CN117304362A - 一种能够促进t细胞增值的甘草多糖制备工艺 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种能够促进T细胞增值的甘草多糖制备工艺，通过对甘草多糖进行提取，使用活性炭和改性吸附树脂进行纯化，再进一步采用DEAE‑52阴离子交换纤维素柱、中空纤维膜和Sephadex G‑100吸附除杂，得到能够促进T细胞增值的甘草多糖。与现有技术相比，本发明的甘草多糖制备工艺可以去除甘草多糖中的色素和蛋白质等杂质，保留甘草多糖的含量和活性，提高甘草多糖的纯度，得到的甘草多糖具有促进T细胞增值的效果。
Description
技术领域
本发明涉及医药技术领域，尤其涉及一种能够促进T细胞增值的甘草多糖制备工艺。
背景技术
目前已知的一些能够促进T细胞增值的甘草多糖制备工艺包括：超声辅助提取，使用超声波技术辅助提取甘草多糖，可以提高提取效率和速度。超声波能够破坏细胞结构，促进甘草多糖的释放。酶解法，采用特定的酶（如纤维素酶、蛋白酶等）对甘草进行酶解，使甘草多糖从细胞壁中释放出来。酶解法可以提高甘草多糖的提取率和纯度。离子交换法，使用离子交换树脂进行甘草多糖的纯化。离子交换树脂可以根据甘草多糖与树脂的亲和性选择性地吸附和洗脱目标产物，从而实现纯化。凝胶过滤色谱法，利用凝胶过滤色谱技术（如Sephadex G-100等）对甘草多糖进行分离和纯化。凝胶过滤色谱法可以根据甘草多糖的分子大小和形态进行分离，得到目标产物。超滤法，通过使用合适的分子量截留膜对甘草多糖进行超滤，去除较小分子的杂质，从而提高甘草多糖的纯度。
离子交换法是一种常用的分离和纯化技术，广泛应用于生物制药、食品工业、环境分析等领域。它基于离子交换树脂对物质中的离子或分子的吸附和洗脱作用，实现了目标物质的选择性分离和纯化。离子交换树脂是一种具有固定离子基团的多孔聚合物材料。它可以在水溶液中与带电离子或具有离子性的分子发生相互作用。离子交换法的工作过程如下：将待处理的混合溶液通过装有离子交换树脂的柱子或床层，目标离子或分子会与离子交换树脂上的离子基团发生吸附作用。洗脱，通过改变溶液的性质，例如通过调整溶液的pH值、离子强度或使用特定的洗脱剂，可以破坏目标物质与离子交换树脂的吸附作用，使其从树脂上洗脱下来。洗脱出的目标物质即为纯化后的产物。具有选择性强、应用广泛、可调控性强的优点。
但是，离子交换法在实际应用中需要考虑离子交换树脂的选择、操作条件的优化以及洗脱产物的后续处理等因素，以达到预期的纯化效果。
中国发明授权专利CN109988795B公开了一种甘草多糖的分离纯化工艺，包括以下步骤：(1)将甘草切成片；(2)将甘草片加水浸泡；(3)弃掉浸泡液，再加入甘草片重量2~4倍的水，重复提取2~4次，减压浓缩；(4)加体积分数92~97％乙醇，静置4~12h，离心，过滤，干燥得到初提取物；向初提取物中加体积分数92~97％乙醇浸泡2~6h，离心，过滤，干燥，重复2~4次，得到甘草多糖。该发明甘草多糖的分离纯化工艺，对甘草进行冷冻，并进行超声酶解，破坏甘草的细胞壁以利于甘草多糖的浸出，再经发酵工艺，后续分离纯化，提取工艺简单易行，甘草多糖的得率与含量较高，得到甘草多糖的活性较高，蛋白质残余率低，甘草多糖的纯度高，具有调节机体免疫功能、抗疲劳的作用。但是该发明甘草多糖的分离纯化工艺对蛋白质脱除率和多糖保留率均存在不足。
发明内容
有鉴于现有技术中甘草多糖的分离纯化工艺中蛋白质脱除率和多糖保留率低的缺点，本发明所要解决的技术问题是提供一种蛋白质脱除率和多糖保留率高的能够促进T细胞增值的甘草多糖制备工艺。
为了实现上述发明目的，本发明采用了如下的技术方案：
一种能够促进T细胞增值的甘草多糖制备工艺如下，以重量份计：
Z1、称取4~6份甘草多糖沉淀，加水配制为甘草多糖溶液，加热煮沸5~15min溶解，加入1~3wt%活性炭，继续煮沸5~15min，以吸附色素，先离心，取上清液，再离心，收集上清液，上清液用改性吸附树脂进行柱层析纯化，收集流出液，用100~300目滤布过滤，得到脱色和脱蛋白的甘草多糖溶液；
Z2、将步骤Z1制备的甘草多糖溶液加至DEAE-52阴离子交换纤维素柱床中，用超纯水洗脱甘草多糖，收集洗脱液，绘制DEAE-52阴离子交换纤维素洗脱曲线，收集洗脱峰，得到甘草多糖洗脱溶液；采用中空纤维膜除去甘草多糖洗脱溶液中的小分子杂质，得到除去小分子杂质的甘草多糖溶液；将除去小分子杂质的甘草多糖溶液旋蒸浓缩至1~3mg/mL，加至Sephadex G-100葡聚糖凝胶柱床中，以超纯水洗脱，收集洗脱液，绘制Sephadex G-100葡聚糖凝胶柱洗脱曲线，收集吸收峰，冷冻干燥后得到能够促进T细胞增值的甘草多糖。
优选的，所述步骤Z1中加水配制为8~12mg/mL甘草多糖溶液。
优选的，所述步骤Z1中先3000~5000rpm离心10~30min，取上清液，再10000~12000rpm离心10~20min。
优选的，所述步骤Z1中柱层析纯化参数为采用径高比为1：5~20，流速为1~3BV/h，进行动态吸附10~30min。
所述甘草多糖沉淀的制备方法如下，以重量份计：
步骤1、称取8~12份甘草粉，加入水，于30~40℃超声，过滤后收集滤液和滤渣；
步骤2、将步骤1中的滤渣加入水，在沸水浴中回流1~3h，然后过滤，收集滤液，并与步骤1中所得滤液合并，然后离心分离，取上层清液；
步骤3、将步骤2制备的上层清液浓缩至1/5~1/10，然后加入3~5倍体积的无水乙醇，密封后放入-1~-10℃静置20~30h，析出甘草多糖沉淀。
优选的，所述步骤1和步骤2中均按1：20~30的质量比例加入水。
优选的，所述步骤1中超声时间为40~60min，超声功率为200~400W、超声频率为20~60kHz。
所述改性吸附树脂的制备方法如下：
将氨基树脂与乙二醛搅拌混合，再加入氰基磷酸二乙酯在80~120℃下加热20~40min，得到螯合树脂；加入环烷酸铜、水和大孔吸附树脂，置于振动台上，在25~40℃下振荡，过滤，收集固体，并用水冲洗，得到改性吸附树脂。
优选的，所述改性吸附树脂的制备方法如下，以重量份计：
将18~22份氨基树脂与8~12份乙二醛以100~300rpm搅拌混合1~3h，再加入2~4份氰基磷酸二乙酯在80~120℃下加热20~40min，得到螯合树脂；加入10~20份环烷酸铜、500~700份水和30~50份大孔吸附树脂，置于振动台上，在25~40℃下200~300rpm振荡0.5~2h，用50~300目布过滤，收集固体，并用水冲洗，得到改性吸附树脂。
甘草多糖是从甘草根部提取得到的一类多糖类化合物。甘草是一种传统草药，在中医药中被广泛应用，并且在许多国家的食品和药品中也有重要的地位。甘草多糖具有多种生物活性和药理作用，其中包括免疫调节作用、抗炎作用、抗氧化作用、抗肿瘤作用。此外，甘草多糖还具有抗溃疡、抗病毒、抗过敏、降血糖等多种药理作用。
本发明通过添加改性吸附树脂，可以有效吸附和去除甘草多糖溶液中的蛋白质，改性吸附树脂具有特定的表面性质和亲和力，可以选择性地吸附蛋白质分子，从而提高蛋白质的脱除率。这有助于净化甘草多糖溶液，去除其中的蛋白质杂质，提高甘草多糖的纯度。改性吸附树脂还具有良好的多糖保留性能。在制备甘草多糖溶液的过程中，改性吸附树脂可以选择性地吸附其他小分子杂质，如色素和低分子量化合物，而对甘草多糖具有较低的吸附能力。这样可以增加甘草多糖在纯化过程中的保留率，避免其损失，保持其活性和功能性。
改性吸附树脂通过表面性质调控，引入特定的功能官能团（如氨基、磷酸酯等），调控树脂表面的亲和性和电荷性质。这些功能官能团可以与目标分子（如蛋白质）之间发生吸附作用，通过静电相互作用、氢键和范德华力等作用力，实现选择性吸附和去除。改性吸附树脂具有一定的孔径和孔隙结构，可以通过尺寸排除效应选择性地吸附分子。较大的分子（如多糖）由于其分子尺寸较大，往往无法进入树脂孔隙，从而被有效保留。而较小的分子（如蛋白质）则可以进入孔隙并被吸附，实现分离和纯化。改性吸附树脂中的功能官能团可以与目标分子之间发生特异性的亲和作用。例如，某些改性吸附树脂具有亲和色谱柱中的配体基团，可以与特定的蛋白质结构域或功能基团发生选择性的结合。这种亲和作用可以实现对特定蛋白质的高效吸附和分离。综上所述，通过改性吸附树脂的引入，可以调控其表面性质和孔隙结构，实现对蛋白质和多糖的选择性吸附和分离，提高蛋白质脱除率和多糖保留率。这些效果主要通过表面性质调控、尺寸排除效应和亲和吸附效应等机制实现。并且使用改性吸附树脂的方法进行脱蛋白和脱色不会破坏多糖结构。
与现有技术相比，本发明的有益效果：
本发明通过使用活性炭和改性吸附树脂，可以去除甘草多糖中的色素和蛋白质等杂质，保留甘草多糖的含量和活性，提高甘草多糖的纯度。
本发明使用DEAE-52阴离子交换纤维素柱和中空纤维膜可以去除甘草多糖溶液中的小分子杂质，进一步提高甘草多糖的纯度。
本发明使用Sephadex G-100葡聚糖凝胶柱可以实现对甘草多糖的精细分离，根据洗脱曲线收集吸收峰，从而得到目标甘草多糖。
本发明经过上述纯化步骤得到的甘草多糖具有促进T细胞增值的效果，可能具有一定的免疫调节和免疫增强作用。
附图说明
图1为测试例1中蛋白质标准曲线。
图2为测试例2中葡萄糖标准曲线。
具体实施方式
主要物质来源：
氨基树脂：广州领地新材料有限公司，型号：CYMEL 303LF。
大孔吸附树脂：天津波鸿树脂科技有限公司，货号：BH4006。
甘草粉：西安恩肽元生物科技有限公司，货号：ety114。
活性炭：山东慕森炭业有限公司，粒度：200~325目，货号：粉末4。
实施例1
一种能够促进T细胞增值的甘草多糖制备工艺如下：
Z1、称取5g甘草多糖沉淀，加水配制为10mg/mL甘草多糖溶液，加热煮沸10min溶解，加入2wt%活性炭，继续煮沸10min，以吸附色素，先4000rpm离心20min，取上清液，再11000rpm离心15min，收集上清液，上清液用改性吸附树脂进行柱层析纯化，树脂柱径高比为1：10，流速为2BV/h，进行动态吸附20min，收集流出液，用200目滤布过滤，得到脱色和脱蛋白的甘草多糖溶液；
Z2、将步骤Z1制备的甘草多糖溶液加至DEAE-52阴离子交换纤维素柱床中，用超纯水洗脱甘草多糖，收集洗脱液，绘制DEAE-52阴离子交换纤维素洗脱曲线，收集洗脱峰，得到甘草多糖洗脱溶液；采用中空纤维膜除去甘草多糖洗脱溶液中的小分子杂质，得到除去小分子杂质的甘草多糖溶液；将除去小分子杂质的甘草多糖溶液旋蒸浓缩至2mg/mL，加至Sephadex G-100葡聚糖凝胶柱床中，以超纯水洗脱，收集洗脱液，绘制Sephadex G-100葡聚糖凝胶柱洗脱曲线，收集吸收峰，冷冻干燥后得到能够促进T细胞增值的甘草多糖。
所述甘草多糖沉淀的制备方法如下：
步骤1、称取10g甘草粉，按1：25的质量比例加入水，于35℃超声50min，超声功率为300W、超声频率为40kHz，过滤后收集滤液和滤渣；
步骤2、将步骤1中的滤渣按1：25的质量比例加入水，在沸水浴中回流1.5h，然后过滤，收集滤液，并与步骤1中所得滤液合并，然后离心分离，取上层清液；
步骤3、将步骤2制备的上层清液浓缩至1/8，然后加入4倍体积的无水乙醇，密封后放入-4℃静置24h，析出甘草多糖沉淀。
所述改性吸附树脂的制备方法如下：
将20g氨基树脂与10g乙二醛以200rpm搅拌混合2h，再加入3g氰基磷酸二乙酯在100℃下加热30min，得到螯合树脂；加入15g环烷酸铜、600g水和40g大孔吸附树脂，置于振动台上，在30℃下240rpm振荡1h，用100目布过滤，收集固体，并用水冲洗，得到改性吸附树脂。
对比例1
一种能够促进T细胞增值的甘草多糖制备工艺与实施例1基本相同，唯一区别仅仅在于：所述改性吸附树脂的制备方法不同。
所述改性吸附树脂的制备方法如下：
将20g氨基树脂与10g乙醛以200rpm搅拌混合2h，再加入3g氰基磷酸二乙酯在100℃下加热30min，得到螯合树脂；加入15g环烷酸铜、600g水和40g大孔吸附树脂，置于振动台上，在30℃下240rpm振荡1h，用100目布过滤，收集固体，并用水冲洗，得到改性吸附树脂。
对比例2
一种能够促进T细胞增值的甘草多糖制备工艺与实施例1基本相同，唯一区别仅仅在于：所述改性吸附树脂的制备方法不同。
所述改性吸附树脂的制备方法如下：
将20g氨基树脂与10g乙二醛以200rpm搅拌混合2h，再加入3g磷酸二乙酯在100℃下加热30min，得到螯合树脂；加入15g环烷酸铜、600g水和40g大孔吸附树脂，置于振动台上，在30℃下240rpm振荡1h，用100目布过滤，收集固体，并用水冲洗，得到改性吸附树脂。
对比例3
一种能够促进T细胞增值的甘草多糖制备工艺与实施例1基本相同，唯一区别仅仅在于：所述改性吸附树脂的制备方法不同。
所述改性吸附树脂的制备方法如下：
将20g氨基树脂与10g乙二醛以200rpm搅拌混合2h，再加入3g氰基磷酸二乙酯在100℃下加热30min，得到螯合树脂；加入15g硫酸锌、600g水和40g大孔吸附树脂，置于振动台上，在30℃下240rpm振荡1h，用100目布过滤，收集固体，并用水冲洗，得到改性吸附树脂。
对比例4
一种能够促进T细胞增值的甘草多糖制备工艺与实施例1基本相同，唯一区别仅仅在于：所述改性吸附树脂的制备方法不同。
所述改性吸附树脂的制备方法如下：
将20g氨基树脂与10g乙醛以200rpm搅拌混合2h，再加入3g磷酸二乙酯在100℃下加热30min，得到螯合树脂；加入15g硫酸锌、600g水和40g大孔吸附树脂，置于振动台上，在30℃下240rpm振荡1h，用100目布过滤，收集固体，并用水冲洗，得到改性吸附树脂。
测试例1
蛋白质脱除率测试
精密称取牛血清白蛋白10.00mg，置于10 mL容量瓶中，配制成为1 mg/mL牛血清白蛋白标准溶液。将上述标准溶液梯度稀释至0.01mg/mL、0.025 mg/mL、0.05 mg/mL、0.1 mg/mL、0.15 mg/mL、0.2 mg/mL。取1 mL 5×考马斯亮蓝染色液，加入4 mL超纯水，配制成1×G250考马斯亮蓝染色液。分别量取上述系列蛋白质标准溶液各20μL于96孔板中，加入200μL1×考马斯亮蓝染液，静置反应3 min，应用酶标仪于595nm测定吸光度，以蛋白质浓度为横坐标，吸光度为纵坐标绘制蛋白质标准曲线，如图1所示。
在0.01 mg/mL~0.20 mg/mL内蛋白质浓度与吸光度的回归方程为：Y=0.8965x+0.5322，相关系数R2=0.9991。将本发明纯化前后制备的甘草多糖加水配置成10mg/mL的甘草多糖溶液进行蛋白质测试。
Y1(%)=（N0-N1）/N0×100
式中：Y1为蛋白质脱除率，单位为%；
N0为纯化前蛋白质的含量，单位为mg；
N1为纯化后蛋白质的含量，单位为mg。
每组测试三次，取平均值，测试结果见表1。
表1：蛋白质脱除率测试结果
测试例2
多糖保留率测定
采用苯酚-硫酸法测多糖含量。精密称取100.00 mg烘干至恒重的无水葡萄糖，置于容量瓶中，用超纯水溶解并定容至100 mL，配制成1 mg/mL的葡萄糖标准品溶液，将其梯度稀释至0.04、0.06、0.08、0.10、0.12、0.16 mg/mL，分别量取1 mL各梯度浓度的葡萄糖溶液于10 mL棕色容量瓶中，加入1 mL 5 %苯酚溶液，摇匀，迅速加入5 mL浓硫酸，摇匀后室温放置30 min，用超纯水定容至10 mL，冰水浴冷却至室温，采用紫外分光光度计于490nm测吸光度，以葡萄糖浓度为横坐标，吸光度为纵坐标绘制葡萄糖标准曲线，如图2所示。
在0.04 mg/mL~0.16 mg/mL内葡萄糖浓度与吸光度的回归方程为：y=4.3371x+0.0127，相关系数R2=0.9990。结果表明，所建立的甘草多糖含量测定方法在规定浓度范围内线性关系良好。
多糖的含量测定采用苯酚-硫酸法进行。用移液枪吸取本发明制备的10mg甘草多糖溶液容至100mL的容量瓶中，加入5%苯酚溶液200μL，摇匀后快速加入98%浓硫酸1mL，摇匀，静置5min，在37℃的水浴上加热30min，室温冷却，在488nm波长下测定吸光度。根据公式计算甘草多糖得率。
多糖保留率=纯化前多糖浓度/纯化后多糖浓度×100%
每组测试三次，取平均值，测试结果见表2。
表2：多糖保留率测试结果
从测试例1、2的结果可以看出，本发明实施例1制备的甘草多糖具有较高的蛋白质脱除率和多糖保留率。其中实施例1与对比例1相比，可能原因在于本发明中采用乙二醛具有更多的反应位点，能够提供更多的功能官能团，与树脂上的氨基基团发生反应，形成更多的亲和键。这增加了改性吸附树脂表面的亲和性，提高了对蛋白质的选择性吸附能力，从而改善蛋白质的脱除率。并且增加了树脂孔隙的稳定性和尺寸分布的均匀性。这样可以提高改性吸附树脂的分离效果，增加多糖在纯化过程中的保留率。
实施例1与对比例2相比，可能原因在于本发明中采用氰基磷酸二乙酯制备改性吸附树脂相比采用磷酸二乙酯引入的氰基官能团具有更强的亲和性，可以与蛋白质分子形成更稳定的亲和键。可以调控树脂表面的亲和性和电荷性质。这些官能团与目标分子（如蛋白质）之间发生吸附作用，通过静电相互作用、氢键和范德华力等作用力，实现选择性吸附和去除。
实施例1与对比例3相比，可能原因在于使用环烷酸铜改性吸附树脂可能对蛋白质有更强的选择性吸附能力。这意味着吸附树脂更容易吸附蛋白质分子，可以与蛋白质分子形成更强的相互作用，而较少吸附多糖分子。相比之下，硫酸锌可能在吸附过程中对蛋白质和多糖的选择性吸附能力较弱。
Claims (9)
1.一种能够促进T细胞增值的甘草多糖制备工艺，其特征在于，工艺如下，以重量份计：
Z1、称取4~6份甘草多糖沉淀，加水配制为甘草多糖溶液，加热煮沸5~15min溶解，加入1~3wt%活性炭，继续煮沸5~15min，以吸附色素，先离心，取上清液，再离心，收集上清液，上清液用改性吸附树脂进行柱层析纯化，收集流出液，用100~300目滤布过滤，得到脱色和脱蛋白的甘草多糖溶液；
Z2、将步骤Z1制备的甘草多糖溶液加至DEAE-52阴离子交换纤维素柱床中，用超纯水洗脱甘草多糖，收集洗脱液，绘制DEAE-52阴离子交换纤维素洗脱曲线，收集洗脱峰，得到甘草多糖洗脱溶液；采用中空纤维膜除去甘草多糖洗脱溶液中的小分子杂质，得到除去小分子杂质的甘草多糖溶液；将除去小分子杂质的甘草多糖溶液旋蒸浓缩至1~3mg/mL，加至Sephadex G-100葡聚糖凝胶柱床中，以超纯水洗脱，收集洗脱液，绘制Sephadex G-100葡聚糖凝胶柱洗脱曲线，收集吸收峰，冷冻干燥后得到能够促进T细胞增值的甘草多糖；
所述改性吸附树脂的制备方法如下：
将氨基树脂与乙二醛搅拌混合，再加入氰基磷酸二乙酯在80~120℃下加热20~40min，得到螯合树脂；加入环烷酸铜、水和大孔吸附树脂，置于振动台上，在25~40℃下振荡，过滤，收集固体，并用水冲洗，得到改性吸附树脂。
2.如权利要求1所述的一种能够促进T细胞增值的甘草多糖制备工艺，其特征在于，所述步骤Z1中加水配制为8~12mg/mL甘草多糖溶液。
3.如权利要求1所述的一种能够促进T细胞增值的甘草多糖制备工艺，其特征在于，所述步骤Z1中先3000~5000rpm离心10~30min，取上清液，再10000~12000rpm离心10~20min。
4.如权利要求1所述的一种能够促进T细胞增值的甘草多糖制备工艺，其特征在于，所述步骤Z1中柱层析纯化参数为采用径高比为1：5~20，流速为1~3BV/h，进行动态吸附10~30min。
5.如权利要求1所述的一种能够促进T细胞增值的甘草多糖制备工艺，其特征在于，所述甘草多糖沉淀的制备方法如下，以重量份计：
步骤1、称取8~12份甘草粉，加入水，于30~40℃超声，过滤后收集滤液和滤渣；
步骤2、将步骤1中的滤渣加入水，在沸水浴中回流1~3h，然后过滤，收集滤液，并与步骤1中所得滤液合并，然后离心分离，取上层清液；
步骤3、将步骤2制备的上层清液浓缩至1/5~1/10，然后加入3~5倍体积的无水乙醇，密封后放入-1~-10℃静置20~30h，析出甘草多糖沉淀。
6.如权利要求5所述的一种能够促进T细胞增值的甘草多糖制备工艺，其特征在于，所述步骤1和步骤2中均按1：20~30的质量比例加入水。
7.如权利要求5所述的一种能够促进T细胞增值的甘草多糖制备工艺，其特征在于，所述步骤1中超声时间为40~60min，超声功率为200~400W、超声频率为20~60kHz。
8.如权利要求1所述的一种能够促进T细胞增值的甘草多糖制备工艺，其特征在于，所述改性吸附树脂的制备方法如下，以重量份计：
将18~22份氨基树脂与8~12份乙二醛以100~300rpm搅拌混合1~3h，再加入2~4份氰基磷酸二乙酯在80~120℃下加热20~40min，得到螯合树脂；加入10~20份环烷酸铜、500~700份水和30~50份大孔吸附树脂，置于振动台上，在25~40℃下200~300rpm振荡0.5~2h，用50~300目布过滤，收集固体，并用水冲洗，得到改性吸附树脂。
9.一种能够促进T细胞增值的甘草多糖，其特征在于，采用如权利要求1~8任一项所述的制备工艺制备而成。
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2023
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