CN109053914A - 一种蛹虫草粗多糖一步法脱色与除蛋白的纯化工艺 - Google Patents

一种蛹虫草粗多糖一步法脱色与除蛋白的纯化工艺 Download PDF

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郭丽琼
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Abstract

本发明公开了一种蛹虫草粗多糖一步法脱色与除蛋白的纯化工艺。所述纯化工艺包括如下过程：S1.制备蛹虫草粗多糖样品；S2.利用强极性大孔吸附树脂制备层析柱；S3.将蛹虫草粗多糖样品稀释为浓度0.01mg/mL～5mg/mL，然后过层析柱，控制样品流速为0.5～2.5BV/h，得到的滤液即为除去色素和蛋白的蛹虫草多糖滤液。本发明所述纯化工艺不仅可以快速地同时脱色和去除蛋白，其脱色率为85.94%，蛋白去除率为70.05%，多糖保留率为78.92%；而且处理后，蛹虫草多糖样品中多糖并未发生任何结构改变，其抗氧化作用显著高于传统的处理方法，同时对巨噬细胞均无细胞毒性，安全性高。此外，本发明所述纯化工艺过程简单，成本低廉，且采用的吸附剂安全、环保，适用于工业化批量纯化生产。

Description

一种蛹虫草粗多糖一步法脱色与除蛋白的纯化工艺
技术领域
本发明涉及蛹虫草有效成分分离提纯领域，更具体地，涉及一种蛹虫草粗多糖一步法脱色与除蛋白的纯化工艺。
背景技术
蛹虫草(Cordyceps militarisLink.)，又名北冬虫夏草、北虫草、蚕蛹虫草、东北虫草等，与冬虫夏草同属异种，由中华虫草菌寄生在鳞翅目蝙蝠蛾等昆虫上所形成子座（即草部分）与菌核（即昆虫的尸体部分）二部分的复合体。蛹虫草的主要功能成分有多糖、核苷类化合物、蛋白质等，其次它还含有虫草酸（甘露醇）、SOD酶、氨基酸、维生素及多种微量元素等，因此具有独特的药理和保健效果，是民间普遍的滋补保健食品和营养品。其中，蛹虫草多糖（CMP）作为蛹虫草中主要的生物活性成分之一，在调节免疫、抗炎症、抗氧化、抗肿瘤等方面有显著功效。为了进一步研究蛹虫草多糖（CMP）的构效关系，其分离纯化是必不可少的关键性步骤。
然而，制备蛹虫草粗多糖（CMP）的过程中会有大量色素和游离蛋白等杂质伴随多糖共同沉淀，此类杂质会严重影响进一步的结构解析与生物活性研究。为去除色素和游离蛋白等杂质，有大量文献报道的传统脱色方法有活性炭吸附法和过氧化氢氧化法，去除游离蛋白的方法有Sevage法和三氯乙酸法。
然而，这些传统方法有诸多劣势，例如有机试剂残留，工序繁琐耗时以及多糖损失率大等缺点。因此，建立一种快速高效的一步去除色素和游离蛋白的方法至关重要。
发明内容
本发明的目的在于提供一种蛹虫草粗多糖一步法脱色与除蛋白的纯化工艺。本发明所述纯化工艺不仅可以快速地同时脱色和除出蛋白，而且不影响蛹虫草多糖结构的变化，提高蛹虫草多糖提取液的抗氧化作用，且同时安全性高。
本发明的上述目的是通过以下方案予以实现的：
一种蛹虫草粗多糖一步法脱色与除蛋白的纯化工艺，包括如下过程：
S1. 制备蛹虫草粗多糖样品；
S2. 利用强极性大孔吸附树脂制备层析柱；
S3. 蛹虫草粗多糖纯化：将蛹虫草粗多糖样品稀释为浓度0.01mg/mL～5mg/mL，然后过层析柱，控制样品流速为0.5～2.5BV/h，收集得到的滤液即为除去色素和蛋白质的蛹虫草多糖滤液。
经过静态吸附时间的测试，样品在层析柱中的保留时间为100～140min时，脱色率和蛋白质去除率较好，最佳的保留时间是120min；但是在层析柱中，由于样品在层析柱中流动，样品在流动的过程中接触了新的强极性大孔吸附树脂，不同于静态吸附过程中，因此，采用层析柱纯化过程中，以样品的流速作为评价指标，当样品的流速为0.5～2.5BV/h时，样品在柱层析中的保留时间在20～120min时，即可保证脱色率和蛋白质去除率较好。
优选地，所述步骤S1的过程为：将蛹虫草粉碎并过60～100目筛；用无水乙醇浸泡12～48h，并保留滤渣；然后将滤渣加水，加热至70～90℃提取，再将提取液离心、浓缩、醇沉，并将沉淀离心、无水乙醇洗涤，得到蛹虫草粗多糖样品；
步骤S2的过程为：将强极性大孔吸附树脂采用稀酸和稀碱浸泡处理后水洗至中性，并用质量分数超过95%的乙醇浸泡，再水洗干净，干燥后装柱制得层析柱；
其中，所述强极性大孔吸附树脂的表面积为250～290 m2/g，平均孔径为155～165 nm。
大孔吸附树脂作为一种高效的吸附剂，常用于多酚、黄酮及色素的富集纯化，其吸附原理主要依赖于树脂表面离子和氢键相互作用，属于物理吸附方式，因此不会产生化学试剂残留，且简单高效。本发明依据蛹虫草粗多糖样品的性质，采用强极性的大孔吸附树脂进行处理，可同时高效率地去除样品中的色素和蛋白质，而且不会残留化学试剂，最后分离得到的蛹虫草多糖滤液中多糖结构未发生变化，且蛹虫草多糖滤液的抗氧化作用更好。
在样品流速确定的情况下，为了保证高的脱色率和蛋白质去除率，可以通过控制层析柱的长度来控制样品在强极性的大孔吸附树脂中的保留时间，进而达到最佳的纯化效果。
优选地，所述强极性大孔吸附树脂为NKA-9大孔吸附树脂；其粒径直径为0.3～1.25mm。通过对多种大孔吸附树脂的研究发现，不同的大孔吸附树脂对于蛹虫草粗多糖样品中色素具有较好的去除效果，但是对蛋白质的去除效果则存在明显的差异；其中，在同等条件下，NKA-9大孔吸附树脂的脱蛋白率显著高于其他大孔吸附树脂，且NKA-9大孔吸附树脂的选择性系数（K）为最高，表明NKA-9大孔吸附树脂具有很强的选择性吸附蛹虫草粗多糖样品中色素和游离蛋白质的能力。
优选地，步骤S1中蛹虫草粉碎后过60目筛；无水乙醇的浸泡时间为24h；加水提取的加热温度为90℃；所述醇沉采用的是质量分数在95%以上的乙醇溶液。其中先采用无水乙醇浸泡蛹虫草粉末，其目的是提前去除小分子及脂溶性成分，以尽量减少提取的蛹虫草多糖滤液中的脂溶性等杂质。
优选地，步骤S2的具体过程为：强极性大孔吸附树脂先采用稀酸溶液浸泡，然后水洗至中性，再用稀碱浸泡，然后水洗至中性；或者先用稀碱溶液浸泡，水洗至中性，再用稀酸浸泡，然后水洗至中性；最后再用质量分数超过95%的乙醇浸泡，再水洗干净，干燥后装柱。
优选地，步骤S2中的稀酸为质量分数为5%的盐酸溶液；所述稀碱为质量分数为3%的氢氧化钠溶液。
优选地，步骤S3中所述蛹虫草粗多糖样品稀释为浓度2.5 mg/mL；样品流速为2BV/h，样品在柱层析中的保留时间在30min。
优选地，所述样品的pH值为6～7；所述步骤S3的整个过程中，样品和强极性大孔吸附树脂的温度为25℃～40℃。
优选地，所述样品的pH值为6.5；所述步骤S3的整个过程中，样品和强极性大孔吸附树脂的温度为25℃。
优选地，步骤S3中当强极性大孔吸附树脂中残留有蛹虫草粗多糖样品，则可以采用水洗的方式收集蛹虫草多糖。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明所述纯化工艺不仅可以快速地同时脱色和除出蛋白，其中脱色率为85.94%，蛋白去除率为70.05%，多糖保留率为78.92%；而且处理前后，蛹虫草多糖样品中多糖并未发生任何结构改变，且处理后得到的蛹虫草多糖滤液的抗氧化作用显著高于传统的处理方法，同时对巨噬细胞均无细胞毒性，安全性高。此外，本发明所述纯化工艺过程简单，成本低廉，且采用的处理液安全、环保，适用于工业化批量纯化生产。
附图说明
图1为吸附时间对脱色率和蛋白质去除率的影响结果。
图2为样品pH值对脱色率和蛋白质去除率的影响结果。
图3为温度对脱色率和蛋白质去除率的影响结果。
图4为样品浓度对脱色率和蛋白质去除率的影响结果。
图5为样品流速对脱色率和蛋白质去除率的影响结果。
图6为不同纯化处理方法对CMP的结构的影响。
图7为不同纯化处理方法对CMP的功能的影响。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。
以下试验所采用的材料与试剂为：蛹虫草子实体购买于广东江门鸿豪生物公司；大孔树脂(D101, HP-20, LSA-21, D3520, AB-8, X-5, HPD400, HPD600, NKA-Ⅱ, andNKA-9)购于陕西乐博生物公司；小鼠单核巨噬细胞RAW264.7购于中国科学院上海细胞库；其它常规试剂均为分析纯。
所采用的仪器与设备为：RV8型旋转蒸发仪，德国IKA公司；UV-4802S型紫外可见分光光度计，美国尤尼柯公司制造；数显恒温水浴锅HH-2，江苏常州国华电器有限公司制造；Eppendorf离心机5810R，德国Eppendorf公司制造；精密pH计PHS-3C，上海精密科学仪器有限公司制造；全波长酶标仪，美国伯腾仪器有限公司制造。LC-2030 HPLC，RID-20A，日本岛津制造；TSKgel G4000PWXL column (7.8×300mm)，日本Tosoh（东曹）制造。
以下所有实验重复三次进行，结果以平均值±标准差（SD）表示。 使用SPSS 22软件（IBM）通过单向方差分析（ANOVA）程序进行多个样品的比较。 如果p<0.05，则差异被认为是统计学显著。
实施例1静态吸附实验
（1）蛹虫草粗多糖准备：将蛹虫草粉碎并过60目筛，然后将蛹虫草粉末浸泡于无水乙醇中24h以除去小分子及脂溶性成分，过滤得到滤渣；然后将滤渣超声辅助热水（90℃）提取并重复2次，将混合物5000rpm离心10min，合并上清液55℃减压浓缩至原体积的十分之一，随后在搅拌过程中加入4倍体积的95%乙醇，4℃条件下过夜醇沉，然后8000rpm离心10min得到深棕色沉淀，并将其用无水乙醇洗涤两次。随后沉淀用蒸馏水复溶后透析(3500 Da)48h，最终冻干得到蛹虫草粗多糖（CMP溶液），备用；
（2）强极性大孔吸附树脂前处理：本试验所用的各类大孔树脂的物理化学性质列举于表1。精确称量5.0g树脂，质量分数为5%HCl溶液浸泡处理4h后水洗至中性，然后再用质量分数为3%NaOH溶液浸泡处理4h，然后水洗至中性；或者将稀酸与稀碱的顺序调换；最后将强极性大孔吸附树脂浸泡于95%乙醇中去除残留的有机试剂，最终用蒸馏水洗至无醇味且不显浑浊为止，抽干备用；
静态吸附试验过程：将预处理的干燥树脂（5.0g）放入100mL锥形瓶中，加入50mLCMP溶液（10g/L）。将锥形瓶在恒温振荡器上以150rpm，25℃下振荡12h。随后抽滤得滤液，检测并计算不同树脂的脱色率、脱蛋白率以及多糖保留率。
引入选择性系数（K）作为10种不同树脂综合评价的总分，根据它们的比例和选择性系数筛选出最佳吸附效果的树脂，计算公式如下：
脱色率= ×100%；
脱蛋白率= ×100%；
多糖保留率= ×100%；
选择性系数(K) = 0.3a + 0.3b + 0.4c；
其中，A0和A1分别是在树脂吸附之前和之后样品在447nm处的吸光度；C0和C1分别是树脂吸附前后溶液中蛋白质浓度（μg/mL）；P1和P0分别为树脂吸附前后490 nm处硫酸苯酚法显色后样品溶液的吸光度；a，b，c分别表示脱色率，蛋白去除率和多糖保留率，选择性系数的选用参考文献“龙眼多糖树脂脱色除蛋白工艺优化”（蓝海波，热带作物学报）。
10种不同树脂对CMP溶液中色素及游离蛋白和多糖的吸附性能测试结果见表1所示。
表1 十种树脂的理化性质以及对脱色率、脱蛋白和多糖回收率的选择特性
从表1中可知，所有测试树脂对样品中色素有很大的吸附作用，多糖的回收率相对较高。其中，NKA-9大孔吸附树脂的脱蛋白率显着高于其他9种树脂（p≤0.05）。引入选择性系数（K）以直观地评估10种测试树脂的总体吸附性能。其中NKA-9大孔吸附树脂在10种树脂中选择性系数（K）为最高，表明NKA-9大孔吸附树脂具有很强的选择性吸附粗多糖中色素和游离蛋白质的能力，且有较高的多糖保留率。因此，NKA-9大孔吸附树脂作为进一步研究的最佳吸附树脂。
实施例2 探究最佳参数和条件
参照实施例1中的实验过程，探究样品浓度、样品pH、吸附时间和样品温度对NKA-9大孔吸附树脂脱色率和蛋白质去除率结果的影响。
（1）吸附时间的影响
吸附时间对脱色率和蛋白质去除率的影响结果如图1所示。
从图1其中可知，NKA-9大孔吸附树脂的吸附色素和蛋白质过程显示出三个阶段。首先，蛋白质的吸附能力在前40min呈现快速增加的趋势，然后在40～120min内缓慢增加，最后在120min左右达到平衡。但在120min之前，色素的吸附能力始终出现持续稳定上升趋势。此外，多糖回收率随着吸附时间的增加而缓慢下降在最初100min，当120min达到平稳。同时，以选择性系数进行综合评估，K值是处于缓慢增长的趋势，当120min时出现相对稳定并达到最大值。因此，选择吸附时间为120min作为后续实验的最佳吸附时间。
（2）样品pH的影响
样品pH对脱色率和蛋白质去除率的影响结果如图2所示。
pH值在4～9之间时，蛋白质去除率并不随着样品pH值变化而明显变化，样品pH值对蛋白质去除率的影响很弱，几乎无影响。
而样品pH值在4～7之间时，脱色率几乎无变化，但当样品pH值当过7时，则脱色率有明天下降。
样品pH值在4～6之间时，多糖回收率随着样品pH值的增加而增加；当样品pH值在6～9之间时，多糖回收率几乎无变化。
从上述结果中可知，当样品为中性时，脱色率、蛋白质去除率和多糖回收率均较好。因此选在样品pH在6～7之间进行进一步的测试，具体选择样品pH值为6.5进行进一步的测试。
（3）样品温度的影响
样品温度对脱色率和蛋白质去除率的影响结果如图3所示。
测试温度为25℃～40℃，从图3中可知，当随着温度变化是，脱色率、蛋白质去除率和多糖回收率并没有明显的变化，即温度几乎不影响脱色率和蛋白质去除率。
（4）吸附时间的影响
吸附时间对脱色率和蛋白质去除率的影响结果如图4所示。
从图4中可知，随着初始多糖浓度的增加，脱色率和脱蛋白率下降，而多糖的回收率从66.55%增加到78.64%。初始多糖浓度下NKA-9树脂的选择性系数（K）表现出先增加后降低，达到2.5 mg/mL时的最大值。综合考虑以上三个指标，2.5 mg/mL为适合吸附试验的样品浓度。
实施例3 动态吸附试验
CMP溶液和NKA-9大孔吸附树脂的制备参照实施例1中的进行制备。
动态吸附试验过程：将处理好的NKA-9大孔吸附树脂装柱制成层析柱（26×500mm），然后将制备得到的CMP溶液稀释后过层析柱，若有需要，可采用纯水为洗脱液。
在CMP溶液样品过层析柱的过程中，改变样品的流速，测试样品的流速对脱色率和蛋白去除率的影响。
通过NKA-9大孔吸附树脂的动态泄漏曲线计算样品溶液的处理量和流速。如图5所示，当流速较快时，导致脱色率和蛋白质去除率较低。因此，在最低流速（0.5BV/h）下获得最佳吸附性能。尽管如此，吸附量在0.5和2.0 BV/h之间没有显着差异（p>0.05）。考虑到较低的流速大大降低了纯化效率，选择2.0 BV/h作为进一步实验的最适样品流速。在此条件下，当蛹虫草多糖溶液的上样体积达到5BV时，脱色和脱蛋白率显着降低。因此，在以下实验中CMP溶液的处理体积大约为4BV。
实施例4 与传统方法的比较
传统的脱色方法为过氧化氢处理方法和活性炭处理方法；传统的去除蛋白质方法为Sevage试剂处理和三氯乙酸处理。
其中过氧化氢处理方法为：首先用氨水将pH值调至8.0，然后将50mLCMP和5mL30%H2O2于锥形瓶中混合均匀，将其置于55℃条件下30min。 将反应后的样品溶液以6000rpm离心15 min以除去不溶性杂质。
活性炭处理方法为：将50mL的蛹虫草多糖溶液和0.5g干燥的活性炭在50mL离心管中混合，其在55℃下以110rpm振荡30 min。反应后的混合物以5000rpm离心10 min以除去残留的活性碳和不溶性杂质。并使用上述的计算公式计算脱色和多糖回收率。
Sevage试剂处理过程为：Sevage试剂由氯仿和正丁醇以5:1的比例组成，蛹虫草多糖溶液用Sevage试剂处理，以4:1的样品：试剂比例混合并剧烈震荡去除游离蛋白。重复该脱蛋白过程7次直到无白色变性蛋白产生为止。
三氯乙酸处理过程为：用10%TCA溶液将CMP溶液调节至pH=3，然后在4℃保持过夜。将样品以5000rpm离心10min，收集上清液以得到脱蛋白的溶液。将该脱蛋白过程重复两次，最后用5%NaOH溶液将pH调节至中性。类似地，使用上述计算公式计算脱蛋白和多糖回收率。
（1）不同方法的纯化效率
采用传统的处理方法与本发明所述纯化工艺进行比较，测得结果如表2所示。
表2不同纯化方法对CMP的脱色率、脱蛋白率和回收率的影响
从表2中可知，活性炭处理比NKA-9大孔吸附树脂和过氧化氢处理具有更高的脱色率，但是其多糖回收率较差，在去除色素的同时，也丢失了大部分的多糖。虽然Sevage试剂处理法的多糖回收率与NKA-9大孔吸附树脂相当，但是其蛋白质去除率却明显较低，且耗费的时间明显较长；而三氯乙酸处理法则蛋白质去除率和多糖回收率均明显低于NKA-9大孔吸附树脂，且耗费的时间最长。
通过上述的结果可知，本发明所述纯化工艺，采用NKA-9大孔吸附树脂进行处理，在脱色率、蛋白质去除率和多糖回收率方面都明显优于传统的处理方法。
（2）不同方法对多糖结构的影响
为验证不同方法处理前后多糖的结构是否发生变化，分别用紫外可见光谱，红外光谱和高效液相色谱对不同方法处理前后的CMP溶液样品进行了检测分析比对，并对脱色前后CMP溶液的颜色用数码相机进行了拍照比对。其中，检测分子量所用液相条件为：流动相0.02MKH2PO4溶液，流速0.6mL/min，柱温箱温度35℃，进样体积20μL。
脱色方法以过氧化氢处理为对照例，蛋白质去除率以Sevage试剂处理为对照例。
检测的结果如图6所示。
图6A展现了NKA-9大孔吸附树脂吸附前后以及过氧化氢处理的多糖溶液的表观视觉对比图片，其中a为处理前的CMP溶液样品，b为经NKA-9大孔吸附树脂处理后的CMP溶液样品，c为过氧化氢处理后的CMP溶液样品。从图6A的对比中，可明显观察到经NKA-9大孔吸附树脂处理黄褐色的CMP溶液变成澄清透明的，表明大部分色素已被去除，其颜色与过氧化氢处理后的CMP溶液样品几乎无区别。
如图6B所示，NKA-9大孔吸附树脂吸附过的多糖样品在300～800nm范围内的吸光度几乎消失，表明大部分色素和蛋白质被NKA-9大孔吸附树脂吸附，但经Sevage试剂处理后样品在300nm出吸光度，表明经过7次脱除后仍然会有少量蛋白残留。
如图6C所示，分别为蛹虫草粗多糖的4000～500cm-1区域记录的FT-IR光谱。傅立叶变换红外光谱在3343.13cm-1（3500-3100 cm-1）范围内表现出较宽的吸收峰，这可能归因于氢键作用下多糖和水分的羟基伸缩振动以及O-H伸缩振动。在2937.19cm-1区域（3000-2800cm-1）处的弱吸收峰是甲基的C-H伸缩振动的特征，并且在1632.84cm-1处的强吸收是由于C=O伸缩振动引起的。在1403.43cm-1附近的峰代表C-H变形振动。在800-1200cm-1处的信号可以被定义为碳水化合物的指纹区域，其中在1147.24,1077.72和1048.61cm-1处的谱带是吡喃糖环的特征吸收。在843.72cm-1,803.43cm-1处的典型峰归因于存在α-型糖苷键。从以上分析可以看出，树脂吸附法和传统方式纯化得到的多糖都无明显改变其化学结构或使其变性。
如图6D所示，分别对比了用NKA-9大孔吸附树脂吸附前后，以及用传统的两步法处理后CMP的分子量变化情况。结果表明，树脂吸附前后其CMP的保留时间没有变化，均在17.7min左右出峰，表明在吸附过程中没有发生CMP的降解。然而，传统方法处理后30.72min出产生新的峰，表明CMP部分降解为分子量小的多糖组分（分子量大的多糖先出峰，保留时间短）。可见，本发明所述纯化方法不会导致CMP的降解。
（3）不同方法纯化后的CMP溶液样品的抗氧化活性的效果
检测CMP对羟基自由基，ABTS清除活性和Fe还原力的清除作用，检测方法参考文献Antioxidant and Antibacterial Evaluation of Polysaccharides SequentiallyExtracted from Onion (Allium Cepa L.). Int. J. Biol. Macromol.2018, 111, 92–101.Ma, Y. L.; Zhu, D. Y.; Thakur, K.; Wang, C. H.; Wang, H.; Ren, Y. F.;Zhang, J. G.; Wei, Z. J. 。
以未纯化的CMP溶液、经NKA-9大孔吸附树脂纯化过的CMP溶液样品（CMP-N），和由过氧化氢处理和Sevage试剂处理结合处理的CMP溶液样品（CMP-SH）为测试对象。
测试结果如图7所示。
CMP-N在相同的浓度水平下具有比CMP-SH更高的抗氧化活性，如图7A，7B和7C所示。在羟基自由基（图7A）和ABTS清除活性（图7B）的结果中，CMP和CMP-N之间的抗氧化活性没有显着差异，并且其与多糖的浓度呈正相关。CMP-SH方法中，当多糖浓度在0.0～5.0 mg/mL范围内时，其羟基自由基和ABTS的清除能力明显降低（p<0.05）。另外，当多糖浓度达到5mg/mL时，CMP，CMP-N和CMP-SH的羟自由基清除活性分别为94.46%，92.44%和41.17%。以上结果表明CMP-SH的处理方法对CMP的抗氧化活性造成了很大的损害。如图7C所示，还原力的结果也验证了传统方法使抗氧化活性降低。随着浓度的增加，CMP，CMP-N和CMP-SH的还原能力从0.0 mg/mL增加到5.0 mg/mL，还原力保持相同的增长速度，在浓度达到1.0 mg/mL之前没有明显增加。随后CMP和CMP-N在浓度为高于1.0 mg/mL比CMP-SH具有更高的吸光度（在5mg/mL时约为0.81和0.79），但低于阳性对照组VC。以上结果表明CMP-N的抗氧化活性显着高于CMP-SH的抗氧化活性。换言之，通过NKA-9大孔吸附树脂纯化的CMP保留了比传统方法更好的抗氧化活性。
（4）不同方法纯化后的CMP溶液样品的细胞毒性测定
所用细胞微小鼠单核巨噬细胞RAW264.7细胞系，于含有10%（v/v）的FBS、100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素的DMEM完全培养基中，37℃下在潮湿的5%CO2培养箱中传代培养。细胞生长至70%-80%进行传代，1-2天更换培养液。以上均为无菌操作。MTT法检测RAW264.7细胞毒性：将RAW264.7细胞（5×103个细胞/孔）在96孔微孔板中培养过夜，细胞贴壁后用一系列浓度（12.5-500μg/mL）和LPS（2μg/ mL，阳性对照）加样继续培养24小时，并使用等体积的培养基作为有细胞无样品对照组、无细胞的空白组。孵育后，每孔加入10μL浓度为5mg/mL的MTT溶液。再孵育4小时，弃去上清液，通过加入100mL二甲基亚砜（DMSO）溶解生成的甲瓒晶体。摇动平板并在黑暗中放置10 min。使用酶标仪测量570nm处的吸光度。细胞活力计算为样品和有细胞无样品对照组之间吸光度值的比率。通过使用以下等式计算细胞相对活性：
细胞活力= 样品OD-空白OD/对照OD-空白OD×100%
CMP，CMP-N和CMP-SH对RAW 264.7细胞的细胞毒性作用结果显示在图7D中，用浓度在62.5和500μg/ mL之间的不同样品处理24h后，当多糖浓度低于125μg/ mL时，与空白对照组相比，活细胞数量无显著性差异。然而，当浓度超过125μg/ mL时开始发生剂量依赖性毒性抑制，这与多糖本身的生物活性相关。树脂吸附法和传统方法在低于125μg/ mL的适宜浓度下均未显示出细胞毒性，同浓度下对比不同处理方式存活细胞的数量，说明这两种脱色和脱蛋白方法对巨噬细胞无显著性损伤。因此，通过这种树脂吸附方法纯化的CMP的纯组分可以用于进一步的免疫活性研究或其它实验。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，对于本领域的普通技术人员来说，在上述说明及思路的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种蛹虫草粗多糖一步法脱色与除蛋白的纯化工艺，其特征在于，包括如下过程：
S1. 制备蛹虫草粗多糖样品；
S2. 利用强极性大孔吸附树脂制备层析柱；
S3. 蛹虫草粗多糖纯化：将蛹虫草粗多糖样品稀释为浓度0.01mg/mL～5mg/mL，然后过层析柱，控制样品流速为0.5～2.5BV/h，收集得到的滤液即为除去色素和蛋白质的蛹虫草多糖滤液。
2.根据权利要求1所述蛹虫草粗多糖一步法脱色与除蛋白的纯化工艺，其特征在于，所述步骤S1的过程为：将蛹虫草粉碎并过60～100目筛；用无水乙醇浸泡12～48h，并保留滤渣；然后将滤渣加水，加热至70～90℃提取，再将提取液离心、浓缩、醇沉，并将沉淀离心、无水乙醇洗涤，得到蛹虫草粗多糖样品；
步骤S2的过程为：将强极性大孔吸附树脂分别采用稀酸和稀碱浸泡处理后水洗至中性，并用质量分数超过95%的乙醇浸泡，再水洗干净，干燥后装柱制得层析柱；
其中，所述强极性大孔吸附树脂的表面积为250～290m2/g，平均孔径为155～165nm。
3.根据权利要求2所述蛹虫草粗多糖一步法脱色与除蛋白的纯化工艺，其特征在于，所述强极性大孔吸附树脂为NKA-9大孔吸附树脂。
4.根据权利要求2所述蛹虫草粗多糖一步法脱色与除蛋白的纯化工艺，其特征在于，步骤S1中蛹虫草粉碎后过60目筛；无水乙醇的浸泡时间为24h；加水提取的加热温度为90℃；所述醇沉采用的是质量分数在95%以上的乙醇溶液。
5.根据权利要求2所述蛹虫草粗多糖一步法脱色与除蛋白的纯化工艺，其特征在于，步骤S2的具体过程为：强极性大孔吸附树脂先采用稀酸溶液浸泡，然后水洗至中性，再用稀碱浸泡，然后水洗至中性；或者先用稀碱溶液浸泡，水洗至中性，再用稀酸浸泡，然后水洗至中性；最后再用质量分数超过95%的乙醇浸泡，再水洗干净，干燥后装柱。
6.根据权利要求5所述蛹虫草粗多糖一步法脱色与除蛋白的纯化工艺，其特征在于，步骤S2中的稀酸为质量分数为5%的盐酸溶液；所述稀碱为质量分数为3%的氢氧化钠溶液。
7. 根据权利要求2所述蛹虫草粗多糖一步法脱色与除蛋白的纯化工艺，其特征在于，步骤S3中所述蛹虫草粗多糖样品稀释为浓度2.5 mg/mL；样品流速为2BV/h。
8.根据权利要求2所述蛹虫草粗多糖一步法脱色与除蛋白的纯化工艺，其特征在于，所述样品的pH值为6～7；所述步骤S3的整个过程中，样品和强极性大孔吸附树脂的温度为25℃～40℃。
9.根据权利要求8所述蛹虫草粗多糖一步法脱色与除蛋白的纯化工艺，其特征在于，所述样品的pH值为6.5；所述步骤S3的整个过程中，样品和强极性大孔吸附树脂的温度为25℃。
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