CN101445562B - 一种径向流色谱脱除粗多糖中蛋白质的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种径向流色谱脱除粗多糖中蛋白质的方法，所述的方法是将含有蛋白质的粗多糖配成10-30mg/ml水溶液，离心取上清液，所述的上清液经装填有阳离子交换树脂的径向流色谱柱，以纯水为洗脱剂进行洗脱，控制上样流速1～3ml/min，洗脱流速为5～20ml/min，收集洗脱液，直至洗脱液中无糖检测出为止，合并收集的洗脱液经后处理制得纯品多糖。本发明所述方法操作时间短、样品处理量大、蛋白质脱除率高、多糖损失小、适用范围广，可用于植物多糖和真菌多糖脱除蛋白质。
Description
(一)技术领域
本发明属于多糖分离纯化技术领域，具体涉及一种脱除粗多糖中蛋白质的方法。
(二)背景技术
多糖作为一种生物活性制品，一般需要分离纯化到一定纯度后才能更好地发挥作用，尤其是要将其开发成对纯度要求较高的药品时，除去其中所含杂蛋白是一个必不可少的纯化步骤。对于多糖针剂制品而言，更是必须脱除多糖中的蛋白质，否则蛋白质容易成为热敏源。另外，对多糖结构作进一步分析与鉴定时，也要求必须除去蛋白质。活性多糖主要是天然植物多糖和一些真菌多糖，这些多糖组分具有不同的生理、生化效应。
油菜是世界四大油料作物之一，居我国油料作物之首。油菜可提供丰富的食用油，同时，也为饲料工业提供了丰富的菜籽饼粕资源。菜籽饼粕中的化学成分复杂，含多糖、蛋白、植酸、多酚等。研究表明菜籽多糖可通过自身的还原性保护生物体内的其他还原性成分，从而发挥抗氧化作用，另外其还具有降血糖、增进免疫等生物活性。
在众多活性多糖物质中，最令人瞩目的要数真菌多糖，它们存在于香菇、金针菇、黑木耳、灵芝、茯苓、蘑菇和猴头菇等大型食用菌中。灵芝多糖是灵芝中最有效的成分之一，已知的灵芝多种药理活性大多和灵芝多糖有关。灵芝多糖能提高机体免疫力，提高机体耐缺氧能力，消除自由基，抑制肿瘤，抗辐射，提高肝脏、骨髓、血液合成DNA、RNA、蛋白质能力，延长寿命，灵芝多糖还具有刺激宿主非特异性抗性、免疫特异反应以及抑制移植肿瘤生理活性的特性。
目前国内外脱除多糖中蛋白质的方法常用的有：Sevag试剂法、三氟三氯乙烷法、三氯乙酸法(TCA法)、1％鞣酸法，这些方法是向多糖溶液中加入一定比例的有机溶剂，如Sevag试剂、三氯乙酸、三氟乙酸、鞣酸等来达到去除蛋白质的目的；另外常用的方法还有酶-Sevag联用法及大孔树脂吸附法等。其中，Sevag试剂法是经典的脱蛋白方法，其条件比较温和，但此法需反复数十次才能除去尽量多的蛋白质，而且该方法还存在多糖损失严重、有机试剂用量大、耗时较长、成本高等问题；另外，生产过程中分液后，多糖溶液中仍残留有毒性较大的有机溶剂，还需蒸发去除残留的有机溶剂。
径向流色谱法(Radial Flow Chromatography，RFC)是近十年来发展起来的一种新型的色谱分离分析技术。径向流色谱柱由两个多孔渗透树脂玻璃同心圆筒及介于两者之间的色谱分离介质构成，主要包括内、外树脂玻璃圆筒、分离介质、树脂玻璃顶板和底板、以及不锈钢中心流体分布器等组件，采用独特的径向流动设计，流动相携带样品沿径向迁移，不同于传统轴向色谱柱的流体在柱内从一端流向另一端。从而克服了传统色谱技术操作压力高、流速低、在大规模处理时不便放大等缺点，具有操作压力低、流速高、线性放大容易及处理量大等突出优势。
在用色谱法分离纯化生物样品时，为增加制备量，一般需要对柱结构和尺寸进行相应的调整：一是保持色谱柱的长度不变，增加色谱柱的直径；二是保持色谱柱的直径不变，增加色谱柱长度，这两种方法在一定程度上都可以增加样品制备量。然而在传统轴向色谱柱中，随着色谱柱长度的增加，柱压相应增加，样品保留时间延长，对柱子的要求也增加，同时也给实际分离操作带来诸多不变。而对于径向流色谱来说，由于它特殊的径向流动设计，使得其在只增加柱长，保持色谱柱直径不变的情况下，即可线性增大样品处理量，即样品处理规模可在保持相似色谱条件下直接放大，各组分保留时间及分辨情况基本相同。因为保持径向色谱柱的直径不变时，样品通过色谱柱内填料的途径也未改变，因此分离过程基本保持一致；同时，由于色谱柱的长度增加，色谱柱的柱容量也增加，从而处理量就线性增大。
(三)发明内容
现有脱除粗多糖中蛋白质的方法存在有机溶剂消耗数量巨大、多糖损失严重、成本高、操作周期长、污染环境，且对操作人员伤害较大等问题，因此，本发明的目的是提供一种能快速、高效、经济、安全脱除多糖中蛋白质的方法。
本发明的技术方案如下：
本发明提供一种脱除粗多糖中蛋白质的方法，所述的方法是首先将含有蛋白质的粗多糖配成10～30mg/ml水溶液，离心取其上清液，然后将该上清液过装填有阳离子交换树脂的径向流色谱柱，以纯水为洗脱剂进行洗脱，控制上样流速1～3ml/min，洗脱流速为5～20ml/min，收集洗脱液，直至洗脱液中无糖检测出为止，合并收集的洗脱液经后处理制得纯品多糖。
本发明方法的依据是，提取获得的粗多糖在自然pH值下具有其所含多糖一般呈中性而蛋白质带电的性质，可利用离子交换树脂与具有相反电荷的生物分子起相互交换吸附的性质来实现粗多糖中蛋白质的脱除。
优选的方案是，本发明方法中的阳离子交换树脂是经过预处理的弱酸性阳离子交换树脂，具体可选用如德清漂莱特(中国)有限公司提供的C104E阳离子交换树脂、C107E阳离子交换树脂等。所述的预处理方法是：将弱酸性阳离子交换树脂置于2～3％酸水溶液中浸泡2～4小时，纯水洗涤至中性，再置于2～4％碱水溶液中浸泡2～4小时，纯水洗涤至中性，最后置于2～3％酸水溶液中浸泡2～4小时，纯水洗涤至中性。
优选的方案是，本发明方法中所述的酸水溶液选自盐酸溶液或硫酸溶液；碱水溶液选自NaOH溶液或KOH溶液。
优选的方案是，本发明方法中所述的粗多糖选自菜籽多糖或灵芝多糖。
优选的方案是，本发明方法中所述的粗多糖为菜籽粗多糖，其提取方法如下：取经干燥粉碎过的菜籽粕，按菜籽粕、水的质量比1∶20～30的配比加入水，于95～100℃条件下提取2～4小时，过滤，滤液浓缩、浓缩物醇沉、离心、取沉淀物真空冷冻干燥得菜籽粗多糖。
优选的方案是，本发明方法中所述的阳离子交换树脂可再生利用，所述的再生是将阳离子交换树脂用2～4％酸水溶液洗脱30～60分钟，再以纯水洗脱至洗脱液呈中性即可。其中所述的酸水溶液选自盐酸溶液或硫酸溶液。
本发明方法中分别用苯酚-硫酸法和考马斯亮蓝G-250法检测样品液和洗脱液中的多糖及蛋白质含量，从而可计算出多糖回收率和蛋白质脱除率。
与现有技术相比，本发明方法具有如下有益效果：
1、采用本发明所述径向流离子交换色谱法脱除多糖中的蛋白质时，操作时间短(一般只需2～4小时)，蛋白质脱除率高，多糖损失小；
2、操作过程中不使用有机溶剂，条件温和，后续处理方便，环境污染小，对操作人员无伤害；
3、所采用的弱酸性阳离子交换树脂成本低，且可经再生后重复使用，而且再生方法简单；
4、本发明方法采用的径向流色谱法具有操作压力低、流速高、线性放大容易及样品处理量大等突出优势。在样品量增加的情况下，通过按比例增加柱体积和流速，不会增加分离时间，不需要进行操作参数的重新优化，纯化工艺可直接放大；
5、本发明方法适用范围广，可用于植物多糖和真菌多糖脱除蛋白质。
(四)具体实施方式
下面通过实施例，更具体地说明本发明。应当理解，下面的实施例用于说明本发明内容而非限定本发明内容，任何形式上的变通或/和改变都将落入本发明的保护范围。
实施例1
取经干燥粉碎过的菜籽粕，按菜籽粕、水质量比1∶20的配比加入水，于95℃条件下提取2小时，过滤，滤液浓缩、浓缩物醇沉、离心、取沉淀物真空冷冻干燥得菜籽粗多糖。
实施例2
取经干燥粉碎过的菜籽粕，按菜籽粕、水质量比1∶30的配比加入水，于100℃条件下提取4小时，过滤，滤液浓缩、浓缩物醇沉、离心、取沉淀物真空冷冻干燥得菜籽粗多糖。
实施例3
(一)仪器和试剂：
径向流色谱柱(容积250ml，美国Sepragen公司)、恒流泵(BT00-300M，保定兰格恒流泵有限公司)、烧杯；
C104E、C107E弱酸性阳离子交换树脂(德清漂莱特(中国)有限公司提供)；
菜籽粗多糖(实施例1、2所得)，灵芝多糖(浙江益圣菌物发展有限公司提供)；
盐酸溶液、硫酸溶液、氢氧化钠、氢氧化钾，均为分析纯。
(二)具体操作过程如下：
1、树脂预处理：将德清漂莱特(中国)有限公司提供的C104E阳离子交换树脂置于3％盐酸溶液中浸泡4小时，纯水洗涤至中性，然后再将树脂置于2％NaOH溶液中浸泡2小时，纯水洗涤至中性，最后再将树脂置于3％盐酸中浸泡4小时，纯水洗涤至中性；
2、装填径向流色谱柱：将处理好的阳离子交换树脂装填于径向流色谱柱中，径向柱内填料体积为250ml；
3、上样：取实施例1的菜籽粗多糖配制成20mg/ml水溶液，离心取其上清液，然后将上清液过径向流色谱柱，上样流速为1ml/min，上样量为38.0ml(含多糖86.0mg、蛋白质116.1mg)，粗多糖水溶液pH值为提取时自然pH值；
4、洗脱：上样后，用纯净水于5ml/min流速下洗脱，自动收集仪收集洗脱液，3小时后收集的洗脱液中多糖未检出，停止洗脱；
5、合并收集的洗脱液，用苯酚-硫酸法检测多糖含量，用考马斯亮蓝G-250法检测蛋白质含量。
多糖回收率及蛋白质脱除率分别为：81.4％，99.7％。
实施例4
其它操作同实施例3，不同之处在于：
树脂预处理：将C107E阳离子交换树脂置于2％硫酸溶液中浸泡2小时，纯水洗涤至中性，然后再将树脂置于4％KOH溶液中浸泡4小时，纯水洗涤至中性，最后再将树脂置于2％硫酸中浸泡2小时，纯水洗涤至中性。
上样步骤中：取实施例2的菜籽粗多糖配成浓度为20mg/ml的溶液；上样流速为3ml/min；上样量为100ml(含多糖219.9mg、蛋白质422.9mg)。
洗脱步骤中：洗脱流速20ml/min；3.7小时后收集的洗脱液中多糖未检出，停止洗脱。
多糖回收率及蛋白质脱除率分别为：87.9％，90.8％。
实施例5
将实施例3所用弱酸性阳离子交换树脂再生，再生过程为将阳离子交换树脂用3％盐酸溶液动态洗脱60分钟，再用纯水洗脱至洗脱液中性即可。
实施例6
其它操作同实施例3，不同之处在于：
使用实施例5再生后的交换树脂填装径向流色谱柱。
上样步骤中：上样浓度为10mg/ml，上样量为38ml(含多糖51.6mg、蛋白质67.3mg)。
洗脱步骤中：洗脱耗时3.0小时。
多糖回收率及蛋白质脱除率分别为78.5％，93.7％。
实施例7
将实施例4所用弱酸性阳离子交换树脂再生，再生过程为将阳离子交换树脂用2％硫酸溶液动态洗脱30分钟，再用纯水洗脱至洗脱液中性即可。
实施例8
其它操作同实施例3，不同之处在于：
使用实施例7再生后的交换树脂填装径向流色谱柱。
上样步骤中：取实施例2的菜籽粗多糖配成浓度为30mg/ml的溶液；上样流速为3ml/min；上样量为100ml(含多糖332.5mg、蛋白质643.0mg)。
洗脱步骤中：洗脱流速20ml/min；洗脱耗时2.7小时。
多糖回收率及蛋白质脱除率分别为：84.7％，87.5％。
实施例9
其它操作同实施例3，不同之处在于：
上样步骤中：取灵芝粗多糖配制成10mg/ml水溶液，离心取其上清液，然后将上清液过径向流色谱柱，上样流速为2ml/min，上样量为50.0ml(含多糖134.5mg、蛋白质59.9mg)；
多糖回收率及蛋白质脱除率分别为：82.4％，89.1％。
比较实施例1
其它操作同实施例3，不同之处在于：
将实施例3中的径向色谱换成轴向色谱。
上样步骤中：取实施例1的菜籽粗多糖配制成20mg/ml水溶液，离心取其上清液，然后将上清液过径向流色谱柱，上样流速为1ml/min，上样量为38.0ml(含多糖84.9mg、蛋白质102.0mg)。
洗脱步骤中：洗脱流速为1ml/min，3.5小时后收集的洗脱液中多糖未检出，停止洗脱。
多糖回收率及蛋白脱除率的测定结果见表1。
比较实施例2
其它操作同实施例4，不同之处在于：
将实施例4中的径向色谱换成轴向色谱。
上样步骤中：取实施例2的菜籽粗多糖配成浓度为20mg/ml的溶液；上样流速为2ml/min；上样量为100ml(含多糖215.0mg、蛋白质315.5mg)。
洗脱步骤中：洗脱流速10ml/min；4.5小时后收集的洗脱液中多糖未检出，停止洗脱。
多糖回收率及蛋白脱除率的测定结果见表1。
表1径向与轴向阳离子交换树脂脱蛋白效果比较
注：径向色谱和轴向色谱装柱量均为250ml。
表格1所示的检测结果标明：径向流色谱分离菜籽粗多糖中蛋白质脱除率高，速度快，对多糖回收率影响较小。
Claims (6)
1.一种脱除粗多糖中蛋白质的方法，所述的方法是将含有蛋白质的粗多糖配成10-30mg/ml水溶液，离心取上清液，所述的上清液经装填有阳离子交换树脂的径向流色谱柱，以纯水为洗脱剂进行洗脱，控制上样流速1～3ml/min，洗脱流速为5～20ml/min，收集洗脱液，直至洗脱液中无糖检测出为止，合并收集的洗脱液经后处理制得纯品多糖；所述的粗多糖选自菜籽多糖或灵芝多糖。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述的阳离子交换树脂为经预处理过的弱酸性阳离子交换树脂，所述的预处理方法是：将弱酸性阳离子交换树脂置于2～3％酸水溶液中浸泡2～4小时，纯水洗涤至中性，再置于2％～4％碱水溶液中浸泡2～4小时，纯水洗涤至中性，最后置于2～3％酸水溶液中浸泡2～4小时，纯水洗涤至中性。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于：所述的酸水溶液选自盐酸溶液或硫酸溶液；碱水溶液选自NaOH溶液或KOH溶液。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的菜籽粗多糖的提取方法如下：取菜籽粕，按菜籽粕、水的质量比1∶20～30的配比加入水，于95～100℃条件下提取2～4小时，过滤，滤液浓缩、浓缩物醇沉、离心、取沉淀物真空冷冻干燥得菜籽粗多糖。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的阳离子交换树脂再生利用，所述的再生是将阳离子交换树脂用2～4％酸水溶液洗脱30～60分钟，再以纯水洗脱至洗脱液呈中性即可。
6.权利要求5所述的方法，其特征在于：所述的酸水溶液选自盐酸溶液或硫酸溶液。
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