KR102208853B1 - 주름개선 효능을 갖는 펩티드 - Google Patents

Abstract

본 발명은 우수한 주름개선 효능을 갖는 펩티드를 포함하는 약학적 조성물, 화장료 조성물 및 건강기능식품에 관한 것이다.

Description

주름개선 효능을 갖는 펩티드{Peptide having wrinkle-improving effect}

본 발명은 우수한 주름개선 효능을 갖는 펩티드를 포함하는 약학적 조성물, 화장료 조성물 및 건강기능식품에 관한 것이다.

주름개선을 포함한 항노화 화장품의 개발은 고령화 인구의 증가로 인한 다양한 소비자층의 확대와 미용 및 의료기술의 발전, 건강하고 아름다운 피부를 원하는 소비자들의 관심 증가 등으로 인해 화장품업계의 주요 관심분야가 되었다. 최근 여성의 사회 진출 및 고학력화에 따른 소득의 증가로 화장품의 수요가 증가 추세일 뿐만 아니라 스트레스, 환경오염 등으로 인한 피부 노화로 인해 20대 후반이나 30대 초반부터 주름을 관리하는 이른바 '초기주름 개선 상품'의 시장이 커지고 있다.

피부 노화의 대표 증상은 주름살이며 아직까지 그 발생에 대한 정확한 기전은 규명되지 않고 있으며 피부에 존재하는 교원질, 탄력섬유 등 기질단백질의 손상이 주름살의 주원인으로 작용하고 있다. 또한, 피부는 신체의 가장 외벽층으로 외부 자극에 의한 산화적 스트레스를 가장 많이 받는 조직중의 하나인데, 자외선, 약물, 환경오염물질과 같은 여러 가지 외부요인은 피부에 활성산소의 발생을 증가시키고 세포막의 불포화지방산과 결합하여 산화적 손상을 유발하며 피부에서 발생되는 산화적 스트레스는 주름살의 주요 인자로 알려져 있다. 피부의 노화로서 생겨나는 주름 중, 작은 주름은 피부의 표피와 진피 상층부의 형태가 관여하고, 크고 깊은 주름과 늘어짐은 기본적으로 진피의 노화 즉, 콜라겐과 엘라스틴의 질적, 양적변화가 원인이라고 여겨진다.

주름 개선 기능성 화장품의 원료로는 주름 개선에 도움을 주는 것으로 고시된 성분인 레티놀 및 아데노신 등이 사용되었지만, 주로 특정 항산화 성분 하나에 초점을 둔 제품으로, 이들은 피부 트러블을 일으킬 수 있을 뿐만 아니라 괄목할 만한 효능을 기대하기 어렵다는 문제점을 가진다.

한국등록특허 0553174호

본 발명은 우수한 주름개선 효능을 갖는 펩티드를 포함하는 약학적 조성물, 화장료 조성물 및 건강기능식품을 제공함에 그 목적이 있다.

1. 서열번호 1의 서열로 이루어진 펩티드를 포함하는 주름 개선용 약학적 조성물.

2. 서열번호 1의 서열로 이루어진 펩티드를 포함하는 주름 개선용 화장료 조성물.

3. 서열번호 1의 서열로 이루어진 펩티드를 포함하는 주름 개선용 건강기능식품.

본 발명의 펩티드는 주름개선 효능이 매우 우수하여, 약학적 조성물, 화장료 조성물 및 건강기능식품 내 포함되어 현저한 주름개선 효능을 사용자에 제공할 수 있다.

도 1은 본 발명 펩티드의 세포독성을 나타낸 도 이다.
도 2는 본 발명 펩티드를 인간섬유아세포에 처리시 상등액 내 procollagen type-1의 생성량을 나타낸 도 이다.
도 3은 본 발명 펩티드를 인간섬유아세포에 처리시 세포 내 procollagen type-1의 생성량을 나타낸 도 이다.
도 4는 본 발명 펩티드를 인간섬유아세포에 처리시 상등액 내 MMP-1 생성량을 나타낸 도 이다.
도 5 내지 11은 3주 동안 서열번호 1의 서열로 이루어진 펩티드를 마우스에 경구투여한 경우, 그 효과를 사진, 모사판 이미지, 모사판 정량분석 결과를 나타낸 것이다.
도 12 내지 18은 6주 동안 서열번호 1의 서열로 이루어진 펩티드를 마우스에 경구투여한 경우, 그 효과를 사진, 모사판 이미지, 모사판 정량분석 결과를 나타낸 것이다.
도 19 내지 25은 9주 동안 서열번호 1의 서열로 이루어진 펩티드를 마우스에 경구투여한 경우, 그 효과를 사진, 모사판 이미지, 모사판 정량분석 결과를 나타낸 것이다.
도 26, 27은 각각 H&E 염색, Masson's trichrome 염색을 통해 피부조직의 주름 개선 효능을 확인한 것이다.
도 28, 29는 각각 H&E 염색, Masson's trichrome 염색을 통해 피부조직의 주름 개선 효능을 정량적으로 분석한 것이다.
도 30 내지 35는 9주 후 등 조직을 분리하여 RT-qPCR을 통해 Procollagen type-1, MMP-1, MMP-2, MMP-3, MMP-9 및 TIMP-1의 발현량을 정량적으로 분석한 것이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

이하, 본 발명의 서열번호 1의 서열로 이루어진 펩티드는 '본 발명의 펩티드'로 약칭될 수 있고, 당업계 통상의 기술자의 입장에서, 명세서의 전체적 기재를 참조하여 어떠한 펩티드를 특정하는 것인지 충분히 확인할 수 있음은 자명하다.

본 발명의 펩티드는 주름 개선 효능이 우수하다. 예를 들면 콜라겐 생성을 촉진하고, 노화 유전자를 억제할 수 있다. 이에, 화장료 조성물, 약학적 조성물 또는 건강기능식품에 포함되어 우수한 주름 개선 효능을 나타낼 수 있다.

본 발명의 펩티드는 화학적으로 합성할 수 있다. 화학적으로 합성하여 제조하는 경우, 당 분야에 널리 공지된 화학적 합성(Creighton, Proteins; Structures and Molecular Principles, W. H. Freeman and Co., NY, 1983)에 의해 제조될 수 있다. 대표적인 방법으로서 액체 또는 고체상 합성, 단편 응축, F-MOC 또는 T-BOC 화학법이 있으나, 이에 제한되지 않는다. (Chemical Approaches to the Synthesis of Peptides and Proteins, Williams et al., Eds., CRC Press, Boca Raton Florida, 1997; A Practical Approach, Atherton & Sheppard, Eds., IRL Press, Oxford, England, 1989).

또한, 본 발명의 펩티드는 유전공학적 방법에 의해 제조될 수 있으나, 하기의 방법에 제한되지 않는다. 우선, 통상적인 방법에 따라 상기 펩티드를 코딩하는 DNA 서열을 제작한다. DNA 서열은 적절한 프라이머를 사용하여 PCR 증폭함으로써 제작할 수 있다. 다른 방법으로 당업계에 공지된 표준 방법에 의해, 예컨대, 자동 DNA 합성기(예를 들면, Biosearch 또는 Applied iosystems사에서 판매하는 것)를 사용하여 DNA 서열을 합성할 수도 있다. 제작된 DNA 서열은 이 DNA 서열에 작동 가능하게 연결되어 그 DNA 서열의 발현을 조절하는 하나 또는 그 이상의 발현 조절 서열 (예: 프로모터, 인핸서 등)을 포함하는 벡터에 삽입시키고, 이로부터 형성된 재조합 발현 벡터로 숙주세포를 형질전환시킨다. 생성된 형질전환체를 상기 DNA 서열이 발현되도록 하기에 적절한 배지 및 조건 하에서 배양하여, 배양물로부터 상기 DNA 서열에 의해 코딩된 실질적으로 순수한 펩티드를 회수한다. 상기 회수는 당업계에 공지된 방법(예컨대, 크로마토그래피)을 이용하여 수행할 수 있다. 상기에서 '실질적으로 순수한 펩티드'라 함은 본 발명에 따른 펩티드가 숙주로부터 유래된 어떠한 다른 단백질도 실질적으로 포함하지 않는 것을 의미한다. 본 발명의 펩티드 합성을 위한 유전공학적 방법은 다음의 문헌을 참고할 수 있다: Maniatis et al., MolecularCloning; A laboratory Manual, Cold Spring Harbor laboratory, 1982; Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, ColdSpring Harbor Press, N.Y., Second(1998) and Third(2000) Edition; Gene Expression Technology, Method in Enzymology, Genetics and Molecular Biology, Method in Enzymology, Guthrie & Fink (eds.), Academic Press, San Diego, Calif, 1991; 및 Hitzeman et al., J.Biol. Chem., 255:12073-12080, 1990.

본 발명은 서열번호 1의 서열로 이루어진 펩티드를 포함하는 주름 개선용 약학적 조성물을 제공한다.

상기 펩티드를 포함하는 약학적 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 펩티드를 함유하는 조성물에 함유될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토오즈, 덱스트로즈, 수크로스, 덱스트린, 말토덱스트린, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제되나, 이에 제한되지 않는다.

경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며 이에 제한되지는 않으나, 이러한 고형제제는 상기 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스 또는 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다.

경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명은 서열번호 1의 서열로 이루어진 펩티드를 포함하는 주름 개선용 화장료 조성물을 제공한다.

상기 펩티드뿐만 아니라, 화장료 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함할 수 있으며, 예컨대 항산화제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제, 그리고 담체를 포함할 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물을 첨가할 수 있는 제품으로는, 예를 들어, 수렴화장수, 유연화장수, 영양화장수, 각종크림, 에센스, 팩, 파운데이션 등과 같은 화장품류와 클렌징, 세안제, 비누, 트리트먼트, 미용액 등이 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 화장료 조성물의 구체적인 제형으로서는 스킨로션, 스킨 소프너, 스킨토너, 아스트린젠트, 로션, 밀크로션, 모이스처 로션, 영양로션, 맛사지크림, 영양크림, 모이스처 크림, 핸드크림, 에센스, 영양에센스, 팩, 비누, 샴푸, 클렌징폼, 클렌징로션, 클렌징크림, 바디로션, 바디클렌저, 유액, 립스틱, 메이컵 베이스, 파운데이션, 프레스파우더, 루스파우더, 아이섀도 등의 제형을 포함한다.

본 발명의 화장료 조성물은 상기 펩티드를 나노리포좀 내부에 함유시켜 안정화하여 제형화할 수도 있다. 상기 펩티드를 나노리포좀 내부에 함유시키면, 펩티드의 성분이 안정화되어 제형화시 침전형성, 변형 등의 문제점을 해결할 수 있으며, 성분의 용해도 및 경피흡수율을 높일 수 있어 상기 펩티드로부터 기대되는 효능을 최대로 발현시킬 수 있다.

본 발명은 서열번호 1의 서열로 이루어진 펩티드를 포함하는 주름 개선용 건강기능식품을 제공한다.

본 발명의 건강기능식품은 주름 개선을 목적으로, 정제, 캅셀, 분말, 과립, 액상, 환 등의 형태로 제조 및 가공할 수 있다.

본 발명의 건강기능식품이라 함은, 건강기능식품에 관한 법률 제6727호에 따른 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 제조 및 가공한 식품을 말하며, 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건 용도에 유용한 효과를 얻을 목적으로 섭취하는 것을 의미한다.

본 발명의 건강기능식품은 통상의 식품 첨가물을 포함할 수 있으며, 식품 첨가물로서의 적합 여부는 다른 규정이 없는 한, 식품의약품안전청에 승인된 식품 첨가물 공전의 총칙 및 일반시험법 등에 따라 해당 품목에 관한 규격 및 기준에 의하여 판정한다.

상기 식품 첨가물 공전에 수재된 품목으로는 예를 들어, 케톤류, 글리신, 구연산칼슘, 니코틴산, 계피산 등의 화학적 합성물; 감색소, 감초추출물, 결정셀룰로오스, 고량색소, 구아검 등의 천연첨가물; L-글루타민산나트륨 제제, 면류첨가알칼리제, 보존료제제, 타르색소제제 등의 혼합제제류 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.

예를 들어, 정제 형태의 건강기능식품은 상기 펩티드를 부형제, 결합제, 붕해제 및 다른 첨가제와 혼합한 혼합물을 통상의 방법으로 과립화한 다음, 활택제 등을 넣어 압축성형하거나, 상기 혼합물을 직접 압축 성형할 수 있다. 또한 상기 정제 형태의 건강기능식품은 필요에 따라 교미제 등을 함유할 수도 있다.

캅셀 형태의 건강기능식품 중 경질 캅셀제는 통상의 경질 캅셀에 상기 펩티드를 부형제 등의 첨가제와 혼합한 혼합물을 충진하여 제조할 수 있으며, 연질 캅셀제는 상기 펩티드를 부형제 등의 첨가제와 혼합한 혼합물을 젤라틴과 같은 캅셀기제에 충진하여 제조할 수 있다. 상기 연질 캅셀제는 필요에 따라 글리세린 또는 소르비톨 등의 가소제, 착색제, 보존제 등을 함유할 수 있다.

환 형태의 건강기능식품은 상기 펩티드와 부형제, 결합제, 붕해제 등을 혼합한 혼합물을 기존에 공지된 방법으로 성형하여 조제할 수 있으며, 필요에 따라 백당이나 다른 제피제로 제피할 수 있으며, 또는 전분, 탈크와 같은 물질로 표면을 코팅할 수도 있다.

과립 형태의 건강기능식품은 상기 펩티드와 부형제, 결합제, 붕해제 등을 혼합한 혼합물을 기존에 공지된 방법으로 입상으로 제조할 수 있으며, 필요에 따라 착향제, 교미제 등을 함유할 수 있다.

상기 건강기능식품은 음료류, 육류, 초코렛, 식품류, 과자류. 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 사탕류, 아이스크림류, 알코올 음료류, 비타민 복함제 및 건강보조식품류 등일 수 있다.

이하, 본 발명을 구체적으로 설명하기 위해 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다.

실시예 1. 펩티드 합성 및 세포독성 측정

실험에 사용한 펩티드는 표준 Fmoc 고상합성법에 따라 A&Pep 사(청주, 한국)에서 합성하였다.

상기 펩티드의 주름개선 효능을 확인하기 앞서 인간섬유아세포에서의 세포독성을 확인하였고, 세포독성이 없음을 확인하였다. (도 1)

실시예 2. Procollagen type-1의 생성량 측정 통한 주름개선효능 평가

본 발명 펩티드의 세포독성이 일어나지 않는 농도에서의 procollagen type-1 생성량을 비교하였다.

세포에 상기 펩티드를 인간섬유아세포에 농도별로 처리한 후 상등액을 추출하여 procollagen type-1 생성량을 측정하였고, 농도의존적으로 procollagen type-1 생성량이 증가함을 확인하였다. (도 2)

세포에 상기 펩티드를 인간섬유아세포에 농도별로 처리한 후 세포 내 procollagen type-1 생성량을 측정하였고, 농도의존적으로 procollagen type 1 생성량이 증가함을 확인하였다. (도 3)

실시예 3. MMP-1의 발현 억제정도 측정 통한 주름개선효능 평가

세포에 상기 펩티드를 인간섬유아세포에 농도별로 처리한 후 상등액을 추출하여 MMP-1 생성량을 측정하였고, MMP-1 생성량이 농도의존적으로 감소함을 확인하였다. (도 4)

실시예 4. In vivo 상의 주름 개선 효능 평가

1. 실험방법

SKH:HR-1 hairless mice (6주령)을 이용하여 9주동안 주름을 생성시킨 후 서열번호 1의 서열로 이루어진 펩티드(IVVPK)를 용량별로 처리하여 주름 개선 효능을 확인하고, 그에 관한 기전에 대한 검증을 진행하였다.

Normal군(UVB 비처리), IVVPK 처리군(IVVPK 200mg/kg, UVB 비처리), UVB 유도군(UVB 처리), 양성 대조군으로서 저분자 콜라겐 펩티드 처리군(200mg/kg, UVB 처리)을 설정하고, IVVPK를 저, 중, 고용량 처리군(50, 100, 200mg/kg, UVB 처리)으로 설정하여 실험을 진행하였다.

주름 개선 효능을 주기적으로 확인하기 위해 경구투여 후 3주, 6주, 9주 경과할 때마다 이미지 촬영과 모사판 제작을 진행하였으며, 제작된 모사판은 소프트웨어를 이용해 정량적인 분석을 진행하였다.

9주 경과 후, 쥐의 등조직을 분리하여 RNA 추출 및 RT-qPCR을 통하여 주름 개선과 관련된 작용 기전 인자 유전체 발현량 측정을 진행하였다.

2. 실험결과

(1) 경구투여 후 3주 경과

이미지와 모사판 분석을 통해, normal 군에 비해 IVVPK(서열번호 1의 서열로 이루어진 펩티드) 처리군에서 주름이 감소한 것을 확인할 수 있었으며, normal 군에 비해 UVB 유도군에서 주름이 확연하게 관찰되었고, UVB 유도군에 비해 IVVPK군(50, 100, 200mg/kg)에서는 용량 의존적으로 감소하는 것을 확인할 수 있었다(도 5, 6).

IVVPK의 주름 개선 효능을 수치로 검증하기 위해서 모사판을 정량 분석한 결과, 정량 수치에서 normal 군에 비해 UVB 유도군에서 주름 관련 수치가 확연히 증가하였으며 UVB 유도군에 비해 IVVPK 처리군(50, 100, 200mg/kg)에서는 용량 의존적으로 감소하는 것을 확인할 수 있었음(도 7 내지 11). 구체적으로, Normal 군 대비 UVB 유도군에서 주름 개수, 주름 전체 및 평균 길이, 주름 전체 및 평균 깊이 항목에서 각각 50%, 40%, 62%, 44%, 26% 증가하였고, UVB 유도군 대비 IVVPK 저용량 처리군에서 각 항목별 7%, 9%, 23%, 14%, 58% 감소하였으며, IVVPK 중용량 처리군에서 각 항목별 17%, 19%, 59%, 31%, 72% 감소를, IVVPK 고용량 처리군에서 각 항목별 42%, 51%, 76%, 41%, 92% 감소를 보였다. 저분자 콜라겐 펩티드의 경우 각 항목별 28%, 53%, 52%, 55%, 74%의 감소를 보였다.

3주 동안 서열번호 1의 서열로 이루어진 펩티드를 경구 투여한 결과, UVB 유도군에 비해 주름의 개수, 깊이, 길이가 용량 의존적인 감소를 보였으며 서열번호 1의 서열로 이루어진 펩티드 고용량 처리군(200mg/kg)이 동 용량의 저분자 콜라겐 펩티드보다 더 우수한 효능을 보였다.

(2) 경구투여 후 6주 경과

이미지와 모사판, 정량 분석 결과를 통하여 normal 군에 비하여 UVB 유도군에서 주름이 확연히 증가하는 것을 확인하였고, IVVPK 처리군에서 용량의존적으로 감소함을 확인하였다(도 12 내지 18).

IVVPK의 주름 개선 효능을 수치로 검증하기 위해서 모사판을 정량 분석한 결과, Normal 군 대비 UVB 유도군에서 주름 개수, 주름 전체 및 평균 길이, 주름 전체 및 평균 깊이 항목에서 각각 87%, 98%, 39%, 46%, 32% 증가하였다. UVB 유도군 대비 IVVPK 저용량 처리군에서 각 항목별 71%, 65%, 51%, 80%, 75% 감소하였고, IVVPK 중용량 처리군에서 각 항목별 96%, 87%, 85%, 117%, 92% 감소를, IVVPK 고용량 처리군에서 각 항목별 105%, 103%, 133%, 128%, 123% 감소를 보였다. 저분자 콜라겐 펩티드의 경우 각 항목별 121%, 108%, 86%, 117%, 128%의 감소를 보였다.

6주동안 서열번호 1의 서열로 이루어진 펩티드를 경구 투여한 결과, UVB 유도군에 비해 주름의 개수, 깊이, 길이가 용량의존적인 감소를 보였으며, 서열번호 1의 서열로 이루어진 펩티드 고용량 처리군(200mg/kg)이 동 용량의 저분자 콜라겐 펩티드보다 같거나 우수한 효능을 보였음.

(3) 경구투여 후 9주 경과

이미지와 모사판, 정량 분석 결과를 통하여 normal 군에 비하여 UVB 유도군에서 주름이 확연히 증가하는 것을 확인하였고, IVVPK 투여 군에서 용량의존적으로 감소함을 확인하였다(도 19 내지 25).

IVVPK의 주름 개선 효능을 수치로 검증하기 위해서 모사판을 정량 분석한 결과, Normal 군 대비 UVB 유도군에서 주름 개수, 주름 전체 및 평균 길이, 주름 전체 및 평균 깊이 항목에서 각각 61%, 39%, 35%, 66%, 24% 증가하였다. UVB 유도군 대비 IVVPK 저용량 처리군에서 각 항목별 48%, 43%, 67%, 50%, 64% 감소하였고, IVVPK 중용량 처리군에서 각 항목별 84%, 88%, 149%, 85%, 69% 감소를, IVVPK 고용량 처리군에서 각 항목별 124%, 124%, 167%, 89%, 89% 감소를 보였다. 저분자 콜라겐 펩티드의 경우 각 항목별 117%, 102%, 159%, 99%, 89%의 감소를 보였다.

9주동안 서열번호 1의 서열로 이루어진 펩티드를 투여한 결과, UVB 유도군에 비해 주름의 개수, 깊이, 길이가 용량 의존적인 감소를 보였으며 서열번호 1의 서열로 이루어진 펩티드 고용량 처리군(200mg/kg)이 동 용량의 저분자 콜라겐 펩티드보다 같거나 우수한 효능을 보였다.

(4) 조직염색을 통한 항주름 효능 검증

주름 개선 효능을 확인하기 위해, 경구 투여 후 9주 경과 후에 sacrifice를 실시하여 등 조직을 분리하였고, H&E(hematoxylin and eosin)와 Masson’s trichrome 염색을 통해 표피 두께와 콜라겐 밀도를 측정하였다.

Normal군에 비해 IVVPK만 처리한 군에서 표피 두께 감소와 콜라겐 섬유의 증가를 확인할 수 있었다. 또한, normal군에 비해 UVB 유도군에서 표피 두께 증가와 콜라겐 섬유의 감소를 확인할 수 있었으며, UVB 유도군에 비해 IVVPK 처리군(50, 100, 200mg/kg)에서는 용량 의존적인 표피 두께 감소와 콜라겐 섬유의 증가를 확인할 수 있었다(도 26, 27).

위의 결과를 수치로 검증하기 위해, Image j program을 이용하여 정량화하였다. H&E 염색은 표피 두께를 측정하여 수치화 하였고, Masson’s trichrome 염색은 콜라겐 섬유를 측정하였다(도 28, 29).

H&E 염색 정량 결과, 표피 두께는 normal군에 비해 UVB 유도군에서 142% 증가하였고 IVVPK 처리군에서 유의적으로 용량 의존적인 감소(23%, 32%, 52%)를 보였다. 양성 대조군인 저분자 콜라겐 펩티드 처리군(200mg/kg)의 경우 고용량 처리군(200mg/kg) 과 유사한 효능을 보였다.

Masson’s trichrome 염색 정량 결과, 콜라겐 섬유는 UVB 유도군에 비해 IVVPK 처리군에서 유의적으로 용량 의존적인 증가(10%, 25%, 66%)를 보였다. 양성 대조군인 저분자 콜라겐 펩티드 처리군(200mg/kg)의 경우, 중용량 처리군(100mg/kg)과 고용량 처리군(200mg/kg) 사이의 효능을 보였다.

상기 결과로서, 서열번호 1의 서열로 이루어진 펩티드가 표피 두께를 현저히 감소시키고, 진피에서 콜라겐의 양을 증가시켰음을 확인할 수 있다.

(5) RT-qPCR을 통한 유전체 발현량 변화 연구

9주 경과 후, 등조직을 분리하여 RNA 추출 및 RT-qPCR을 통하여 주름 개선과 관련된 작용 기전으로서 유전체 발현량 측정을 진행하였다. 피부조직에 많이 존재하는 콜라겐의 전구체인 Procollagen type 1과 그 분해효소인 MMP-1, MMP-2, MMP-3, MMP-9의 유전체 발현량을 확인하였다. 또한, MMP의 억제제로 작용하는 TIMP-1의 유전체 발현량 측정을 진행하였다.

Procollagen type 1 유전체 발현량이 normal군 대비하여 IVVPK만 처리한 군에서 40% 증가하였다. UVB를 처리하였을 때 유전체 발현량이 36%로 감소하였고, IVVPK를 용량별로 처리 시 저용량 처리군에서 29%, 중용량 처리군에서 72%, 고용량 처리군에서 94%로, Procollagen type 1 유전체 발현량이 용량 의존적으로 증가하였다. 양성 대조군인 저분자 콜라겐 펩티드 200mg/kg 처리군은 92% 증가하였다. IVVPK 고용량 처리군의 경우, 정상군과 유사한 유전체 발현을 보였다(도 30).

MMP-1 유전체 발현량이 정상군 대비하여 IVVPK만 처리한 군에서 8% 감소하였고, UVB 처리 시 220% 증가하였다. IVVPK 용량별로 처리 시, MMP-1 유전자 발현량이 저용량 처리군에서 57%, 중용량 처리군에서 74%, 고용량 처리군에서 96%로 감소하여, 용량의존적인 감소를 보였다. 저분자 콜라겐 펩티드 200mg/kg 처리군은 96% 감소하였다. IVVPK 고용량 처리군의 경우, 정상군과 유사한 유전체 발현량을 보였다(도 31).

MMP-2 유전체 발현량이 정상군 대비하여 IVVPK만 처리한 군에서 6% 감소하였고, UVB 처리 시 179% 증가하였다. IVVPK 용량별로 처리 시, MMP-2 유전자 발현량이 저용량 처리군에서 48%, 중용량 처리군에서 62%, 고용량 처리군에서 86%로 감소하여, 용량 의존적인 감소를 보였다. 저분자 콜라겐 펩티드 200mg/kg 처리군은 80% 감소하였다(도 32).

MMP-3 유전체 발현량이 정상군 대비하여 IVVPK만 처리한 군에서 9% 감소하였고, UVB 처리 시 164% 증가하였다. IVVPK 용량별로 처리 시 MMP-3 유전자 발현량이 저용량 처리군에서 27%, 중용량 처리군에서 59%, 고용량 처리군에서 72%로 감소하여, 용량 의존적인 감소를 보였다. 저분자 콜라겐 펩티드 200mg/kg 처리군은 68% 감소하였다(도 33).

MMP-9 유전체 발현량이 정상군 대비하여 IVVPK만 처리한 군에서 8% 감소하였고, UVB 처리 시 103% 증가하였음. IVVPK 용량별로 처리 시, MMP-9 유전자 발현량이 저용량 처리군에서 21%, 중용량 처리군에서 58%, 고용량 처리군에서 77%로 감소하여, 용량 의존적인 감소를 보였다. 저분자 콜라겐 펩티드 200mg/kg 처리군은 78% 감소하였다(도 34).

TIMP-1 유전체 발현량이 정상군 대비하여 IVVPK만 처리한 군에서 8% 증가하였고, UVB 처리 시 45% 증가하였음. IVVPK 용량별로 처리 시, TIMP-1 유전자 발현량이 저용량 처리군에서 20%, 중용량 처리군에서 45%, 고용량 처리군에서 55%로 증가하여, 용량의존적인 증가를 보였다. 저분자 콜라겐 펩티드 200mg/kg 처리군은 63% 증가하였다(도 35).

<110> GYEONGSANG NATIONAL UNIVERSITY OFFICE OF ACADEMY AND INDUSTRY COLLABORATION <120> Peptide having wrinkle-improving effect <130> 19P04019 <150> KR 10-2018-0052555 <151> 2018-05-08 <160> 1 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide sequence 1 <400> 1 Ile Val Val Pro Lys 1 5

Claims (3)

1. 서열번호 1의 서열로 이루어진 펩티드를 포함하는 주름 개선용 약학적 조성물.
   
2. 서열번호 1의 서열로 이루어진 펩티드를 포함하는 주름 개선용 화장료 조성물.
   
3. 서열번호 1의 서열로 이루어진 펩티드를 포함하는 주름 개선용 건강기능식품.

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