CN113321697B - 大曲蛋白脱色及提取方法 - Google Patents

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Abstract

本申请公开了一种大曲脱色方法，包括混合大曲成分溶液及脱色剂，以及去除脱色剂。本申请公开了一种大曲蛋白提取，包括脱色，尤其是包括本申请公开的大曲脱色方法。本申请的方法具有设计合理、易操作、杂质少等优点，为大曲蛋白的研究提供便利，解决了现有技术中的问题。

Description

大曲蛋白脱色及提取方法
技术领域
本发明属于蛋白质提取技术领域，具体涉及酱香型高温大曲蛋白提取方法。
背景技术
酱香型高温大曲作为酱香型白酒的起子，大曲主要起繁殖酿酒微生物、积累酶源、提高物质积累的作用，在制酒过程中起到糖化发酵剂、生香剂的作用，是制酒的重要原料。因此大曲的质量直接关系着酒的品质和风格。
大曲具有复杂的微生物组成，不同微生物来源的酶具有不同的酶学性质，运用宏蛋白质组学技术从蛋白质水平上揭示大曲等复杂样品的微生物组成及功能是酿酒微生物研究的新趋势。由于酱香型大曲发酵环境为高温环境，为美拉德反应提供了条件，高温大曲中含氨基的化合物和含羰基的化合物之间经缩合、聚合而生成大量类黑素物质，因此酱香型高温大曲中既包含复杂酶类同时包含多种影响酶类分析的杂质。而大曲色素是干扰大曲纯化、定量分析的重要影响因素，严重影响大曲宏蛋白质组研究。当前，针对酱香型大曲蛋白制备尤其是有效去除色素的参考方法较少，因此酱香型高温大曲宏蛋白组学研究需建立一种可排除类黑素物质影响且制备良好的酱香型高温大曲蛋白提取方法。
发明内容
为解决上述问题，本发明提供一种酱香型高温大曲蛋白提取方法，本发明的酱香型高温大曲提取方法具有设计合理、易操作、杂质少等优点，为酱香型高温大曲蛋白的研究提供便利，解决了现有技术中的问题。
在一些实施方式中，本申请提供一种大曲脱色方法，包括混合大曲成分溶液及脱色剂，以及去除混合后的脱色剂。
在一些实施方式中，混合为在30-37℃下混合。在一些实施方式中，脱色剂包括大孔吸附树脂。在一些实施方式中，混合中大曲成分溶液及脱色剂的比例为1:1至1:2之间。在一些实施方式中，混合包括振荡。在一些实施方式中，在混合之后、在去除之前，更包括静置。在一些实施方式中，去除为过滤或去除脱色剂。在一些实施方式中，大孔吸附树脂的平均孔径为100至1000nm之间。在一些实施方式中，振荡为振荡30–60min。在一些实施方式中，静置为静置30–60min。在一些实施方式中，离心为8000–10000r/min离心。
在一些实施方式中，本申请提供一种大曲蛋白提取方法，包括脱色。在一些实施方式中，脱色为使用本申请的一些实施例中提供的大曲脱色方法脱色。在一些实施方式中，大曲蛋白提取方法包括：浸提大曲，得到大曲成分溶液；脱色大曲成分溶液，得到脱色大曲成分溶液；提取脱色大曲成分溶液，得到大曲提取物；以及洗脱大曲提取物，并收集洗脱后的大曲提取物中的大曲蛋白。
在一些实施方式中，大曲选自拆仓黑曲、拆仓白曲、黄曲及生产使用大曲中的至少一种。在一些实施方式中，浸提包括将每10g大曲加入30mL乙酸盐缓冲液及30μL苯甲基磺酰氟溶液，混合均匀，以及离心，取上清液，得到大曲成分溶液。在一些实施方式中，提取包括将脱色大曲成分溶液加入TCA-丙酮溶液，在-20℃下静置2小时以上，4℃条件下离心，得到第一沉淀物，将第一沉淀物加入丙酮溶液，在-20℃下静置1小时以上，加入丙酮溶液，在-20℃下静置1小时以上，加入丙酮溶液，在-20℃下静置1小时以上，得到第二沉淀物，将第二沉淀物加入蛋白裂解液，并加入Tris-饱和酚试剂，混合均匀，4℃条件下离心，取酚层，将酚层加入乙酸铵甲醇溶液，在-20℃下静置8小时以上，4℃条件下离心，得到大曲提取物。在一些实施方式中，洗脱包括：将大曲提取物溶解于缓冲液中，得到大曲提取物溶液，将大曲提取物溶液过脱盐柱洗脱，收集蛋白峰，得到大曲蛋白。
在一些实施方式中，在浸提中，离心为500g、4℃条件下离心5分钟以上以及10000g、4℃条件下离心15分钟以上。在一些实施方式中，在浸提中，乙酸盐缓冲液为0.1M的pH 4.6乙酸-乙酸钠缓冲液。在一些实施方式中，在浸提中，苯甲基磺酞氟溶液浓度为100mM。在一些实施方式中，浸提温度为4-8℃，浸提时间为4-6小时。在一些实施方式中，在提取中，离心为4℃、12000r/min条件下离心15min。在一些实施方式中，在提取中，每10mL的脱色大曲成分溶液，加入的丙酮溶液为10mL、加入的蛋白裂解液为5mL。在一些实施方式中，在提取中，乙酸铵甲醇溶液加入的量为酚层的4倍。在一些实施方式中，在提取中，TCA-丙酮溶液、丙酮溶液、乙酸铵甲醇溶液中还包括0.02M二硫苏糖醇试剂。在一些实施方式中，在提取中，蛋白裂解液包括7M尿素、2％SDS、100mM DTT、20mM Tris-HCl。在一些实施方式中，在洗脱之前更包括过0.22μm滤膜。在一些实施方式中，在洗脱中，大曲提取物溶液过脱盐柱的流速为2mL/min，磷酸缓冲液的浓度为10mM。
在一些实施方式中，本申请提供了本申请的大曲脱色方法或大曲蛋白提取方法在酱香型高温大曲蛋白提取中的应用。
在一些实施方式中，本申请提供了本申请的大曲蛋白提取方法提取出的大曲蛋白。
本发明与现有技术相比具有以下优点：
目前对于酱香型高温大曲的蛋白提取不包括脱色这一步骤，现有的技术手段主要是通过选择合适的缓冲液以及蛋白沉淀试剂来减少色素的含量。大孔吸附树脂常用于物质的纯化，在脱色方面常见于植物以及多糖的色素脱除，在大曲脱色方面并未涉及。
在一些实施方式中，大孔吸附树脂具有较大的比表面积和非极性吸附性质，与酱香型高温大曲浸提液中分子较大的非极性色素成分相适应，因此可有效去除酱香型高温大曲浸提液中的色素杂质，从而减少酱香型高温大曲蛋白中色素杂质。
在一些实施方式中，本申请的方法通过改良大孔吸附树脂在高温大曲脱色反应中的使用方法，操作更为简单便捷，脱色效果显著。
在一些实施方式中，利用脱盐柱对酱香型高温大曲蛋白进行处理，可去除产品中盐分，确保产品纯度。
附图说明
图1是本发明实施例1、实施例2、实施例3及实施例4制备的酱香型高温大曲蛋白SDS-PAGE图谱。
图2是实施例5和实施例6所提取酱香型高温大曲蛋白SDS-PAGE图谱。
具体实施方式
为更进一步阐述本申请为了达成预定目的所采取的技术手段及功效，以下结合附图及较佳实施例，对依据本申请的具体实施方式、结构、特征及其功效，详细说明如下。
在一些实施方式中，提供了一种酱香型高温大曲蛋白提取方法，包括以下步骤：
(1)酱香型高温大曲浸提液制备：称取10g酱香型高温大曲曲粉，加入30mL乙酸-乙酸钠缓冲液、30μL苯甲基磺酰氟(PMSF)溶液，振荡混匀后浸提，然后采用差速离心先在500g、4℃条件下离心5min去除大颗粒杂质，后在10000g、4℃条件下离心15min，取上清即为酱香型高温大曲浸提液；
(2)浸提液脱色：脱色剂与大曲浸提液混合均匀后，经过脱色反应，离心去除大孔吸附树脂得脱色高温大曲浸提液；
(3)TCA-丙酮与Tris-饱和酚结合提取：取10mL脱色高温大曲浸提液，加入40mL-20℃预冷的TCA-丙酮溶液，静置于-20℃冰箱中2h，4℃，12000r/min条件下离心15min，弃上清，保存沉淀1；沉淀1加入10mL-20℃预冷的丙酮溶液，静置于-20℃冰箱中1h，重复3次得沉淀2；沉淀2中加入5mL蛋白裂解液溶解，溶解液中加入等体积Tris-饱和酚试剂振荡混匀，4℃，12000r/min条件下离心，取酚层；在酚层中加入4倍体积乙酸铵甲醇溶液，-20℃放置过夜，4℃，12000r/min条件下离心15min，取沉淀3；
(4)大曲蛋白脱盐：沉淀3溶解于5mL 10mM磷酸缓冲液中，溶解液过脱盐柱，流速为2mL/min，10mM磷酸缓冲液洗脱，收集蛋白峰得酱香型高温大曲蛋白液；
(5)冷冻干燥：酱香型高温大曲蛋白液置于液氮中冻成固态后置于冷冻干燥机进行冻干得到酱香型高温大曲蛋白粉。
在一些实施方式中，所述步骤(1)中，乙酸-乙酸钠缓冲液浓度为0.1M、pH为4.6。在一些实施方式中，所述步骤(1)中PMSF溶液浓度为100mM。在一些实施方式中，所述步骤(1)中浸提条件为浸提温度为4-8℃，浸提时间为4-6h。优选地，浸提温度为4℃，浸提时间为4-6h。更优选地，若所述大曲为拆仓黑曲或拆仓白曲，浸提条件为4℃，浸提时间6h；若所述大曲为黄曲或生产使用大曲，浸提条件为4℃，浸提时间4h。
在一些实施方式中，所述的步骤(2)脱色剂为大孔吸附树脂；优选地，为苯乙烯型非极性共聚体，粒径范围为0.3-1.25mm。在一些实施方式中，大孔吸附树脂的平均孔径为100至1000nm之间。在一些实施方式中，所述的步骤(2)所述脱色剂与大曲浸提液的固液比(g/mL)为1:1-1:2。优选地，为1:1。在一些实施方式中，所述的步骤(2)所述脱色反应大孔吸附树脂与大曲浸提液反应脱色条件为30-37℃，混匀后静置30-60min。优选地，大曲浸提液脱色条件为37℃，混匀后静置30min。在一些实施方式中，所述的步骤(2)所述脱色反应后离心条件为8000-10000r/min，优选地，为8000r/min。
在一些实施方式中，所述步骤(3)中，在TCA-丙酮溶液、丙酮溶液、乙酸铵甲醇溶液中均加入二硫苏糖醇(DTT)试剂，浓度为0.02M。在一些实施方式中，所述步骤(3)中蛋白裂解液配方为7M尿素、2％SDS、100mM DTT、20mM Tris-HCl。
在一些实施方式中，所述步骤(4)中，沉淀溶解后先过0.22μm滤膜再过脱盐柱。
在一些实施方式中，所述步骤(5)中，利用冷冻干燥机进行蛋白液冻干时，蛋白液完全冻成固体。
下列实施例1–6中的大孔吸附树脂采用D101型号为例，但不限于此。
实施例1
实施例1的酱香型高温大曲蛋白提取方法，具体按照以下步骤进行：
(1)酱香型高温大曲浸提液制备：称取10g生产用曲曲粉，加入pH 4.6、0.1M乙酸-乙酸钠缓冲液30mL、100mM/L PMSF溶液30μL，振荡混匀于4℃条件下浸提4h，然后采用差速离心先在500g、4℃条件下离心5min去除大颗粒杂质，后在10000g、4℃条件下离心15min，取上清即为大曲浸提液；
(2)浸提液脱色反应：将大孔吸附树脂D101与大曲浸提液按1:1固液比(g/mL)混合均匀，在37℃条件下振荡30min，过滤去除大孔吸附树脂得脱色高温大曲浸提液；
(3)TCA-丙酮与Tris-饱和酚结合提取：取10mL脱色高温大曲浸提液，加入40mL-20℃预冷的TCA-丙酮溶液，静置于-20℃冰箱中2h，4℃，12000r/min条件下离心15min，弃上清，保存沉淀1；
沉淀1加入10mL-20℃预冷的丙酮溶液，静置于-20℃冰箱中1h，重复3次得沉淀2；
沉淀2中加入5mL蛋白裂解液(7M尿素、2％SDS、100mM DTT、20mM Tris-HCl)溶解，溶解液中加入等体积Tris-饱和酚试剂振荡混匀，4℃，12000r/min条件下离心，取酚层；
在酚层中加入4倍体积乙酸铵甲醇溶液，-20℃放置过夜，4℃，12000r/min条件下离心15min，取沉淀3；
(4)大曲蛋白脱盐：沉淀3溶解于5mL 10mM磷酸缓冲液中，溶解液经0.22μm滤膜过滤后过脱盐柱，流速为2mL/min，10mM磷酸缓冲液洗脱，收集蛋白峰得酱香型高温大曲蛋白液；
(5)冷冻干燥：酱香型高温大曲蛋白液置于液氮中冻成固态后置于冷冻干燥机进行冻干得到酱香型高温大曲蛋白粉。
实施例2
实施例2的酱香型高温大曲蛋白提取同实施例1，其区别在于：
所述步骤(1)中称取10g白曲曲粉，加入pH 4.6、0.1M乙酸-乙酸钠缓冲液30mL、100mM/L PMSF溶液30μL，振荡混匀于4℃条件下浸提6h，然后采用差速离心先在500g、4℃条件下离心5min去除大颗粒杂质，后在10000g、4℃条件下离心15min，取上清即为生产用曲浸提液。
实施例3
实施例3的酱香型高温大曲蛋白提取同实施例1，其区别在于：
所述步骤(1)中称取10g黑曲曲粉，加入pH 4.6、0.1M乙酸-乙酸钠缓冲液30mL、100mM/L PMSF溶液30μL，振荡混匀于4℃条件下浸提6h，然后采用差速离心先在500g、4℃条件下离心5min去除大颗粒杂质，后在10000g、4℃条件下离心15min，取上清即为生产用曲浸提液。
实施例4
实施例4的酱香型高温大曲蛋白提取同实施例1，其区别在于：
所述步骤(1)中称取10g生产用曲曲粉，加入pH 4.6、0.1M乙酸-乙酸钠缓冲液30mL、100mM/L PMSF溶液30μL，振荡混匀于4℃条件下浸提4h，然后采用差速离心先在500g、4℃条件下离心5min去除大颗粒杂质，后在10000g、4℃条件下离心15min，取上清即为生产用曲浸提液。
实施例5不同脱色剂效果比较
(1)称取10g生产用曲曲粉，加入pH 4.6、0.1M乙酸-乙酸钠缓冲液30mL、100mM/LPMSF溶液30μL，振荡混匀于4℃条件下浸提过夜，然后用4层纱布过滤，滤液离心20min，取上清即为大曲浸提液；
(2)浸提液分别做以下脱色反应：a.将活性炭与大曲浸提液按1:1固液比(g/mL)混合均匀，在37℃条件下振荡30min，过滤去除活性炭得脱色高温大曲浸提液；b:大曲浸提液加入至截留分子量为14000的透析袋中，在4℃条件下透析24h，透析后浸提液即为脱色高温大曲浸提液；c:不经过脱色处理。
(3)TCA-丙酮与Tris-饱和酚结合提取：取10mL脱色高温大曲浸提液，加入40mL-20℃预冷的TCA-丙酮溶液，静置于-20℃冰箱中2h，4℃，12000r/min条件下离心15min，弃上清，保存沉淀1；
沉淀1加入10mL-20℃预冷的丙酮溶液，静置于-20℃冰箱中1h，重复3次得沉淀2；
沉淀2中加入5mL蛋白裂解液(7M尿素、2％SDS、100mM DTT、20mM Tris-HCl)溶解，溶解液中加入等体积Tris-饱和酚试剂振荡混匀，4℃，12000r/min条件下离心，取酚层；
在酚层中加入4倍体积乙酸铵甲醇溶液，-20℃放置过夜，4℃，12000r/min条件下离心15min，取沉淀3；
(4)大曲蛋白脱盐：沉淀3溶解于5mL 10mM磷酸缓冲液中，溶解液经0.22μm滤膜过滤后过脱盐柱，流速为2mL/min，10mM磷酸缓冲液洗脱，收集蛋白峰得酱香型高温大曲蛋白液；
(5)冷冻干燥：酱香型高温大曲蛋白液置于液氮中冻成固态后置于冷冻干燥机进行冻干得到酱香型高温大曲蛋白粉。
实施例6
采用文献报道Tris-丙酮-酚改良法提取酱香型大曲蛋白质效果比较，具体步骤如下：
(1)称取10g生产用曲曲粉，加入pH 4.6、0.1M乙酸-乙酸钠缓冲液30mL、100mM/LPMSF溶液30μL，振荡混匀于4℃条件下浸提过夜，然后用4层纱布过滤，滤液离心20min，取上清即为大曲浸提液；
(2)浸提液分别做以下处理。a.不经过脱色处理；b:将活性炭与大曲浸提液按1:1固液比(g/mL)混合均匀，在37℃条件下振荡30min，过滤去除活性炭得脱色高温大曲浸提液；c:或大曲浸提液加入至截留分子量为14000的透析袋中，在4℃条件下透析24h，透析后浸提液即为脱色高温大曲浸提液；d:将大孔吸附树脂D101与大曲浸提液按1:1固液比(g/mL)混合均匀，在37℃条件下振荡30min，过滤离心去除大孔吸附树脂得脱色高温大曲浸提液；
(3)TCA-丙酮与Tris-饱和酚结合提取：取10mL高温大曲浸提液，加入40mL-20℃预冷的TCA-丙酮溶液，静置于-20℃冰箱中2h，4℃，12000r/min条件下离心15min，弃上清，保存沉淀1；
沉淀1加入10mL-20℃预冷的丙酮溶液，静置于-20℃冰箱中1h，重复3次得沉淀2；
沉淀2中加入5mL蛋白裂解液(7M尿素、2％SDS、100mM DTT、20mM Tris-HCl)溶解，溶解液中加入等体积Tris-饱和酚试剂振荡混匀，4℃，12000r/min条件下离心，取酚层；
在酚层中加入4倍体积乙酸铵甲醇溶液，-20℃放置过夜，4℃，12000r/min条件下离心15min，取沉淀3；
在沉淀3中加入10mL甲醇，振荡清洗5min，离心10min，收取沉淀4；
在沉淀4中加入10mL丙酮清洗，使丙酮完全挥发，沉淀即为高温大曲宏蛋白质样品。
将上述纯化得到的大曲蛋白用7M尿素溶解后电泳，电泳条件为120V恒压电泳90min，获得SDS-PAGE图，具体如图1及图2。
图1中，M为Marker；1为实施例1未经步骤(2)脱色处理的图谱；2为实施例2未经步骤(2)脱色处理的图谱；3为实施例3未经步骤(2)脱色处理的图谱；4为实施例4未经步骤(2)脱色处理的图谱；5为实施例1图谱；6为实施例2图谱；7为实施例3图谱；8为实施例4图谱。图1中1-4泳道背景色深，尤其是3、4泳道难以辨析到清晰条带，表明所提取蛋白质量不高包含大量的色素类杂质，对后期进行大曲宏蛋白组的研究将产生影响。从5-8泳道可以看出，经过步骤(2)大孔吸附树脂脱色处理的泳道背景色明显变浅，且可见较为清晰的条带，提取的蛋白质量得到提升。
图2中，M为Marker；1为实施例6未经脱色处理所提蛋白图谱；2为实施例6经活性炭脱色处理所提蛋白图谱；3为实施例6经透析袋脱色处理所提蛋白图谱；4是实施例6经大孔吸附树脂脱色处理所提蛋白图谱；5是实施例5经活性炭脱色处理所提蛋白图谱；6是实施例5经透析袋脱色处理所提蛋白图谱；7是实施例5未经脱色处理所提蛋白图谱。图2中1-4泳道背景色深，且无清晰条带，表明采用文献报道Tris-丙酮-酚改良法提取的酱香型高温大曲蛋白包含大量色素类杂质，且蛋白损失量大，不符合宏蛋白组蛋白制备要求。图2中5-7泳道可看出，泳道背景深，难以辨认到清晰条带，表明采用本发明方法但改变脱色剂所提取蛋白包含大量色素类杂质，对后期大曲宏蛋白组的研究将产生较大影响。
上述实施方式仅为本申请的优选实施方式，不能以此来限定本申请保护的范围，本领域的技术人员在本申请的基础上所做的任何非实质性的变化及替换均属于本申请所要求保护的范围。

Claims (6)

1.一种大曲蛋白提取方法，其特征在于，所述方法包括：
浸提大曲，得到大曲成分溶液；
脱色所述大曲成分溶液，得到脱色大曲成分溶液，包括：
混合大曲成分溶液及脱色剂；以及
去除所述混合后的所述脱色剂；
提取所述脱色大曲成分溶液，得到大曲提取物；以及
洗脱所述大曲提取物，并收集所述洗脱后的所述大曲提取物中的大曲蛋白，
其中，所述脱色剂包括大孔吸附树脂。
2.如权利要求1所述的大曲蛋白提取方法，其特征在于，
所述混合为在30-37°C下混合；且／或
所述混合中，所述大曲成分溶液及所述脱色剂的比例为1 : 1至1 : 2之间；且／或
所述混合包括振荡；且／或
在所述混合之后、在所述去除之前，还包括静置；且／或
所述去除为过滤所述脱色剂。
3.如权利要求2所述的大曲蛋白提取方法，其特征在于，
所述大孔吸附树脂的平均孔径为100至1000 nm之间；且／或
所述振荡为振荡30 – 60 min；且／或
所述静置为静置30 – 60 min；且／或
所述去除包括离心，所述离心为8000 – 10000 r/min离心。
4.如权利要求1所述的大曲蛋白提取方法，其特征在于，
所述大曲选自拆仓黑曲、拆仓白曲、及黄曲中的至少一种；且／或
所述浸提包括：
将每10 g大曲加入30 mL乙酸盐缓冲液及30 µL苯甲基磺酰氟溶液，混合均匀；以及
离心，取上清液，得到所述大曲成分溶液；且／或
所述提取包括：
将所述脱色大曲成分溶液加入TCA-丙酮溶液，在−20 °C下静置2小时以上，4 °C条件下离心，得到第一沉淀物；
将所述第一沉淀物加入丙酮溶液并在−20 °C下静置1小时以上，重复三次，得到第二沉淀物；
将所述第二沉淀物加入蛋白裂解液，并加入Tris-饱和酚试剂，混合均匀，4 °C条件下离心，取酚层；以及
将所述酚层加入乙酸铵甲醇溶液，在−20 °C下静置8小时以上，4 °C条件下离心，得到所述大曲提取物；且／或
所述洗脱包括：
将所述大曲提取物溶解于缓冲液中，得到大曲提取物溶液；以及
将所述大曲提取物溶液过脱盐柱洗脱，收集蛋白峰，得到所述大曲蛋白。
5.如权利要求4所述的大曲蛋白提取方法，其特征在于，
所述浸提中，
所述离心为500 g、4 °C条件下离心5分钟以上之后10000 g、4 °C条件下离心15分钟以上；且／或
所述乙酸盐缓冲液为0.1 M的pH 4.6乙酸-乙酸钠缓冲液；且／或
所述苯甲基磺酞氟溶液浓度为100 mM；且／或
所述浸提温度为4-8°C，浸提时间为4-6小时；且／或
所述提取中，
所述离心为4 °C、12000 r/min条件下离心15 min；且／或
每10 mL的所述脱色大曲成分溶液，加入的所述丙酮溶液为10 mL、加入的蛋白裂解液为5 mL；且／或
所述乙酸铵甲醇溶液加入的量为所述酚层的4倍；且／或
所述TCA-丙酮溶液、丙酮溶液、乙酸铵甲醇溶液中还包括0.02 M二硫苏糖醇试剂；且／或
所述蛋白裂解液包括7 M尿素、2% SDS、100 mM DTT、20 mM Tris-HCl；且／或
所述洗脱中，
在所述洗脱之前还包括过0.22 μm滤膜；且／或
所述的所述大曲提取物溶液过所述脱盐柱的流速为2 mL/min，所述缓冲液为磷酸缓冲液，且所述磷酸缓冲液的浓度为10 mM。
6.如权利要求1至5任一所述的大曲蛋白提取方法在酱香型高温大曲蛋白提取中的应用。
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