CN109535274B - 一种蒲菜多糖脱蛋白脱色的方法 - Google Patents

一种蒲菜多糖脱蛋白脱色的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种蒲菜多糖脱蛋白脱色的方法，即采用离子交换树脂螯合金属离子后脱除蒲菜多糖中的蛋白质和色素：首先通过金属离子(Zn2+)螯合LKC100型树脂，再用螯合后的树脂在最佳吸附参数下吸附蒲菜多糖中的蛋白质和色素。该方法不仅不消耗任何有毒有害的有机溶剂，而且脱蛋白脱色性能好，多糖保留率高，操作安全方便，脱蛋白脱色时间短，效率高。

Description

一种蒲菜多糖脱蛋白脱色的方法
技术领域
本发明属于分离纯化技术领域，具体涉及一种在蒲菜多糖提取过程中脱蛋白脱色的方法。
背景技术
多糖具有复杂的结构和多方面的生物活性。近年来因其在免疫调节、抗癌抗病毒等方面表现出显著的药理活性而逐渐被人们重视，并广泛应用于肿瘤化疗。然而多糖中常伴随蛋白质、色素等杂质，阻碍多糖的纯化分级、结构鉴定和药理活性分析。因此如何尽量多地去除蛋白质、色素等杂质同时尽可能地保留多糖成为研究多糖的突出性问题。
蒲菜多糖来源于蛋白质丰富的食用蒲菜，其多糖中蛋白质杂质的质量浓度高达1.13%。因此，必须采用适当的方法将其蛋白质充分脱除后才能进行进一步开发。然而，依照经典Sevage法脱蛋白，消耗了大量的氯仿和正丁醇，产生大量有毒有机污染物，难以商业化生产蒲菜多糖，并且由于高含量的有毒有机溶剂残留，此方法也不适合食品和制药等领域的应用。因此开发一种在蒲菜多糖提取过程中新型环保的脱蛋白脱色方法是非常有必要的。
发明内容
针对现有技术存在的不足，本发明的目的在于提供解决上述问题的一种在蒲菜多糖提取过程中脱蛋白脱色的方法，整个过程不使用任何有机溶剂，绿色无污染，脱蛋白率、脱色率高，多糖保留率高，操作安全、方便，时间短，效率高。
为实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：
一种蒲菜多糖脱蛋白脱色的方法，利用离子交换树脂螯合金属离子后在蒲菜多糖提取过程中脱除蛋白质和色素；其工艺步骤包括：
（1）蒲菜多糖提取：取新鲜食用蒲菜榨成汁，汁液过滤去渣，离心、收集上清减压旋蒸浓缩至原体积的1/4，加入3倍体积的无水乙醇振荡混匀，置于冰箱4 ℃静置过夜，次日离心弃上清，加适量去离子水复溶沉淀后充分混合，减压旋蒸以去除残留乙醇，即得蒲菜多糖溶液，4 ℃避光保存备用；
（2）Zn2+螯合树脂的制作：称取硫酸锌于锥形瓶中，溶于去离子水，搅拌混匀后加入LKC100型树脂，硫酸锌与去离子水按重量体积比g/ml为1:40，硫酸锌：树脂重量比1：1，混合液置于恒温摇床中震荡，再用滤布过滤混合液，滤出Zn2+螯合树脂，用蒸馏水冲洗至上清液无肉眼可见杂质，即为Zn2+螯合树脂；
（3）脱色脱蛋白处理：
静态吸附法：用去离子水将步骤（1）中的蒲菜多糖溶液稀释至1.0~2.5 mg mL -1，将步骤（2）所得Zn2+螯合树脂与稀释后的蒲菜多糖溶液以体积比1：10混合，在恒温气浴摇床中振荡一定时间，用滤布过滤分离树脂和蒲菜多糖溶液，滤液即为脱色脱蛋白蒲菜多糖溶液；
或动态吸附法：用去离子水将步骤（1）中的蒲菜多糖溶液稀释至1.0~2.5 mg mL-1，将步骤（2）所得Zn2+螯合树脂湿法装柱，以一定的上样径高比和上样流速进行动态吸附。
本发明进一步改进技术方案是，静态吸附法最佳参数为：在30 ℃恒温气浴摇床中120 rpm min -1振荡30~60 min。用200目滤布过滤分离树脂和蒲菜多糖溶液。
本发明进一步改进技术方案是，动态吸附法最佳参数为：树脂上样径高比为1:15~20，以0.75~2.5 BV h -1流速进行动态吸附20 min，然后用两倍体积的去离子水淋洗，合并脱蛋白脱色的蒲菜多糖溶液和去离子水洗脱液。
本发明进一步改进技术方案是，步骤（2）中恒温摇床设置30℃，120 rpm震荡1 h。
本发明有益效果：
本发明利用LKC100型树脂能吸附Zn2+，且蛋白质表面的氨基酸残基能与金属离子Zn2+形成复合物，从而使蛋白质分子结合在树脂上；又因蒲菜多糖的色素与蛋白质结合在一起，从而使蛋白质、色素能与蒲菜多糖分离。不仅相对于经典Sevage法脱蛋白率、脱色率和多糖保留率均较高，而且过程不消耗任何有机溶剂，绿色无污染，是用于蒲菜多糖脱除蛋白质和色素的新型环保方法。
具体实施方式
下面通过实施例详述本发明的技术解决方案，但本发明的技术解决方案并不限于下面的实施例。
实施例1：
依以下步骤对蒲菜多糖溶液进行脱蛋白脱色处理：
（1）蒲菜多糖提取：取市售新鲜食用蒲菜于榨汁机中榨成汁，汁液过100目滤布去渣，4000 g离心30 min，收集上清减压旋蒸浓缩至原体积的1/4，加入3倍体积的无水乙醇振荡混匀，置于冰箱4 ℃静置过夜；次日4000 g离心20 min，弃上清，加适量去离子水复溶沉淀后充分混合，减压旋蒸以去除残留乙醇，即得蒲菜多糖溶液。用经典的硫酸苯酚法测定蒲菜多糖溶液中总糖的质量浓度，4 ℃避光保存备用；
（2）Zn2+螯合树脂的制作：称取15 g硫酸锌于1000 mL锥形瓶中，溶于600 mL去离子水，搅拌混匀后加入15 g LKC100型树脂，置于30 ℃恒温摇床中，120 rpm震荡1 h。用200目滤布过滤混合液，滤出Zn2+螯合树脂，用去离子水冲洗20~30次，至上清液无肉眼可见杂质，即为Zn2+螯合树脂。其中，LKC100型树脂，购于艾美科健（中国）生物医药有限公司；
（3）脱蛋白脱色处理：
静态吸附法吸附：用去离子水将步骤（1）中的蒲菜多糖溶液稀释至1.5 mg mL -1，将Zn2+螯合树脂与稀释后的蒲菜多糖溶液（初始pH为7.0）以1:10（v/v）混合，在30 ℃恒温气浴摇床中120 rpm min-1振荡30 min，用200目滤布过滤分离树脂和蒲菜多糖溶液，滤液即为脱蛋白脱色蒲菜多糖溶液。
动态吸附法吸附：用去离子水将步骤（1）中的蒲菜多糖溶液稀释至1.5 mg mL -1。将螯合后的LKC100湿树脂湿法装柱，树脂上样径高比为1:15，以1.5 BV h -1流速进行动态吸附20 min，然后用2 BV的去离子水淋洗，合并脱蛋白脱色的蒲菜多糖溶液和去离子水洗脱液。
该实施例1所得产品为实验组产品。与此同时，同批次的蒲菜多糖溶液，采用Sevage法处理，所得的脱蛋白蒲菜多糖溶液为对照组产品。采用苯酚硫酸法和考马斯亮蓝法分别测定蒲菜多糖溶液脱蛋白脱色前后各自的脱蛋白率（Dr %）、脱色率（Cr %）、多糖保留率（Rr %）及综合吸附效应指数（ξ %=0.4×Dr %+0.3×Cr %+0.3×Rr %）及有机溶剂的消耗量，结果见表1。
实施例2：
依以下步骤对蒲菜多糖溶液进行脱蛋白脱色处理：
（1）蒲菜多糖提取：蒲菜多糖溶液的制备同实施例1；
（2）Zn2+螯合树脂的制作：Zn2+螯合树脂的制作方法同实施例1；
（3）脱蛋白脱色处理：
静态吸附法吸附：用去离子水将步骤（1）中的蒲菜多糖溶液稀释至1.5 mg mL -1，将Zn2+螯合树脂与稀释后的蒲菜多糖溶液（初始pH为7.0）以1:10（v/v）混合，在30 ℃恒温气浴摇床中120 rpm min -1振荡60 min，用200目滤布过滤分离树脂和蒲菜多糖溶液。滤液即为脱蛋白脱色蒲菜多糖溶液。
动态吸附法吸附：用去离子水将步骤（1）中的蒲菜多糖溶液稀释至1.5 mg mL -1，将螯合后的LKC100湿树脂湿法装柱，树脂上样径高比为1:15，以0.75 BV h -1流速进行动态吸附20 min，然后用2 BV的去离子水淋洗，合并脱蛋白脱色的蒲菜多糖溶液和去离子水洗脱液。
该实施例2所得产品为实验组产品。与此同时，同批次的蒲菜多糖溶液，采用Sevage法处理，所得的脱蛋白蒲菜多糖溶液为对照组产品。采用苯酚硫酸法和考马斯亮蓝法分别测定蒲菜多糖溶液脱蛋白脱色前后各自的脱蛋白率（Dr %）、脱色率（Cr %）、多糖保留率（Rr %）及综合吸附效应指数（ξ %=0.4×Dr %+0.3×Cr %+0.3×Rr %）及有机溶剂的消耗量，结果见表1。
实施例3：
依以下步骤对蒲菜多糖溶液进行脱蛋白脱色处理：
（1）蒲菜多糖提取：蒲菜多糖溶液的制备同实施例1；
（2）Zn螯合树脂的制作：Zn2+螯合树脂的制作方法同实施例1；
（3）脱蛋白脱色处理：
静态吸附法吸附：用去离子水将步骤（1）中的蒲菜多糖溶液稀释至2.5 mg mL -1，将Zn2+螯合树脂与稀释后的蒲菜多糖溶液（初始pH为7.0）以1:10（v/v）混合，在30 ℃恒温气浴摇床中120 rpm min -1振荡30 min。用200目滤布过滤分离树脂和蒲菜多糖溶液。滤液即为脱蛋白脱色蒲菜多糖溶液。
动态吸附法吸附：用去离子水将步骤（1）中的蒲菜多糖溶液稀释至2.5 mg mL -1。将螯合后的LKC100湿树脂湿法装柱，树脂上样径高比为1:10，以1.5 BV h -1流速进行动态吸附20 min，然后用2 BV的去离子水淋洗，合并脱蛋白脱色的蒲菜多糖溶液和去离子水洗脱液。
该实施例3所得产品为实验组产品。与此同时，同批次的蒲菜多糖溶液，采用Sevage法处理，所得的脱蛋白蒲菜多糖溶液为对照组产品。采用苯酚硫酸法和考马斯亮蓝法分别测定蒲菜多糖溶液脱蛋白脱色前后各自的脱蛋白率（Dr %）、脱色率（Cr %）、多糖保留率（Rr %）及综合吸附效应指数（ξ %=0.4×Dr %+0.3×Cr %+0.3×Rr %）及有机溶剂的消耗量，结果见表1。
Figure 69694DEST_PATH_IMAGE002
表1检测结果可见，实验组A、实验组B相比对照组，整体脱蛋白率（Dr %）、脱色率（Cr %）、多糖保留率（Rr %）及综合吸附效应指数（ξ %）均有显著提高，且本发明方案无有机溶剂的消耗。

Claims (4)

1.一种蒲菜多糖脱蛋白脱色的方法，其特征在于：利用离子交换树脂螯合金属离子后在蒲菜多糖提取过程中脱除蛋白质和色素；其工艺步骤包括：
（1）蒲菜多糖提取：取新鲜食用蒲菜榨成汁，汁液过滤去渣，离心、收集上清减压旋蒸浓缩至原体积的1/4，加入3倍体积的无水乙醇振荡混匀，置于冰箱4 ℃静置过夜，次日离心弃上清，加适量去离子水复溶沉淀后充分混合，减压旋蒸以去除残留乙醇，即得蒲菜多糖溶液，4 ℃避光保存备用；
（2）Zn2+螯合树脂的制作：称取硫酸锌于锥形瓶中，溶于去离子水，搅拌混匀后加入LKC100型树脂，硫酸锌与去离子水按重量体积比g/ml为1:40，硫酸锌：树脂重量比1：1，混合液置于恒温摇床中震荡，再用滤布过滤混合液，滤出Zn2+螯合树脂，用蒸馏水冲洗至上清液无肉眼可见杂质，即为Zn2+螯合树脂；
（3）脱色脱蛋白处理：
静态吸附法：用去离子水将步骤（1）中的蒲菜多糖溶液稀释至1.0~2.5 mg mL -1，将步骤（2）所得Zn2+螯合树脂与稀释后的蒲菜多糖溶液以体积比1：10混合，在恒温气浴摇床中振荡一定时间，用滤布过滤分离树脂和蒲菜多糖溶液，滤液即为脱色脱蛋白蒲菜多糖溶液；
或动态吸附法：用去离子水将步骤（1）中的蒲菜多糖溶液稀释至1.0~2.5 mg mL -1，将步骤（2）所得Zn2+螯合树脂湿法装柱，以一定的上样径高比和上样流速进行动态吸附。
2.根据权利要求1所述的一种蒲菜多糖脱蛋白脱色的方法，其特征在于：静态吸附法最佳参数为：在30 ℃恒温气浴摇床中120 rpm振荡30~60 min，用200目滤布过滤分离树脂和蒲菜多糖溶液。
3.根据权利要求1所述的一种蒲菜多糖脱蛋白脱色的方法，其特征在于：动态吸附法最佳参数为：树脂上样径高比为1:15~20，以0.75~2.5 BV h -1流速进行动态吸附20 min，然后用两倍体积的去离子水淋洗，合并脱蛋白脱色的蒲菜多糖溶液和去离子水洗脱液。
4.根据权利要求1所述的一种蒲菜多糖脱蛋白脱色的方法，其特征在于：步骤（2）中恒温摇床设置30℃，120 rpm震荡1 h。
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