CN106883310B - 一种状元豆多糖脱色脱蛋白的纯化方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种状元豆多糖脱色脱蛋白的纯化方法。其步骤是：状元豆提取得到状元豆粗多糖；D113弱酸性阳离子交换树脂的预处理，去离子水反复浸洗至水澄清无褐色，选取玻璃层析柱，湿法装柱，先用碱和去离子水至pH值为7，后用酸和去离子水洗至pH值为7，去离子水浸泡备用；采用D113弱酸性阳离子交换树脂，以质量浓度为4.0～4.5mg/mL，pH值为5.3～5.8，2.7～3.2BV体积加入状元豆粗多糖，1.4～1.9mL/min流速操作，去除蛋白，脱色，保留多糖。本发明操作步骤简单，对多糖结构影响小，成本低、环保、吸附快且容量大，树脂可重复使用。

Description

一种状元豆多糖脱色脱蛋白的纯化方法

技术领域

本发明涉及一种状元豆多糖脱色脱蛋白的纯化方法。

背景技术

目前多糖脱色脱蛋白方法主要有：酶法、有机试剂法(Sevage法、三氯乙酸法等)、吸附法(活性炭法、大孔树脂法等)、过氧化氢氧化法等。其中有机试剂法存在重复次数多、试剂用量大等问题，酶法存在成本较高，且灭活温度高易破坏多糖结构破坏活性等问题，过氧化氢存在易造成多糖降解等问题，活性炭存在脱色时间长，多糖损失量大等问题。而大孔树脂法主要通过范德华力作用或离子交换结合蛋白、色素达到目的，操作步骤简单，对多糖结构影响小，且树脂具有价廉、环保、选择性好、操作简单、吸附快且容量大及可重复使用等优点。

发明内容

基于目前尚未见脱除状元豆粗多糖中色素、蛋白质的研究报道，本发明的目的在于提供一种状元豆多糖脱色脱蛋白的纯化方法，具有操作步骤简单，对多糖结构影响小，且成本低、环保、吸附快且容量大等优点。

为了达成上述目的，本发明的解决方案是：

一种状元豆多糖脱色脱蛋白的纯化方法，其步骤如下：

第一步，状元豆多糖的提取：

将烘干至恒重的状元豆，粉碎过40目筛，索氏提取器中回流4h，回流提取溶剂为乙酸乙酯，回流提取2次，除酯类物质，取出，通风干燥；

上述获得的去脂状元豆粉末在超声波装置中水浴提取2h，回流提取3次，再离心取上清液；

上清液在旋转蒸发仪中浓缩至含水率为10％±1％，加入乙醇沉淀多糖，4℃冰箱冷藏过夜，4500r/min 离心15min取沉淀物，依次用无水乙醇、丙酮、乙醚洗涤，低温干燥得到状元豆粗多糖；

第二步，D113弱酸性阳离子交换树脂的预处理：

去离子水反复浸洗至水澄清无褐色，选取玻璃层析柱，湿法装柱，先用碱溶液洗脱，再去离子水洗至pH值为7±0.2，接着用酸溶液洗脱后，去离子水洗至pH值为7±0.2，去离子水浸泡备用；

第三步，状元豆多糖脱色脱蛋白的纯化：

采用D113弱酸性阳离子交换树脂，以质量浓度为4.0～4.5mg/mL，pH值为5.3～5.8，2.7～3.2BV 体积加入状元豆粗多糖，1.4～1.9mL/min流速操作，去除蛋白，脱色，保留多糖。

所述第一步，状元豆粉末：乙酸乙酯(g:mL)＝1：200-220，沸点60℃。

所述第一步，去脂状元豆粉末：水(g:mL)＝1：30-40，超声功率300W，超声温度50℃，超声时间40min，离心4500r/min，15min。

所述第一步，旋转蒸发仪转速120r/min，65℃水浴；离心；无水乙醇、丙酮、乙醚洗涤用量为沉淀物的2-3倍(m/v)；低温干燥温度在40℃以下，在真空干燥箱中进行。

所述第三步，纯化操作后，用20～40％乙醇配制的0.5～2.0mol/L盐酸，以1.0～3.0mL/min流速洗脱1.0～2.5h后，使树脂再生。

采用上述方法后，本发明利用D113弱酸性阳离子交换树脂(大孔树脂)对状元豆多糖进行脱色脱蛋白，蛋白去除率达89.37～91.11％，脱色率达85.51～87.69％，多糖保留率达93.82～95.22％，可有效提高脱色和脱蛋白率，降低生产成本，减少有机溶剂的使用，同时可最大限度地保护多糖结构，为状元豆粗多糖初步纯化和后期状元豆多糖理化性质及生物活性等研究提供科学依据。

与各种其他方法(酶法、Sevage法、活性炭法、TCA法、H₂O₂等)和静态纯化操作相比，避免了使用有机溶剂，操作简单省时，工艺安全、环保、经济、成本低、吸附快且容量大，树脂可循环再利用，且经其处理后的状元豆多糖更有利于进一步的功能活性研究。

附图说明

图1是不同再生法的再生效果图。

具体实施方式

本发明以脱色率、蛋白脱除率和多糖保留率为综合评价指标，并引入了综合效应指数客观评价10种大孔树脂对状元豆粗多糖蛋白和色素吸附性能，筛选出效果最佳的树脂，在此基础上，通过单因素试验及利用Design-Expert软件对D113大孔树脂的脱色脱蛋白工艺条件进行分析优化，并对D113树脂再生条件的进行了考察。

本发明的具体步骤是：

一、状元豆多糖的提取

将105℃烘干至恒重的状元豆，粉碎过40目筛，索氏提取器中回流4h，除酯类物质，取出，通风干燥。回流提取溶剂为乙酸乙酯，回流提取2次。状元豆粉末：乙酸乙酯(g:mL)＝1：200-220，沸点60℃。

获得的去脂状元豆粉在超声波装置中水浴提取2h，回流提取3次，离心取上清液。其中去酯状元豆粉末：水＝1：30-40(g:ml)，超声功率300W，超声温度50℃，超声时间40min，离心4500r/min，15min。

上清液在旋转蒸发仪中浓缩至含水率为10％左右，加入乙醇沉淀多糖，4℃冰箱冷藏过夜，4500r/min 离心15min取沉淀物，低温干燥得到状元豆粗多糖。旋转蒸发仪转速120r/min，65℃水浴；沉淀多糖的乙醇用量是4倍量溶液体积，95％浓度；沉淀物依次用无水乙醇、丙酮、乙醚洗涤，低温干燥得到状元豆粗多糖。无水乙醇、丙酮、乙醚洗涤用量为沉淀物的2-3倍(m/v)；低温干燥温度在40℃以下，在真空干燥箱中进行。

二、状元豆多糖脱色脱蛋白试验

(1)树脂预处理及筛选试验

大孔吸附树脂(DA201、AB-8、D-101、HPD100)：去离子水反复浸洗至无泡沫，选取(Φ30mm×650mm) 玻璃层析柱，湿法装柱，用95％乙醇以0.5mL/min洗脱至流出液加等量去离子水不变浑浊后，去离子水洗脱至无醇味。去离子水浸泡备用。

阴(阳)离子交换树脂(D152、D113、D061、D301R、D370、D290)：去离子水反复浸洗至水澄清无褐色，选取(Φ30mm×650mm)玻璃层析柱，湿法装柱，先用5％NaOH(HCl)溶液以0.5mL/min洗脱8h，再去离子水洗至pH值为6～7，接着用5％HCl(NaOH)溶液以0.5mL/min洗脱8h后去离子水洗至pH值为7左右，去离子水浸泡备用。

分别称取预处理好的10种树脂各2.0g，置于150mL具塞磨口锥形瓶中，依次加入30.0mL，5mg/mL的状元豆粗多糖，振荡(25℃，120r/min，6h)，吸附。

(2)用吸光度法测多糖、色素及蛋白质含量

取供试样品液，用蒸馏水定容至2mL，加入 体积分数5％苯酚溶液1.0mL和浓硫酸5mL，充分混匀，室温静置30min，于490nm波长处测定吸光度。根据吸光度(A)和葡萄糖质量浓度(C)的回归方程：C＝0.13339 A-0.0007(R²＝0.9996)，计算多糖质量浓度。

以蒸馏水作参比，对状元豆多糖提取液和脱色后的溶液进行紫外全波长扫描，结果发现无最大吸收波长。于200～600nm波长范围内每隔10nm测定吸光度，计算脱色率平均值，以最接近该平均值的420nm作为测定波长，测定状元豆多糖脱色前、后的吸光值。

取供试样品液，用蒸馏水定容至1mL，再加入5.0mL考马斯亮蓝备用液，静置15min，蒸馏水作空白对照，于595nm波长处测吸光度，根据吸光度(A)和牛血清蛋白质量浓度(C)的回归方程：A ＝0.0082C+0.0306(R²＝0.9953)，计算蛋白质浓度。

综合吸附效应指数ζ(0≤ζ≤1)，ζ＝0.3X1(脱色率)+0.3X2(脱蛋白率)+0.4X3(多糖保留率)，即为树脂的脱色率、蛋白去除率以及多糖保留率的加权和，其值越大表明树脂的综合处理能力越好。

测定各树脂平衡液吸光度并计算脱色率、蛋白去除率、多糖保留率及ζ值，比较筛选出最佳的树脂。结果如表1。

表1 10种树脂对状元豆粗多糖吸附性能比较

注：同一列中不同英文字母表示差异显著(P<0.05)。

(3)D113树脂单因素试验

室温条件下，玻璃层析柱(Φ15mm×500mm)中湿法装入预处理好的D113树脂(10.0g)，取粗多糖上柱，依次考察上样液质量浓度(1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0mg/mL)，上样液pH值(3.0、4.0、 5.0、6.0、7.0、8.0、9.0)，上样流速(1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0mL/min)，上样体积(1.0、 2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0BV)对树脂脱色脱蛋白效果的影响。部分收集器收集，用步骤(2)方法测定所得状元豆多糖中的各吸光度。

(4)D113树脂优化试验

在单因素试验结果基础上，采用软件Design-Expert8.0.6中的Box-Behnken设计试验，以综合吸附效应指数ζ为响应值，以A上样液质量浓度(3.0、4.0、5.0mg/mL)，B上样液pH值(4.0、5.0、6.0)，C上样流速(1.0、1.5、2.0mL/min)和D上样体积(2.0、3.0、4.0BV)四个因素为自变量，建立多元二次方程：ζ＝+89.93-0.13A+4.93B+2.44C-1.67D+2.60AB+1.39AC-3.43AD-0.70BC+0.19BD-2.60CD-9.04A²-5.40B²-5 .47C²-10.75D²。

(5)D113树脂再生条件试验

向三角瓶中加入已吸附饱和的D113树脂各5g，依次加入1mol/L NaOH和HCl、乙醇(10％、20％、30％、 40％、50％)和乙醇(10％、20％、30％、40％、50％)配制的1mol/L HCl各50mL。恒温振荡(25℃，120r/min，12h)，洗脱，取样，用步骤(2)方法测定溶液在420nm和595nm处的吸光度值。结果如图1。

本发明所产生的有益效果：目前大多关于树脂对多糖脱色脱蛋白效果的研究，主要从树脂种类、上样质量浓度、上样及洗脱流速等单因素方面研究分析试验条件对脱色脱蛋白的效果，未考虑各单因素的相互作用；或结合传统正交设计，但因其是一种线性数学模型只能分析离散型数据，这些都对多糖脱色脱蛋白效果有较大的局限性。而响应面法(RSM)采用非线性模型拟合响应值与各因素之间的函数关系，能求得高精度的多元二次回归方程，并通过合理预测分析来寻求最佳纯化工艺参数。本发明优化的工艺可在 69.6-74.4min(平均为72.5min)内处理质量浓度为4.0～4.5mg/mL(平均为4.1mg/mL)的状元豆多糖溶液2.7～3.2BV(1BV≈50mL，平均为145mL)，蛋白去除率、脱色率和多糖保留率分别达89.37～91.11％[平均为(90.24±0.87)％]、85.51～87.69％[平均为(86.60±1.09)％]]和93.82～95.22％[平均为(94.07± 1.15)％]；相比采用D113树脂对虫草粗多糖动态吸附处理，即120min(3BV/1.5BV﹒h^-1)处理质量浓度为 2.8mg/mL的虫草多糖溶液75mL(1BV为25mL)，其脱蛋白率为(85.0±2.0)％，脱色率为(85.1±1.9)％和多糖保留率为(80.2±2.2)％，本发明优化的工艺处理容量更大(约1.83倍)，操作更省时(约0.4倍)，并且蛋白去除率、脱色率和多糖保留率分别提高了6.17％、1.76％和14.74％。因此本发明方法也将为对其他植物类多糖脱色脱蛋白提供一定的参考。

Claims (4)

1.一种状元豆多糖脱色脱蛋白的纯化方法，其特征在于步骤如下：

第一步，状元豆多糖的提取：

将烘干至恒重的状元豆，粉碎过40目筛，索氏提取器中回流4h，回流提取溶剂为乙酸乙酯，回流提取2次，除酯类物质，取出，通风干燥；

上述获得的去酯状元豆粉末在超声波装置中水浴提取2h，回流提取3次，再离心取上清液；

上清液在旋转蒸发仪中浓缩至含水率为10％±1％，加入乙醇沉淀多糖，4℃冰箱冷藏过夜，4500r/min离心15min取沉淀物，依次用无水乙醇、丙酮、乙醚洗涤，低温干燥得到状元豆粗多糖；

第二步，D113弱酸性阳离子交换树脂的预处理：

去离子水反复浸洗至水澄清无褐色，选取玻璃层析柱，湿法装柱，先用碱溶液洗脱，再去离子水洗至pH值为7±0.2，接着用酸溶液洗脱后，去离子水洗至pH值为7±0.2，去离子水浸泡备用；

第三步，状元豆多糖脱色脱蛋白的纯化：

采用D113弱酸性阳离子交换树脂，以质量浓度为4.0～4.5mg/mL，pH值为5.3～5.8，2.7～3.2BV体积加入状元豆粗多糖，1.4～1.9mL/min流速操作，去除蛋白，脱色，保留多糖。

2.如权利要求1所述的一种状元豆多糖脱色脱蛋白的纯化方法，其特征在于：所述第一步，去酯状元豆粉末：水的质量体积比＝1：30-40g:mL，超声功率300W，超声温度50℃，超声时间40min，离心4500r/min，15min。

3.如权利要求1所述的一种状元豆多糖脱色脱蛋白的纯化方法，其特征在于：所述第一步，旋转蒸发仪转速120r/min，65℃水浴；低温干燥温度在40℃以下，在真空干燥箱中进行。

4.如权利要求1所述的一种状元豆多糖脱色脱蛋白的纯化方法，其特征在于：所述第三步，纯化操作后，用20～40％乙醇配制的0.5～2.0mol/L盐酸，以1.0～3.0mL/min流速洗脱1.0～2.5h后，使树脂再生。