CN103520955B - 一种分子印迹整体搅拌吸附棒及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种分子印迹整体搅拌吸附棒及其制备方法，所述制备方法按以下步骤制备：第一步，对磁粉进行二氧化硅包覆和修饰接枝处理；第二步，配置印迹溶液，并与磁粉混合装填于玻璃管中；第三步，在70～90℃水浴锅中聚合反应20～40h，反应完成后敲碎外面的玻璃管并进行切割得到一定长度的分子印迹整体搅拌吸附棒。本发明采用一步热聚合反应的整体式制备方式，磁力供给采用新基质高磁性超顺材料铷铁硼，聚合反应完成后，搅拌棒为均一体结构。本发明的有益效果是，该搅拌棒磁力材料与印迹聚合物聚合后为匀一体，有较强的耐溶剂性和机械稳定性，少量高磁性超顺材料就能提供足够的磁力。制备简便易行，使用方便。

Description

一种分子印迹整体搅拌吸附棒及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种分子印迹整体搅拌吸附棒及其制备方法。

背景技术

分子印迹技术(molecularly imprinted technology，MIT)是涉及物理化学、高分子化学、生物化学和材料科学等基础科学的交叉学科技术，它可方便快捷的提供具有期望结构和性质的分子组合体。通过分子印迹技术制备的聚合物(molecular imprinting polymer，MIP)因有特定形状和大小的孔穴，且孔穴内有特定排列的结合位点,对模板分子结构具有一定的记忆和识别功能。具有吸附选择性好、色谱效率高、便于功能设计等优点，在色谱分离、固相萃取、传感器、药物控释等领域得到了广泛应用。

搅拌棒吸附萃取技术（Stir bar sportive extraction，SBSE）是在固相微萃取基础上发展起来的新型样品处理技术，因具有灵敏度高、操作简便和耗溶剂少等优点，引起广泛关注。SBSE对待测物的富集过程是基于待测物质在样品及涂层间的平衡分配。但是由于SBSE萃取相的体积比固相微萃取大得多，通常是固相微萃取的50～250倍，所以极大的提高了富集倍数。加之，搅拌棒在自身搅拌的同时完成对待测物的吸附，操作极为简便，而且避免了固相微萃取中搅拌子的竞争吸附，因此SBSE被广泛应用于各种痕量物质的检测。

搅拌吸附棒萃取技术是1999年由荷兰Baltussen E.提出并由Gerstel GmbH公司于2000年推出了商品化装置。装置内部为内封铁芯的玻璃或石英管，在其外部涂渍上一层聚二甲基硅氧烷(Polydimethylsiloxane,PDMS)涂层（壁厚0.3～1mm）用作萃取相，其体积一般为55～250μL，与纤维SPME和In-tube SPME的相比（萃取相与样品相的比值）要高100～400倍，因此具有较高的富集效率，检出限小于1ng/L，同时由于其萃取时搅拌吸附棒可自身完成搅拌而吸附、富集溶液中的低浓度被萃取物，可避免常用搅拌子的竞争吸附，突出了这一技术在痕量目标物分析检测中的优势。但是目前商品化产品及其采用类似技术的SBSE也存在一定的缺点：①为保证绝对萃取量而需要较厚的萃取固定相膜，使得其膜的制作不易实现；②研制开发的SPME涂层大都是采用溶胶凝胶法和热固法将萃取涂层固定到支撑体上，因此其在使用过程中耐有机溶剂性能不好，易出现涂层脱落或损坏的现象，使得实验结果有误差或重复性差。

目前SBSE技术方面的研究主要是集中于新涂层材料和新涂层制备方法的开发。2004年，大连化物所关亚风课题组首次用Sol-gel法技术在玻璃棒上键合交联PDMS，涂层厚度达36μm。将其应用于萃取分析蔬菜中有机磷农药和海水中有机氯农药，检出限分别是0.15 ng/g和0.05～2.53ng/L；近年来又采用耐热工程塑料--聚醚砜酮（PPESK），通过浸入沉淀法涂覆在内封磁芯的玻棒表面，制得针对中等极性和极性化合物的萃取分析，对苦参中有机氯农药的检出限为3～17pg/g，RSD＜17%，回收率达82%～128%。2005年Lambert J.P.等选用烷基二醇硅(ADS)的限进材料（RAM）为SBSE萃取涂层分馏生物样品中的蛋白质，克服了在直接萃取血浆等生物样品时，涂层受蛋白质的污染堵截，增加了SBSE的使用寿命。Hu Y.采用PDMS和β-环糊精复合涂层制备SBSE，用于萃取水中雌性激素和双酚A。为了克服玻璃管容易破碎的缺点，Wang L.等用钛管代替玻璃管，将PDMS直接键合在钛管上。Yang C.等则将PDMS键合在直径为0.5mm的玻璃微球上，相同条件下萃取水样中PAHs，与PDMS萃取搅拌棒相比，缩短了萃取时间。2007年，厦门大学Huang X.J.首次将整体柱材料与搅拌吸附棒萃取技术结合，制备了基于整体柱材料的搅拌吸附萃取棒，并结合HPLC分析了尿液中8种多环芳烃。随后该课题组在此方面的研究与应用领域做了很多研究工作，与商品化SBSE相比，整体柱材料搅拌吸附萃取棒可直接对非极性和弱极性有机化合物、甚至是无机离子进行有效萃取。

但是，由于目前商品化的搅拌棒涂层是以非极性的聚二甲基硅氧烷为涂层材料的，内部为铁芯，这样的搅拌棒不是均一体，由于其固定相的涂布量较少，不耐有机溶剂腐蚀，且易脱落，内部的铁芯用量太少不能提供足够的磁力，用量太多会增加搅拌棒的重量不利于使用。

发明内容

为了克服现有的搅拌棒不是均一体，不耐有机溶剂腐蚀，且易脱落，内部的铁芯用量太少不能提供足够的磁力，用量太多会增加搅拌棒的重量不利于使用的不足，本发明提供一种整体式磁性分子印迹搅拌棒，该发明能解决现有的搅拌棒不是均一体，不耐有机溶剂腐蚀，且易脱落，内部的铁芯用量太少不能提供足够的磁力，用量太多会增加搅拌棒的重量不利于使用的问题，本发明提供了一种分子印迹整体搅拌吸附棒及其制备方法。

本发明的技术方案是：一种分子印迹整体搅拌吸附棒的制备方法，其特征在于，按以下步骤制备：第一步，对磁粉进行二氧化硅包覆和修饰接枝处理；第二步，配置印迹溶液，并与磁粉混合装填于玻璃管中；第三步，在70～90℃水浴锅中聚合反应20～40h，敲碎外面的玻璃管并进行切割得到一定长度的分子印迹整体搅拌吸附棒。

上述的一种分子印迹整体搅拌吸附棒的制备方法，所述的制备步骤还包括：磁粉的预处理:将磁粉在丙酮溶液中处理30min，再在80℃的氢氧化钠碱性溶液中浸泡20min以除去磁粉表面的有机物，取出真空干燥备用；所述磁粉的二氧化硅包覆：取20g预处理的干燥磁粉分散于50mL丙酮和4mL二次纯水，在常温机械搅拌即500rpm条件下逐滴加入5mL氨水和5mL TEOS即正硅酸乙酯后搅拌反应10h；用磁性分离架分离磁粉，并用二次纯水冲 洗，在真空干燥箱中120℃干燥得到包覆有二氧化硅的磁粉；磁粉的γ-甲基丙烯酰氧丙基三甲氧基硅修饰:取20mmolγ-甲基丙烯酰氧丙基三甲氧基硅溶于甲苯中制成10%（V/V）的溶液，在锥形瓶中将20g经TEOS修饰处理的磁粉浸泡于上述甲苯溶液，室温下振荡反应2h进行γ-甲基丙烯酰氧丙基三甲氧基硅键合修饰；用磁性分离架分离磁粉，甲苯洗涤；并在真空干燥箱中120℃条件下干燥得到修饰过的磁粉。

上述的一种分子印迹整体搅拌吸附棒的制备方法，所述印迹溶液的制备包括：将莠去津，MAA即甲基丙烯酸溶于氯仿中溶，超声反应后通氮气以去除印迹溶液中的溶解氧密封静置进行分子自组装；然后加入EDMA即乙二醇二甲基丙烯酸酯，乙基纤维素，超声反应直到乙基纤维素完全溶解，加入AIBN即2，2′-偶氮二异丁腈即得印迹溶液。

上述的一种分子印迹整体搅拌吸附棒的制备方法，所述印迹溶液的制备包括：将1mmol(0.2223g)莠去津，4mmol的MAA0.341mL溶于5mL氯仿中溶，超声15min后通氮气以去除印迹溶液中的溶解氧密封静置30分钟进行分子自组装。然后加入30mmol的EDMA5.67mL，0.1g乙基纤维素，超声直到乙基纤维素完全溶解，加入AIBN即得,加入AIBN的质量是印迹溶液总质量的1%。

上述的一种分子印迹整体搅拌吸附棒的制备方法，磁粉的预处理:将磁粉在丙酮溶液中处理30min，再在80℃的氢氧化钠碱性溶液中浸泡20min以除去磁粉表面的有机物，取出真空干燥备用；所述磁粉的二氧化硅包覆：取20g预处理的干燥磁粉分散于50mL丙酮和4mL二次纯水，在常温机械搅拌即500rpm条件下逐滴加入5mL氨水和5mL TEOS即正硅酸乙酯后搅拌反应10h；用磁性分离架分离磁粉，并用二次纯水冲洗，在真空干燥箱中120℃干燥得到包覆有二氧化硅的磁粉；磁粉的γ-甲基丙烯酰氧丙基三甲氧基硅修饰:取20mmolγ-甲基丙烯酰氧丙基三甲氧基硅溶于甲苯中制成10%（V/V）的溶液，在锥形瓶中将20g经TEOS修饰处理的磁粉浸泡于上述甲苯溶液，室温下振荡反应2h进行γ-甲基丙烯酰氧丙基三甲氧基硅键合修饰；用磁性分离架分离磁粉，甲苯洗涤；并在真空干燥箱中120℃条件下干燥得到修饰过的磁粉；按以下步骤制备取所述印迹溶液取480μL,包覆二氧化硅及修饰接枝的干燥磁粉粉取2.48g分6次先溶液再磁粉在超声的条件下装填于玻璃管中。装填好后超声10min，使其硬实。然后用橡皮塞密封后，放在80℃水浴锅中聚合32h，敲碎玻璃管并切割为一定长度既得分子印迹整体搅拌吸附棒。

上述的一种分子印迹整体搅拌吸附棒的制备方法，所述的制备步骤还包括：第四步，分子印迹整体搅拌吸附棒的模板洗脱处理:依靠磁性棒自身的磁力搅拌作用在甲醇/醋酸（v/v=9:1）洗脱12h，每3h换一次溶液；然后在纯甲醇溶液中洗脱6h，每2h换一次溶液，直至洗脱液上高效液相色谱仪无杂质峰出现。

上述的一种分子印迹整体搅拌吸附棒的制备方法，所述第二步中印迹溶液与磁粉分6次先溶液再磁粉在超声的条件下装填于玻璃管中。

上述的一种分子印迹整体搅拌吸附棒的制备方法，所述第一步在对磁粉进行二氧化硅包覆后还包括磁粉的γ-甲基丙烯酰氧丙基三甲氧基硅修饰:取20mmolγ-甲基丙烯酰氧丙基三甲氧基硅溶于甲苯中制成10%（V/V）的溶液，在锥形瓶中将20g经TEOS修饰处理的磁粉浸泡于上述甲苯溶液，室温下振荡反应2h进行γ-甲基丙烯酰氧丙基三甲氧基硅键合修饰；用磁性分离架分离磁粉，甲苯洗涤3次；并在真空干燥箱中120℃条件下干燥得到修饰过的产品。

本发明的另一目的在于提供一种分子印迹整体搅拌吸附棒，所述的搅拌吸附棒按以下步骤制备：第一步，对磁粉进行二氧化硅包覆和修饰接枝处理；第二步，配置印迹溶液，并与磁粉混合装填于玻璃管中；第三步，在70～90℃水浴锅中聚合反应20～40h，敲碎外面的玻璃管并进行切割得到一定长度的分子印迹整体搅拌吸附棒。

本发明的还提供了一种分子印迹整体搅拌吸附棒，所述的搅拌吸附棒按述1～8任一项方法制得。

本发明采用一步热聚合反应的整体式制备方式，磁力供给采用新基质高磁性超顺材料铷铁硼，聚合反应完成后，搅拌棒为均一体结构。本发明的有益效果是，该搅拌棒磁力材料与印迹聚合物聚合后为匀一体，有较强的耐溶剂性和机械稳定性，少量高磁性超顺材料就能提供足够的磁力。制备简便易行，使用方便。

本发明采用新基质高磁性超顺材料钕铁硼磁粉（Nd₂Fe₁₄B）作为搅拌棒的磁力供给，利用溶胶-凝胶（Sol-gel）法对磁粉进行TEOS包覆，γ-甲基丙烯酰氧丙基三甲氧基硅表面键合，再通过一步聚合反应，以莠去津为模板，MAA为功能单体，EDMA为交联剂，制备了一种新型分子印迹整体式搅拌吸附萃取棒。通过优化萃取和洗脱溶剂，搅拌速度，吸附解析模式等实验条件，成功建立了两种搅拌吸附棒富集萃取实际环境样品溶液中三嗪类除草剂的分析方法：液液-搅拌棒萃取和直接在非极性溶剂中搅拌萃取。两种方法对于4种三嗪类混合物在0.01～0.3μg/mL的浓度范围呈现良好线性关系，相关系数大于0.9993，加标回收率在73.6%～95.5%之间。制备的整体式磁性分子印迹搅拌棒具有耐有机溶剂、热稳定性高、萃取容量大、萃取和解吸的速度快等特点。

附图说明

图1是钕铁硼修饰后及制备的MI-SBSE和NI-SBSE红外光谱图。

图2是分子印迹整体搅拌吸附棒的表面扫描电镜图。

图3是分子印迹整体搅拌吸附棒横断面的表面扫描电镜图。

图4是萃取溶剂对搅拌吸附棒萃取量的影响结果图。

图5是解析溶剂对搅拌吸附棒萃取量的影响结果图。

图6是搅拌速度对搅拌吸附棒萃取量的影响结果图。

图7是萃取和解析时间对搅拌吸附棒萃取量的影响结果图。

图8是萃取液中pH值对搅拌吸附棒萃取量的影响结果图。

图9是MI-SBSE与NI-SBSE在相同萃取解吸条件下对三嗪类结构类似化合物的萃取选择性。

图10a是MIP和NIP搅拌吸附棒萃取单独萃取莠去津标液及萃取4种结构类似物混合溶液时浓度与萃取的关系图。

图10b是搅拌吸附棒在正己烷溶液中萃取。

图10c是搅拌吸附棒结合液液萃取。

图11a是MIP和NIP搅拌吸附棒萃取黄瓜的色谱图。

图11b是MIP和NIP搅拌吸附棒萃取土样添加物的色谱图

具体实施方式

下面结合附图对本发明做详细说明。

本发明使用的试剂有：莠去津(97.5％)、特丁津（96.7%）、莠灭净（87.4%）、2-氨基-4甲氧基-6-甲基-1.3.5-均三嗪（98.6%），嗪草酮（97.4%）均购于国家标准物质中心；α-甲基丙烯酸（MAA，99.5%），乙二醇二甲基丙烯酸酯（EDMA，98%），正硅酸四乙酯（TEOS，分析纯），3-(三甲氧基硅烷基)丙基甲基丙烯酸酯(γ-MAPs，分析纯)，均购于New Jersey，USA上海分公司；2，2′-偶氮二异丁腈(AIBN，分析纯，天津光复精细化工研究所)；氯仿（分析纯）、丙酮（分析纯）、乙腈（CAN，色谱纯）、甲醇（MeOH，色谱纯）、乙酸（分析纯），苯（分析纯），甲苯（分析纯），正己烷（分析纯），四氯化碳（分析纯），，乙酸乙酯（分析纯）均购于天津市科密欧化学试剂有限公司；乙基纤维素（分析纯）购于国药集团化学试剂有限公司；铷铁硼（烧结钕铁硼磁体，主相Nd₂Fe₁₄B的Nd：Fe正分比值为1：7。密度≥7.5，过剩磁感应强度Remanence induction：典型值12.5KGs，最大磁能积maximumEnergy product：51MGOe，粒径≤30μm，北京中科三环高新技术股份有限公司提供）。实验用水均为二次蒸馏水。

本发明使用的仪器有：P1201高效液相色谱仪(大连依利特分析仪器有限公司)；C₁₈色谱柱（150mm*4.6mm,ID5.0μm,Waters）；MTN-2800W氮吹浓缩装置（天津奥特赛恩斯有限公司）；TENSOR27红外光谱仪（Bruker,Germany）；Quanta200扫描电子显微镜（FEI，Hillsboro，Oregon，USA）；KQ5200DE型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）； HH-4数显恒温水浴锅（河南智诚科技发展有限公司）；TWCL-D磁力搅拌器（河南爱博特科技发展有限公司。

分子印迹整体搅拌吸附棒制备

磁粉的预处理:将购买的磁粉在丙酮溶液中处理30min，再在80℃的氢氧化钠碱性溶液中浸泡20min以除去磁粉表面的有机物，取出真空干燥备用。磁粉的SiO₂包覆：取20g预处理的干燥磁粉分散于50mL丙酮和4mL二次纯水，在常温机械搅拌（500rpm）条件下逐滴加入5mL氨水和5mL TEOS后搅拌反应10h。用磁性分离架分离磁粉，并用二次纯水冲洗六次，在真空干燥箱中120oC干燥得到包覆有SiO₂的磁粉。磁粉的γ-甲基丙烯酰氧丙基三甲氧基硅修饰:取20mmolγ-甲基丙烯酰氧丙基三甲氧基硅溶于甲苯中制成10%（V/V）的溶液，在锥形瓶中将20g经TEOS修饰处理的磁粉浸泡于上述甲苯溶液，室温下振荡反应2h进行γ-甲基丙烯酰氧丙基三甲氧基硅键合修饰。用磁性分离架分离磁粉，甲苯洗涤3次。并在真空干燥箱中120℃条件下干燥得到修饰过的产品。

分子印迹整体搅拌吸附棒:将1mmol(0.2223g)莠去津，4mmol(0.341mL)MAA溶于5mL氯仿中溶，超声15min后通氮气以去除印迹溶液中的溶解氧密封静置30分钟进行分子自组装。然后加入30mmol（5.67mL）EDMA，0.1g乙基纤维素（Ethyl cellulose ethoce，EC约为总体积的1%），超声直到乙基纤维素完全溶解，加入AIBN0.03g。取内直径0.4cm，长度8cm的玻璃管，将上述印迹溶液取480μL,包覆二氧化硅及修饰接枝的干燥磁粉粉取2.48g分6次先溶液再磁粉在超声的条件下装填于玻璃管中。装填好后超声10min，使其硬实。然后用橡皮塞密封后，放在80oC水浴锅中聚合32h，得到分子印迹整体搅拌吸附棒（MI-SBSE）。敲碎外面的玻璃管，切割成长度1cm磁性搅拌转子。

空白对照的非分子印迹整体搅拌吸附棒（NI-SBSE）合成同上述步骤，只是不加入模板分子。

分子印迹整体搅拌吸附棒的模板洗脱:依靠磁性棒自身的磁力搅拌作用在甲醇/醋酸（v/v=9:1）洗脱12h，每3h换一次溶液。然后在纯甲醇溶液中洗脱6h，每2h换一次溶液，直至洗脱液上高效液相色谱仪无杂质峰出现。

分子印迹整体搅拌吸附棒表征，由图1可知，3346cm^-1和918cm^-1分别为羟基-OH和Si-OH伸缩振动吸收带；2938cm^-1和2882cm^-1是磁粉在γ-甲基丙烯酰氧丙基三甲氧基硅和TEOS修饰后的-CH3和-CH2伸缩、变形振动吸带；1096cm^-1和798cm^-1是典型的SiO₂包裹磁粉的Si-O和Si-O-Si的吸收带；而1729cm^-1附近的羰基(C=O)的伸缩振动吸收峰和1189cm^-1和1170cm^-1附近的C-O-C伸缩振动峰是功能单体和交联剂的两个特征吸收峰，说明MMA单体和EDMA及模板 分子都与钕铁硼混合物发生了聚合反应，生成了目标聚合产物。

由图2、图3可以看到，搅拌棒表面和断切面表面粗糙，明显可见白色、均匀的包覆层。且包覆层均呈现均匀、致密的结构。同时也可以看到在搅拌棒基质的内部留下了大量亚微米级贯通孔，这种贯通孔的结构即保证了快速的传质速率，也使搅拌棒与样品之间的接触面积增加，有利于提高传质速率和吸附容量。从而不会导致过长的萃取时间，有利于实际应用。

萃取和解析液的选择

室温下依据溶剂的极性考察了常见萃取溶剂：水、乙腈、乙酸乙酯、苯、甲苯、氯仿、四氯化碳和正己烷。莠去津的浓度为0.8μg/mL，萃取溶液为10mL，搅拌速度为600rpm，吸附和解析时间均为60min，解析液为甲醇-乙酸（95%：10%）溶液。由图4可见，以水、乙腈和乙酸乙酯为萃取溶剂，MI-SBSE的萃取效果较差，萃取效率低于27.3%；以苯和甲苯萃取时萃取率有所提高，但也低于67.7%；而以四氯化碳、氯仿和正己烷为萃取溶剂时，萃取率能明显提高。这是因为这3种萃取溶剂其非极性较强不参与氢键形成，保证了印迹亲和结合位点对莠去津的有效识别。但水、乙腈和乙酸乙酯因具有极性，可破坏或消弱模板分子莠去津与结合位点的氢键作用。而采用苯和甲苯为萃取剂时，萃取效率不及氯仿、四氯化碳和正己烷可能是由于聚合时采用的是氯仿作为致孔剂和溶剂，在聚合后，其形成的具有匹配功能的印迹空穴孔径和极性环境造成的，同时也有可能是莠去津在其溶液中存在过高萃取分配系数。本实验结果表明，采用氯仿、四氯化碳和正己烷作为萃取剂时对莠去津的萃取率较高，分别达到7.47、7.31和7.48μg。考虑到四氯化碳（密度：1.594g/mL，黏度：0.965mPa·s）和氯仿（密度：1.498g/mL，黏度：0.563mPa·s）的密度和黏度关系，密度和黏度越大，会影响物质的传质速度，故在LL-SBSE萃取中选择氯仿作为萃取剂，在土壤直接萃取时选择正己烷为萃取剂。

萃取后的解析过程其实质是已吸附富集于SBSE上的待测物在搅拌棒与解析溶剂间的再次分配过程。实验考察了常用解析溶剂甲醇、乙腈及在甲醇或乙腈中加入不同比例(5%或10%,v/v)的乙酸为解吸溶剂，解析液体积为200μL，实验结果如图5所示。表明在不加入或加入相同比例乙酸情况下，乙腈解析体系对莠去津的解析效果都略低于甲醇解吸体系。这是由于甲醇相对于乙腈极性更强，更易消弱或破坏模板分子与结合位点形成的氢键作用力，因而会使莠去津再分配于解析液变得快速和彻底。而在解析溶剂中加入乙酸能提高解吸效率，是因为乙酸能够改变溶液的pKa值，能减弱或破坏莠去津与MI-SBSE间形成的氢键，更有利于模板物的溶出，同时考虑到基质进色谱时对基线的影响，因此选择甲醇-乙酸（v/v=95%:5%）体系作为最佳解吸剂。

搅拌速度对萃取量的影响

搅拌可使溶液中的待测物分布更均一，同时加快SBSE固-液界面的更新速度，提高萃取效率和缩短吸附平衡时间，因此搅拌速度是影响萃取效率和萃取速度的一个重要因素。实验控制吸附时间60min，莠去津浓度为0.8μg/mL时，考察了0～900rpm的搅拌转速，SBSE直接在正己烷中萃取模式和在黄瓜样中的液液结合搅拌棒萃取模式，萃取后搅拌吸附用200μL甲醇-乙酸（v/v=95%:5%）解析体系超声辅助解析60min。考察其对吸附萃取效率的影响，结果如图6。实验结果表明，对于SBSE直接放在正己烷中萃取模式，搅拌速度在0-500rpm范围时，萃取效率与搅拌速度呈线性相关；而当转速达到500rpm之后，继续提高搅拌速度其萃取效率基本达到平衡。此现象是由于萃取效率主要受制于分析物在固相中的自由扩散速度及与纳米级的印迹孔穴进行匹配的结合速率，初始时提高搅拌速度，会加速溶质的传质速率和扩散速度，相应的萃取效率也会提高；但底物与印迹空穴进行匹配的结合速率是受印迹孔穴浓度差控制的，因此当继续提高转速，其吸附位点孔穴周围的浓度差变化不大，故萃取效率提高不明显。而采用在黄瓜样品中结合液液萃取模式时，萃取量是随着搅拌速度的增加而不断提高的，在700rpm后开始增幅放缓，由于继续提高搅拌速度至1000rpm时在萃取溶液中心位置处形成较大的涡旋，难以保证搅拌吸附棒萃取时全部浸入到萃取有机溶液中，对萃取不利。故直接萃取模式选择搅拌速度为500rpm，液液萃取结合模式采用700rpm。

同时试验还考察了静态吸附与在优化好的搅拌速度(直接萃取模式搅拌速度500rpm，液液萃取结合模式搅拌速度700rpm)下对相同浓度的莠去津溶液吸附萃取情况，吸附萃取时间30min。结果显示，直接萃取模式搅拌棒吸附莠去津的量（7.38μg）约是静态吸附（3.41μg）的2.16倍，液液萃取结合模式吸附量是静态的（5.24μg/2.17μg）2.42倍。进一步说明搅拌能显著提高溶液的传质速率，减小或消除目标吸附物的浓度梯度比，从而缩短萃取时间。

吸附和解析时间的优化

在室温下，保持搅拌速度不变(直接萃取模式搅拌速度500rpm，液液萃取结合模式搅拌速度700rpm)，莠去津的浓度为0.8μg/mL，萃取溶液为10mL，萃取后用200μL甲醇-乙酸（v/v=95%:5%）溶剂体系超声辅助解析。考察2种萃取模式的吸附和解析时间对对萃取效率的影响，结果如图7所示。可以看出，直接在正己烷中萃取模式30min时能达到萃取平衡，而结合液液萃取模式的需要在40min才能达到萃取平衡。这主要是由于搅拌吸附棒在萃取过程中其实质就是目标萃取物在固-液界面的一个动态分配，由于萃取目标物在溶剂和搅拌棒之间存在一个分配平衡系数，因此在结合液液萃取模式中，其平衡时间需要更为长点。考察解析时间，由图可以看出，在超声辅助解析的情况下，样品在40min时洗脱率均能达到96.8%，故洗脱时间选择为40min。

盐浓度和溶液pH值对搅拌棒结合液液萃取模式的影响

实验考察了0～24mM氯化钠对萃取条件的影响，发现在常规盐浓度下对搅拌棒结合液液萃取模式的萃取量影响甚微。这可能是由于样品相中加入盐之后，可能会出现盐析效应降低莠去津在水中的溶解度从而有利于莠去津从样品水相中被萃取到有机相中增加了吸附量；但氯化钠的加入也会改变搅拌吸附棒的表层物理结构同时也让给体的黏度增大，从而阻碍了莠去津从给体到有机相膜的扩散而降低了萃取效率。因此本实验确定在给体即黄瓜样品中不加盐。

通过采用3mol/L的HCL和1mol/L的NaOH溶液来调节莠去津黄瓜样品的pH值（pH1.5～9.5），研究萃取液pH值对搅拌吸附棒萃取量的影响，萃取结果见图8。当pH值从1.5增加到5.5时萃取量随溶液的pH值增加而增加；在pH5.5～9.5之间时吸附量会有显著的下降。这是因为莠去津通过异丙胺基及三嗪环的氮原子与功能单体形成的配合物，模板洗脱后，在印迹聚合物上主要通过残留功能单体的羧基基团与模板分子通过氢键相互链接，而在pH5.5左右时，印迹亲和结合点孔穴中的羧基是会以自由状态存在，此时莠去津也大多以分子状态的存在，有利于莠去津分子和分子印迹聚合物孔穴上的官能团匹配，即更有利于从极性黄瓜样品中转移到有机相中。而在氢氧化钠碱性时印迹聚合物上的羧基会电离，强酸性溶液中，莠去津分子中三嗪环会质子化，其两种情况都可能削弱莠去津分子和印迹聚合物之间的氢键作用。故在搅拌棒结合液液萃取模式中，试验选择pH值5.5作为最佳萃取条件。

搅拌棒对萃取底物的选择性能

图9是MI-SBSE与NI-SBSE在相同萃取解吸条件下，对三嗪类结构类似化合物的萃取选择性。从萃取量可知：在正己烷直接萃取模式中MI-SBSE对于结构类似物均三嗪、莠去津、特丁津、莠灭净的^萃取量分别是NI-SBSE的4.56、5.74、5.83、5.69倍，而对于非均三嗪类嗪草酮只有0.90倍。在搅拌吸附棒与液液结合模式中，这4类三嗪类除草剂MI-SBSE的^萃取量分别是NI-SBSE的4.98、5.41、5.74、5.52倍，对嗪草酮1.05倍。表明MI-SBSE萃取棒对三嗪类除草剂的选择富集性明显优于NI-SBSE，且对于非均三嗪类化合物不具有选择性和富集性。这是由于MI-SBSE中形成的三维空间取向和残留的功能基可以选择性与模板分子莠去津及其结构类似物相匹配，从而提高了MI-SBSE的特异性萃取选择性。而NI-SBSE搅拌吸附棒由于没有高亲和位点，依赖的是其非特异性吸附，故吸附萃取效率较低。

吸附曲线、分析方法线性范围、检出限和精密度

图10a、图10b、图10c分别考察了搅拌吸附棒在两种萃取模式中对模板分子莠去津（0.01～2.0μg/mL）和4种三嗪类除草剂结构类似物混合标样（0.01～0.80μg/mL）的萃取解析效能。可以看出对比的两种萃取模式中直接在有机相正己烷中萃取效率要高于搅拌吸附棒结合液液萃取模式，这主要是由于SBSE结合液液萃取模式中存在模板分子莠去津的一个液 液分配平衡。对于混合标样可以看出在两种萃取模式中组分间都存在吸附竞争现象，搅拌棒在未达到饱和吸附量时，对模板分子莠去津和均三嗪的吸附效能较高，而达到饱和吸附量之后，随着浓度的继续加大，均三嗪吸附效能有所下降，其他3类三嗪化合物效率又略有提高。这是因为均三嗪分子量小，极性远大于其他3类三嗪化合物，在低浓度时在印迹空穴中分配系数较大,而吸附平衡量达到饱和时会被因为空穴的匹配性被其他3类化合物所替代,从洞穴上再次解析下来。同时也能看出对于混合样，直接萃取模式在浓度为0.3μg/mL时已经达到平衡，而与液液萃取结合模式在浓度为0.5μg/mL才能达到最大吸附位点。

以标准溶液浓度为横坐标x，其对应的吸附量为纵坐标y，考察SBSE/HPLC联用方法，绘制4种三嗪类除草剂在两种模式下的线性范围曲线，求出线性回归方程。实验结果见表1。由表可知，SBSE直接在正己烷中萃取时线性范围是0.01～0.3μg/mL，检出限0.51～0.72μg/L，R2＞0.96；SBSE结合液液萃取模式时线性范围是0.01～0.4μg/mL，检出限0.73～0.97μg/L，R2＞0.95。表明MI-SBSE/HPLC联用方法对于三嗪类除草剂多残留分析具有较高灵敏度。

表1莠去津MIP搅拌吸附棒萃取-HPLC联用测定三嗪类除草剂方法的线性范围、检出限实际样品测定

以NIP搅拌棒为对照，采用MIP搅拌棒萃取-HPLC联用检测加标混合标样的土壤和植物黄瓜实际样品，验证MIP搅拌棒对实际样品的吸附性能，色谱见图11a、图11b。谱图表明土壤样品和黄瓜样品提取液直接上HPLC分析没有添加物的存在。在添加混合物后样品NIP搅拌棒微球萃取-HPLC分析中也能检测出及少量的三嗪类除草剂，这是由于NIP搅拌棒对实际样品中基体的非特异性吸附造成。对比图谱，莠去津MIP搅拌棒萃取-HPLC联用方法能够消除基体干扰，且在添加浓度为0.04μg/g土样样品中，MIP搅拌棒萃取富集4种三嗪类化合物均三嗪、莠去津、莠灭净、特丁津色谱峰高分别是标准浓度峰高的（335.92/16.94）19.8， (387.11/18.00)21.5，(322.75/14.92)21.6，(234.01/10.76)21.8倍。在添加浓度为0.05μg/mL黄瓜样品中，均三嗪、莠去津、莠灭净、特丁津萃取富集后的色谱峰高分别是标准浓度峰高的(24.74/4.41)5.6，(49.81/9.62)5.2，(55.95/7.86)7.1，(34.55/5.96)5.8倍。

用于测定加标土壤样品和黄瓜样品中的4种三嗪类化合物的结果如表2所示，在黄瓜样品中莠去津回收率为84.5%～94.2%、RSD为5.2%～7.3%；特丁津为81.3%～93.7%、RSD为4.8%～6.6%；莠灭净为80.9%～90.9%、RSD为5.7%～7.4%；均三嗪为73.6%～87.3%，RSD为7.1～8.8。而在土壤样品中特丁津回收率为89.1%～95.5%、RSD为4.8%～6.1%；特丁津为86.5%～94.0%、RSD为3.7%～5.7%；莠灭净为85.5%～93.6%、RSD为5.0%～6.5%；均三嗪为75.6%～92.5%，RSD为5.9～7.4，效果令人满意。对比两种萃取模式，发现黄瓜样品的液-液-搅拌棒萃取回收率略低于土壤的直接搅拌棒微萃取模式，这是由于黄瓜样品的液-液-搅拌棒萃取模式中，添加物在黄瓜汁液水相及四氯化碳油相中存在萃取分配平衡因素，造成萃取的目标物有未能完全的进入到油相中而产生损失。

表2加标土样和黄瓜的相对回收率（n=6）

搅拌吸附棒的重复利用性与稳定性

将搅拌棒按优化好的条件对浓度为0.2μg/mL的莠去津及其结构类似物混合物溶液反复按相同程序进行吸附--解吸实验，解析液上HPLC进行检测，计算其待测目标物萃取量的相对误差，以考察SBSE的重复利用性和稳定性。发现SBSE每天使用3次，重复使用21次，其相对误差均小于8.23%，说明制备的印迹搅拌吸附棒具有良好的重现性和稳定性，使用寿命也较长。

同时将搅拌棒放置在非极性溶液正己烷、三氯甲烷、四氢呋喃和极性溶剂甲醇、水、乙酸及0.01M硫酸和0.01M氢氧化钠溶液中连续搅拌（600rpm）浸泡12h后取出做萃取吸附-解析实验考察其在不同极性溶剂和酸碱溶液中的稳定性，其测定结果误差均小于6.2%。表现出较强的耐溶剂性和机械稳定性，能克服涂层型和组合式搅拌棒的涂布和凝胶薄膜在溶剂中易溶胀脱落和机械搅拌稳定性差的缺点。

本研究采用新基质高磁性超顺材料钕铁硼磁粉作为搅拌棒的磁力供给，利用溶胶-凝胶法对磁粉进行四乙氧基硅烷包覆，γ-甲基丙烯酰氧丙基三甲氧基硅表面键合。再通过逐步聚合反应，以莠去津为模板，MAA为功能单体，EDMA为交联剂，制备了一种新型分子印迹整体式吸附萃取搅拌棒。将整体柱材料与吸附萃取搅拌棒技术结合，克服现有的搅拌吸附棒不是均一体，不耐有机溶剂腐蚀，且易脱落，内部的铁芯用量太少不能提供足够的磁力，用量太多会增加搅拌棒的重量不利于使用的不足。制备的整体式磁性分子印迹搅拌棒具有耐有机溶剂、热稳定性高、萃取容量大、萃取和解吸的速度快等特点。将制备的整体式吸附萃取搅拌棒用于土壤和黄瓜样品的吸附萃取，建立了两种搅拌棒吸附溶液中三嗪类除草剂的分析方法：即液液-固相搅拌棒微萃取和直接固相固相搅拌棒微萃取。2种方法加标回收率在73.6%～95.5%之间，达到了满意的萃取分析效果，成功实现了吸附萃取搅拌棒用于极性环境和土壤固体物的吸附萃取。

以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。

Claims (3)

1.一种分子印迹整体搅拌吸附棒的制备方法，其特征在于，按以下步骤制备：

第一步，对磁粉进行二氧化硅包覆和修饰接枝处理；

第二步，配置印迹溶液，并与磁粉混合装填于玻璃管中；

第三步，在70～90℃水浴锅中聚合反应20～40h，反应完成后敲碎外面的玻璃管并进行切割得到一定长度的分子印迹整体搅拌吸附棒；

所述的制备方法还包括：磁粉的预处理：将磁粉在丙酮溶液中处理30min，再在80℃的氢氧化钠碱性溶液中浸泡20min以除去磁粉表面的有机物，取出真空干燥备用；

所述磁粉的二氧化硅包覆：取20g预处理的干燥磁粉分散于50mL丙酮和4mL二次纯水，在常温机械搅拌即500rpm条件下逐滴加入5mL氨水和5mL TEOS即正硅酸乙酯后搅拌反应10h；用磁性分离架分离磁粉，并用二次纯水冲洗，在真空干燥箱中120℃干燥得到包覆有二氧化硅的磁粉；

磁粉的γ-甲基丙烯酰氧丙基三甲氧基硅修饰：取20mmolγ-甲基丙烯酰氧丙基三甲氧基硅溶于甲苯中制成10％(V/V)的溶液，在锥形瓶中将20g经所述TEOS即正硅酸乙酯修饰处理的磁粉浸泡于上述甲苯溶液，室温下振荡反应2h进行γ-甲基丙烯酰氧丙基三甲氧基硅键合修饰；用磁性分离架分离磁粉，甲苯洗涤；并在真空干燥箱中120℃条件下干燥得到修饰过的磁粉；

所述印迹溶液的制备包括：将1mmol莠去津，4mmol的MAA即甲基丙烯酸溶于5mL氯仿中，所述MAA为0.341mL，超声15min后通氮气以去除印迹溶液中的溶解氧，密封静置30分钟进行分子自组装；然后加入30mmol的EDMA即乙二醇二甲基丙烯酸酯5.67mL，0.1g乙基纤维素，超声直到乙基纤维素完全溶解，加入AIBN即2，2′-偶氮二异丁腈，加入所述AIBN的质量是印迹溶液总质量的1％。

2.根据权利要求1所述的一种分子印迹整体搅拌吸附棒的制备方法，其特征在于，磁粉的预处理：将磁粉在丙酮溶液中处理30min，再在80℃的氢氧化钠碱性溶液中浸泡20min以除去磁粉表面的有机物，取出真空干燥备用；所述磁粉的二氧化硅包覆：取20g预处理的干燥磁粉分散于50mL丙酮和4mL二次纯水，在常温机械搅拌即500rpm条件下逐滴加入5mL氨水和5mL TEOS即正硅酸乙酯后搅拌反应10h；用磁性分离架分离磁粉，并用二次纯水冲洗，在真空干燥箱中120℃干燥得到包覆有二氧化硅的磁粉；磁粉的γ-甲基丙烯酰氧丙基三甲氧基硅修饰：取20mmolγ-甲基丙烯酰氧丙基三甲氧基硅溶于甲苯中制成10％(V/V)的溶液，在锥形瓶中将20g经TEOS修饰处理的磁粉浸泡于上述甲苯溶液，室温下振荡反应2h进行γ-甲基丙烯酰氧丙基三甲氧基硅键合修饰；用磁性分离架分离磁粉，甲苯洗涤；并在真空干燥箱中120℃条件下干燥得到修饰过的磁粉；

按以下步骤制备，取所述印迹溶液取480μL，取包覆二氧化硅及修饰接枝的干燥磁粉2.48g，在超声的条件下装填于玻璃管中，先装填溶液再装填磁粉，分6次装填，装填好后超声10min，使其硬实；然后用橡皮塞密封后，放在80℃水浴锅中聚合32h，敲碎玻璃管并切割为一定长度，即得分子印迹整体搅拌吸附棒。

3.根据权利要求1所述的一种分子印迹整体搅拌吸附棒的制备方法，其特征在于，所述的制备方法还包括：第四步，分子印迹整体搅拌吸附棒的模板洗脱处理：依靠磁性棒自身的磁力搅拌作用在甲醇/醋酸，所述甲醇/醋酸的体积比为9：1，洗脱12h，每3h换一次溶液；然后在纯甲醇溶液中洗脱6h，每2h换一次溶液，直至洗脱液在高效液相色谱仪上无杂质峰出现。