性。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术分离的天然抗氧化剂(抗氧化肽)的氨基酸残基的分子量比较大，在胃肠道中容易被消化系统的胃蛋白酶、胰蛋白酶及小肠蛋白酶进一步水解，失去抗氧化活性的缺陷，从而提供一系列分子量小、抗氧化性活性较高的源自胶原蛋白的抗氧化肽，和其作为抗氧化剂的用途。

本发明的目的是通过如下的技术方案实现的：

本发明提供一系列源自胶原蛋白的抗氧化肽，其具有如下之一的氨基酸序列：

(1)Hyl-Cys

(2)Gln-Gly-Ala-Arg

(3)Leu-Gln-Gly-Met

(4)Leu-Gln-Gly-Met-Hyp

本发明提供的上述源自胶原蛋白的抗氧化肽可以通过多肽仪化学方法合成，也可以通过将胶原蛋白水解，然后将获得的水解产物分离纯化而得。

本发明提供的上述源自胶原蛋白的抗氧化肽可通过如下的方法水解得到：

1)使用蛋白酶对胶原蛋白进行一次或连续几次的水解，得到含有多种抗氧化肽的混合物的前制品；

使用蛋白酶对胶原蛋白进行水解的条件视蛋白酶的活力和种类而定，以便生成足够量的抗氧化肽，具体步骤为：在20～45℃(优选25～37℃)，将胶原蛋白与水混合，使得胶原蛋白在混合液中的重量百分比为2～8wt％，用盐酸或氢氧化钠调节胶原蛋白水溶液的pH值至2.0～8.0，然后加入蛋白酶，进行水解反应24～72小时(优选36～48小时)，最后对混合液进行预处理以停止酶解反应；

所述的水优选纯净水、去离子水、或蒸馏水；

所述的胶原蛋白和蛋白酶的重量比为50～2500∶1；

所述的胶原蛋白可以是任何来源的胶原蛋白，优选使用猪、牛、鸡、鱼的胶原蛋白的提取物、粗制品、明胶等各种形式的制品；

所述的蛋白酶可以采用任何能从底物产生抗氧化肽的蛋白酶；所述的蛋白酶为来自动物、植物、微生物等任意的生物的肽键水解酶，例如胃蛋白酶(pepsin)、胰蛋白酶(trypsin)、牛胰腺蛋白酶(protease from bovinepancreas)、碱性蛋白酶(Alcalase)、胶原酶(collagenase)、木瓜蛋白酶(papain)，以及来源于微生物的蛋白酶类，如链霉蛋白酶E(pronase E)、来自链霉菌的蛋白酶(protease from Streptomyces)，以及来自多黏芽胞杆菌的蛋白酶(protease from Bacillus polymyxa)等；其中优选胰蛋白酶或链霉蛋白酶；这些蛋白酶可以单独地或混合使用，以便缩短水解时间，或在终产品中得到较好的口感；

所述的预处理为采用加热或调节pH的方法来钝化蛋白酶，例如，在90℃加热5分钟，然后煮沸后再保持3分钟；

2)将步骤1)得到的含有多种抗氧化肽形成的肽的混合物的前制品进行沉淀或过滤，得到除去脂肪和大分子蛋白、多肽和杂质等的水解液；

例如：调节前制品混合液的pH至中性，然后高速离心(例如20,000×g，10分钟)，弃去下部的沉淀，分出上清液；

或是采用醇沉法，加入4～6倍于前制品体积的乙醇，然后采用离心和过滤方法，滤去沉淀的蛋白，分出滤液；

或是采用超滤法，选择截流分子量为1000的超滤膜，将所有分子量大于超滤膜截流分子量的肽留在膜上，分离出下层的清液；

3)将步骤2)得到的抗氧化肽的混合物进行分离纯化和鉴定；

将水解液进行微过滤，滤去分子量小于200的分子，得到干物质含量为20～40wt％的混合液；

然后使用凝胶过滤色谱柱(如Sephadex LH-20，Sephadex G-25)进行分离纯化，采用去离子水或是20～50mM磷酸钠缓冲溶液作为流动相，混合物中的肽依次洗脱出来，测定各吸收峰对应的洗脱液的抗氧化活性，分别收集抗氧化活性高于50％的组分，然后用冻干机冻干成粉状；

将上述活性组分的冻干粉用0.5M tris-HCl缓冲液(pH 8.3)溶解，上样到用该缓冲液平衡后的DEAE-Sephadex A-25(Cl-型，Sigma)色谱柱上进行分离纯化(缓冲液还可采用磷酸钠或醋酸铵缓冲液)，用缓冲液平衡和洗涤色谱柱，首先分离出来的将是未被吸附的肽；然后用NaCl溶液(0.5～1.0M)从0至0.5～1.0M进行梯度洗脱；混合物中的肽按酸碱性的强弱被流动相依次洗脱下来，测定各吸收峰对应的洗脱液的抗氧化活性，如图2所示，分别收集抗氧化活性最高的组分D和次高的组分A，然后冻干；

4)将步骤3)得到的组分用高效液相色谱(HPLC)进一步提纯；

将步骤3)得到的抗氧化活性高的2种组分合并后进一步用反相HPLC分离，用HPLC分离时，使用ODS柱(YMC ODS-AQ S-5

，4.6×250mm，USA)，上样量为20μL，采用含0.1％三氟酸(TFA)的乙腈溶液线性洗脱，215nm下检测肽的出峰位置，测定各吸收峰对应的洗脱液的抗氧化活性，收集含抗氧化活性最高的组分，冻干，用含0.05％三氟酸溶解，再次用HPLC进行分离，分离得到纯的活性组分；使用液相色谱-质谱连用法(HPLC-MS)测定肽的分子量，用一前一后色谱(MS/MS)和氨基酸序列分析仪鉴定肽的氨基酸序列，查找已发表的有关胶原蛋白的氨基酸序列，进一步验证此抗氧化肽的氨基酸序列。

按照以上分离/鉴定方法，本发明共得到了四个抗氧化肽序列，如表1所示。

表1本发明鉴定的四个抗氧化肽序列

^a.胶原蛋白的α1链上的氨基酸序列，数据来自于老鼠皮(氨基酸残基1-402)和牛皮(氨基酸残基403-1011)(Hulmes et al.，1973)。

^b.Hyl-Cys在胶原蛋白的数据库中没有找到。

分别采用DPPH法测定本发明的源自胶原蛋白的4个抗氧化肽的自由基清除能力，采用铁离子络合法测定4个抗氧化肽金属络合能力，以及测定4个抗氧化肽在亚油酸脂质过氧化体系中的抗氧化能力，这些方法都是常规的检测方法，具体步骤如下：

1.用DPPH测定抗氧化肽的自由基清除能力(Bersuder et al.，1998)

取待测样品500μL，加入500μL 99.5wt％乙醇，和125μL含0.02wt％DPPH(1，1-二苯基三硝基苯肼)的乙醇溶液。混匀后在室温下避光静置60min，测定517nm下的吸光值。根据以下公式计算自由基清除能力，其中，以去离子水替代试样，所测的吸光度作为对照，以99.5wt％的乙醇替代DPPH溶液，所测吸光度作为空白。

2.金属络合能力的测定

采用铁离子络合法测定抗氧化肽的金属络合能力(Chung et al.，2002)。取待测样品800μL，加入10μL 2mM FeCl₂溶液和20μL 5mM显色剂ferrozine，混匀后在室温下静置10分钟，测定562nm下的吸光度。以去离子水替代试样，所测的吸光度作为对照，按下式计算金属络合能力。

3.测定亚油酸脂质过氧化体系中的抗氧化能力(Mendis et al.，2005)

在玻璃管中加入1.5mL 0.1M磷酸钠缓冲溶液(pH 7.0)和1.5mL 50mM亚麻酸的乙醇溶液，混合均匀后，加入2.0mL待测样品(pH 7.0)。2.0mMBHT(2，6-二叔丁基对甲酚)的甲醇溶液作为参照替代试样测定抗氧化能力。为促进油脂体系的氧化，将整个体系放在60℃的恒温箱中48小时(避光)。对于加热前和加热后的反应液的过氧化脂质通过硫氰化铁法进行测定(Osawa and Namiki，1981)。向100μL混合液中加入75wt％乙醇4.5mL，然后添加30％硫氰酸铵水溶液100μL，1.0N盐酸200μL和20mM氯化亚铁溶液(溶解在3.5％盐酸中)100μL。5分钟后测定500nm下的吸光度。

由上述方法的结果可知，本发明的源自胶原蛋白的4个抗氧化肽在这三种体系中都具有很高的抗氧化性。

本发明提供的上述源自胶原蛋白的抗氧化肽具有抗氧化作用，可以作为抗氧化剂，用于保健品、食品添加剂、营养强化剂、动物用添加剂、化妆品、日化用品等。

用于保健品时，该抗氧化肽可以添加到由活性氧引起的各种疾病的预防及治疗用的食品中，可以以口服的形式，也可以使用针剂的形式。还可以作为功能性配料添加到饮料、调味品(如酱油)及其他动植物类食品中。

用作营养强化剂时，例如作为配料添加，以口服液、片剂或颗粒状等形式摄取。

用作食品添加剂时可以添加到对氧、光不稳定的食品中，作为抗氧化剂或稳定剂使用。

用作动物用添加剂时，例如添加到饲料中或宠物食品配方中，既可以作为抗氧化剂或稳定剂使用，也可以作为动物的营养强化剂使用。

用作化妆品时，例如适用于洗剂、化妆水、乳状液、口红、霜剂、凝胶、面膜、粉底霜等主要用于皮肤或粘膜等物质。

用作日化用品时，例如用于护齿、护肤、护发、洗涤用剂等。

与现有技术相比，本发明的优点在于：

1)本发明提供的源自胶原蛋白的抗氧化肽的抗氧化作用很强，不仅可以替代BHT等用作食品的添加剂，而且可以作为活性功能性成分。该产品可以用于食品、保健品、化妆品、甚至动物食品和饲料等，应用范围极其广泛，社会效益和经济效益都很显著。

2)本发明提供的源自胶原蛋白的抗氧化肽是2～5个氨基酸的抗氧化肽，分子量小，更易被消化道直接吸收。

附图说明

图1为实施例2中采用Sephadex LH-20色谱层析柱分离抗氧化肽洗脱液的紫外吸收谱图(A)及各吸收峰对应的洗脱液的自由基清除能力谱图(B)；

图2为实施例2中采用DEAE-Sephadex A-25色谱层析柱继续分离纯化图1中组分P4的紫外吸收谱图(A)及各吸收峰对应的洗脱液的自由基清除能力谱图(B)；

图3为实施例2中用反相HPLC进一步分离图2中的组分A得到的紫外吸收谱图(A)及各吸收峰对应的洗脱液的自由基清除能力谱图(B)，标记为RSP的色谱峰抗氧化活性最强；

图4为图3中组分RSP的质谱图，其分子量M+1为430.9098；

图5为图4中的抗氧化肽(M+1＝430.9098)的质谱/质谱图；

图6为图3中所示含抗氧化活性次高的组分的质谱/质谱图，其分子量为265.2。

具体实施方式

实施例1、用蛋白酶将胶原蛋白水解得到的抗氧化肽混合物的抗氧化能力的测试

在37℃，将猪皮的胶原蛋白粉与纯净水混合，使得胶原蛋白在混合液中的重量百分比为5wt％，用6N的盐酸调节胶原蛋白的pH值至2.0，然后加入胃蛋白酶(pepsin)(胶原蛋白和蛋白酶的重量比为2500∶1，进行水解反应24小时；水解结束时，将水解产物在90℃加热5分钟，然后煮沸后再保持3分钟，停止酶解反应。

然后，在此基础上用链霉蛋白酶和牛胰蛋白酶继续进行混合酶解：调节上述胃蛋白酶水解产物的pH值为7.5，酶(链霉蛋白酶和牛胰蛋白酶的重量比为1∶1)与底物的比为2/125，水解温度37℃，水解时间24小时，水解结束时，将水解产物煮沸3分钟灭酶，得到含有多种抗氧化肽形成的肽的混合物的前制品。

采用超滤法，将上述含有多种抗氧化肽形成的肽的混合物的前制品进行过滤，选择截流分子量为1000的超滤膜，将所有分子量大于超滤膜截流分子量的肽留在膜上，分出下层的清液，得到除去脂肪和大分子蛋白、多肽和杂质等的水解液，然后冻干。经前述方法鉴定，该冻干粉的主要成分为含有上述四个抗氧化肽的2～6个氨基酸抗氧化肽混合物。

将该冻干粉配制成1％的水溶液，测定其抗氧化性。自由基清除能力高达90％，超过20mM BHT的自由基清除能力(84％)。金属络合能力达60％，(参照1.0mM EDTA为91％)。在亚油酸脂质过氧化体系中的抗氧化能力为77％，高于同样条件下20mM BHT的抗氧化性(60％)。

实施例2、进一步分离鉴定本发明的4个抗氧化肽

将实施例1中得到的冻干粉用少量去离子水溶解，用凝胶过滤色谱柱Sephadex LH-20(2.5×80cm)进行分离，以去离子水作为流动相，混合物中的肽依次洗脱出来，在254nm下检测肽的浓度，如图1(A)所示，测定各吸收峰对应的洗脱液的抗氧化活性，如图1(B)所示，收集抗氧化活性高于50％的组分P4，然后用冻干机冻干成粉状。

将组分P4的冻干粉用0.5M tris-HCl缓冲液(pH 8.3)溶解，上样到用该缓冲液平衡后的DEAE-Sephadex A-25(Cl-型，Sigma，2.0×35cm)色谱柱上进行分离纯化。用0.5M tris-HCl缓冲液平衡和洗涤色谱柱，首先分离出来的将是未被吸附的肽；然后用NaCl溶液(0.5～1.0M)从0至0.5M进行梯度洗脱；混合物中的肽按酸碱性的强弱被流动相依次洗脱下来，在254nm下检测肽的浓度，如图2(A)所示，测定各吸收峰对应的洗脱液的抗氧化活性如图2(B)所示，分别收集抗氧化活性最高的组分D和次高的组分A，然后冻干。

将组分A进一步用反相高效液相色谱HPLC分离纯化。用HPLC分离时，使用ODS柱(YMC ODS-AQ S-5

，4.6×250mm，USA)。上样量为20μL，采用含0.1％三氟酸(TFA)的乙腈溶液线性洗脱(乙腈从0 to60％)，流速为0.9mL/min，洗脱时间30分钟，215nm下检测肽的出峰位置，如图3(A)所示，测定各吸收峰对应的洗脱液的抗氧化活性，如图3(B)所示，收集含抗氧化活性最高的组分，即图3(B)中标记为RSP的组分，冻干，用含0.05％三氟酸溶解，再次用HPLC进行分离，采用含0.05％三氟酸(TFA)的乙腈溶液线性洗脱(乙腈从0 to 30％)，流速为0.8mL/min，洗脱时间30分钟。分离得到纯的抗氧化活性组分后，使用液相色谱-质谱连用法(HPLC-MS)测定肽的分子量为429.91(M+1为430.9098，如图4所示)。用一前一后色谱(MS/MS)和氨基酸序列分析仪鉴定肽的氨基酸序列，鉴定出抗氧化肽的氨基酸序列为Gln-Gly-Ala-Arg(如图5所示)。查找已发表的有关胶原蛋白的氨基酸序列，胶原蛋白的α1链上72-75或180-183片断，从而进一步验证了此抗氧化肽来源于胶原蛋白。

收集图3(A)所示含抗氧化活性次高的组分。冻干，用含0.05％三氟酸溶解，再次用HPLC进行分离。使用液相色谱-质谱连用法(HPLC-MS)测定肽的分子量为265.1，用一前一后色谱(MS/MS)和氨基酸序列分析仪鉴定肽的氨基酸序列，鉴定出抗氧化肽的氨基酸序列为Hyl-Cys，如图6所示。

采用同样的方法将组分D分离纯化。分离得到2个抗氧化活性组分。用一前一后色谱(MS/MS)和氨基酸序列分析仪鉴定肽的氨基酸序列，鉴定出抗氧化肽的氨基酸序列为Leu-Gln-Gly-Met(分子量447.2)和Leu-Gln-Gly-Met-Hyp(分子量560.3)。

实施例3、使用本发明的抗氧化肽作为抗氧化剂添加到酱油中酱油生产配方(重量比)如下：

A  生酱油，5％，主料；

B  焦糖色素，按生产需要(0.05％左右)；

C  味精及[I+G]，两者按重量比35～45∶1混合，0.6％～0.7％；

D  胶原蛋白源抗氧化肽，添加0.5％，可同时作营养强化剂和助鲜剂，提高产品氨基酸含量，增加鲜味；

E  乳酸，0.05％，风味剂，增加口感，提高营养；

F  甘草，0.008％，甜味剂，甜度为蔗糖200倍；

I  氯化钠和氯化钾，按生产需要(2-3％)，成味剂；

K  尼泊金乙酯或丙酯，0.01～0.03％，防腐剂，延长产品保质期。

胶原蛋白源抗氧化肽，可同时作营养强化剂和助鲜剂，既增加了常用调味料酱油的抗氧化功能，又提高产品蛋白质含量，此外还可以增加鲜味。可作为绿色、安全、健康的多功能食品配料。

实施例4、使用本发明的抗氧化肽作为抗氧化剂添加到化妆水中

化妆水(按重量份百分比)配方如下：

甘油                                    4％

1，3-丁二醇                            3.0％

聚乙二醇400                            5.0％

抗氧化肽(可混合，也可使用单一成分)     0.5-1％

香精，防腐剂，适量

余量为去离子水

抗氧化肽可被皮肤迅速吸收，主要起清除自由基、防止黄褐斑等作用。

实施例5、使用本发明的抗氧化肽作为抗氧化剂添加到狗食中

狗食配方如下：以鸡胸肉(49wt％)、大豆粉(27wt％)、精制面粉(24wt％)组成的混合物为基料，添加占基料重量6wt％的白砂糖，1-2wt％的胶原蛋白抗氧化肽溶液，添加0.5wt％的食盐以突出风味，再加入2wt％的复合膨松剂(小苏打40wt％，烧明矾52wt％，轻质碳酸钙3wt％，淀粉5wt％)进行挤压膨化。

胶原蛋白抗氧化肽溶液作为新一代饲料用营养补充剂：既能作为运输钙、铁、锌等微量元素的载体，提高微量元素的肠吸收效率和生物利用度，又能作为天然抗氧化剂起到清除体内自由基的作用。活性肽溶液本身还可迅速补充动物蛋白营养，促进生长以及增强动物的免疫力等。

实施例6、使用本发明的抗氧化肽作为抗氧化剂添加到沐浴露中

沐浴露(按重量份百分比)配方如下：

单十二烷基磷酸酯钾盐(Map-K)        12

甜菜碱5’烷基葡糖苷A PG-2000       3.5

烷基醇酰胺                         2.0

棕榈酸异丙酯                       4.5

十八醇                             0.8

胶原蛋白抗氧化肽液(20％)           10

柠檬酸                             适量

硬脂酸乙二醇双酯                   1.2

CY-1防腐剂                         适量

香精                               适量

去离子水                           余量

抗氧化肽可被皮肤迅速吸收，主要起清除自由基、补充胶原蛋白等作用。

Claims (11)

1.一种抗氧化肽，其氨基酸序列为Leu-Gln-Gly-Met或Leu-Gln-Gly-Met-Hyp。

2.如权利要求1所述的抗氧化肽，其源自胶原蛋白。

3.如权利要求1所述的抗氧化肽，其为通过多肽仪化学方法合成；或是通过将胶原蛋白水解，然后将获得的水解产物分离纯化而得。

4.如权利要求1或2所述的抗氧化肽，其特征在于，所述的抗氧化肽是通过如下的方法水解得到：

1)使用蛋白酶对胶原蛋白进行一次或连续几次的水解，得到含有多种抗氧化肽的混合物的前制品；

2)将步骤1)得到的含有多种抗氧化肽形成的肽的混合物的前制品进行沉淀或过滤，得到除去脂肪和大分子蛋白、多肽和杂质等的水解液；

3)将步骤2)得到的抗氧化肽的混合物进行分离纯化和鉴定；

优选地，将水解液进行微过滤，滤去分子量小于200的分子，得到干物质含量为20～40wt％的混合液；

然后使用凝胶过滤色谱柱进行分离纯化，采用去离子水或是20～50mM磷酸钠缓冲溶液作为流动相，混合物中的肽依次洗脱出来，测定各吸收峰对应的洗脱液的抗氧化活性，分别收集抗氧化活性高于50％的组分，然后用冻干机冻干成粉状；

将上述活性组分的冻干粉用0.5M tris-HCl缓冲液溶解，上样到用该缓冲液平衡后的DEAE-Sephadex A-25色谱柱上进行分离纯化，用缓冲液平衡和洗涤色谱柱，首先分离出来的将是未被吸附的肽；然后用NaCl溶液从0至0.5～1.0M进行梯度洗脱；混合物中的肽按酸碱性的强弱被流动相依次洗脱下来，测定各吸收峰对应的洗脱液的抗氧化活性，分别收集抗氧化活性最高的组分和次高的组分，然后冻干；

4)将步骤3)得到的组分用高效液相色谱进一步提纯；

优选地，将步骤3)得到的抗氧化活性高的2种组分合并后进一步用反相HPLC分离，用HPLC分离时，使用ODS柱，上样量为20μL，采用含0.1％三氟酸的乙腈溶液线性洗脱，215nm下检测肽的出峰位置，测定各吸收峰对应的洗脱液的抗氧化活性，收集含抗氧化活性最高的组分，冻干，用含0.05％三氟酸溶解，再次用HPLC进行分离，分离得到纯的活性组分；使用液相色谱-质谱连用法测定肽的分子量，用一前一后色谱和氨基酸序列分析仪鉴定肽的氨基酸序列，查找已发表的有关胶原蛋白的氨基酸序列，进一步验证此抗氧化肽的氨基酸序列。

5.权利要求1或2所述的抗氧化肽作为抗氧化剂在制备保健品、食品添加剂、营养强化剂、动物用添加剂、化妆品或日化用品中的应用。

6.权利要求1或2所述的抗氧化肽在制备保健品中的应用，该抗氧化肽以口服或针剂的形式添加到由活性氧引起的各种疾病的预防及治疗用的食品中，或是作为功能性配料添加到饮料、调味品及其他动植物类食品中。

7.权利要求1或2所述的抗氧化肽在制备营养强化剂中的应用。

8.权利要求1或2所述的抗氧化肽在制备食品添加剂中的应用。

9.权利要求1或2所述的抗氧化肽在制备动物用添加剂中的应用，该抗氧化肽添加到饲料中或宠物食品配方中，作为抗氧化剂或稳定剂使用或是作为动物的营养强化剂使用。

10.权利要求1或2所述的抗氧化肽在制备化妆品中的应用。

11.权利要求1或2所述的抗氧化肽在制备日化用品中的应用。

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